Ce protocole modulaire permet d’explorer de multiples événements moléculaires rendus par des lipides structurels et de signalisation, et/ou des ARN, dans des régions tissulaires discrètes et dans le sang avec une sortie de données quantitatives et qualitatives améliorée par échantillon. La méthode est applicable à tout modèle expérimental et peut également être appliquée à des échantillons de tissus humains et à du sang. Claudia Schwitter, technicienne, Julia Post, étudiante diplômée, et Raissa Lerner, postdoctorante de mon groupe, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, prenez des cerveaux précédemment isolés, entiers et congelés de souris atteintes d’épilepsie aiguë et traitée de manière prophylactique induite par l’acide kaïnique. Montez les cerveaux sur le système de montage du cryostat. Réglez l’épaisseur à 50 micromètres et découpez le cerveau en mode de coupe près de la région d’intérêt.
Lorsque vous approchez de la région d’intérêt, réglez l’épaisseur sur 18 à 20 micromètres. Pour localiser la sous-région d’intérêt, colorez les tranches de cerveau à l’aide de bleu de toluidine. Utilisez un microscope pour inspecter les tranches tachées afin d’identifier les régions d’intérêt à poinçonner, et utilisez un atlas de souris comme référence pour trouver les régions anatomiques cérébrales appropriées.
Utilisez des carottes d’échantillon pour prélever des poinçons de 0,8 à 1,0 millimètre de diamètre. Transférer les poinçons pour les coextractions d’endocannabinoïdes et d’eicosanoïdes dans des tubes ambrés pré-refroidis de 2 millilitres avec sept billes d’acier pré-refroidies par tube. Pour la coextraction des phospholipides et des endocannabinoïdes, la co-extraction double des lipides et de l’ARN, transférez les poinçons dans des tubes d’extraction sans RNase de 2 millilitres avec des billes de céramique.
Peser les poinçons congelés dans la chambre froide et procéder immédiatement à l’extraction ou au gel à 80 degrés Celsius. Pour effectuer une coextraction lipidique liquide-liquide d’endocannabinoïdes et d’eicosanoïdes à partir de morceaux de cerveau, de poinçons ou d’échantillons de poudre de tissu, placez les tubes d’extraction contenant les échantillons de tissus et sept billes d’acier sur de la glace. Ajouter 600 microlitres de MTBE glacé et 50 microlitres d’eau acétonitrile contenant les étalons internes.
Après avoir ajouté 400 microlitres d’acide formique molaire 0,1, utilisez un lyseur tissulaire pour homogénéiser pendant 30 secondes à 1 minute. Centrifugez cet homogénat pendant 15 minutes à 5 000 fois g à 4 degrés Celsius. Placez-le au congélateur pendant 10 minutes à 80 degrés Celsius pour congeler la phase inférieure aqueuse, ce qui facilitera le transfert de la phase organique supérieure.
Transférer la phase organique supérieure dans de nouveaux tubes ambrés de 1,5 millilitre, évaporer sous un léger jet d’azote à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis reconstituer dans 50 microlitres d’eau acétonitrile pour une analyse plus approfondie. Conservez la phase aqueuse à 20 ou 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie de la teneur en protéines. Pour extraire des endocannabinoïdes et des eicosanoïdes d’échantillons de plasma, placez les échantillons de plasma congelés sur de la glace et laissez-les décongeler complètement.
Ajouter 800 microlitres de MTBE et 50 microlitres d’eau acétonitrile contenant les étalons internes optimisés pour le pic à l’aide d’échantillons de plasma de référence. Ajouter 600 microlitres d’acide formique molaire 0,1 et vortex à 4 degrés Celsius pendant 2 minutes. Centrifuger les échantillons à 4 000 fois g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius.
Transférer la phase organique dans de nouveaux tubes. Évaporez-le sous un doux jet d’azote à 37 degrés Celsius, puis reconstituez-le avec 50 microlitres d’eau acétonitrile pour l’analyse de surveillance des réactions multiples par chromatographie liquide. Pour effectuer la coextraction de phospholipides et d’endocannabinoïdes à partir de régions du cerveau, de poinçons ou d’autres échantillons de poudre de tissu, placez les tubes d’extraction contenant les échantillons de tissus et les perles de céramique sur de la glace.
Ajouter 800 microlitres de méthyl tert-butyléther et de mélange de méthanol et 10 microlitres de méthanol contenant les étalons internes. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’acide formique à 0,1% contenant 25 micromolaires tétrahydrolipstatine/URB597 et 50 microgrammes par millilitre de BHT. Après homogénéisation avec un homogénéisateur tissulaire, centrifuger à 5 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Transférer la phase organique supérieure dans de nouveaux tubes, évaporer sous un doux jet d’azote à 37 degrés Celsius, puis reconstituer cet extrait lipidique avec 90 microlitres de méthanol. Si vous procédez immédiatement, ajoutez 10 % d’eau à une aliquote d’extrait lipidique et injectez 10 microlitres dans le LC/MS pour l’analyse des phospholipides. Pour une analyse plus approfondie des endocannabinoïdes, passez à l’étape suivante.
Prenez une aliquote de l’extrait lipidique, évaporez-la à sec et reconstituez-la dans de l’eau acétonitrile. Effectuer une double extraction de l’ARN et des lipides et coextraction de phospholipides et d’endocannabinoïdes à partir d’échantillons de tissus, décongeler des aliquotes de poudre de tissu ou des grappes de cerveau à 4 degrés Celsius. Ajouter le tissu aux tubes d’extraction avec des perles de céramique.
Ajoutez ensuite 600 microlitres de tampon RLT avec 200 microlitres de chloroforme. Pour la coextraction de phospholipides et d’endocannabinoïdes, épile des échantillons avec 10 microlitres de mélange étalon interne et homogénéiser à grande vitesse pendant 20 secondes. Transférez les échantillons homogénéisés dans de nouveaux tubes centrifuges et centrifugez pendant cinq minutes à pleine vitesse et à 4 degrés Celsius pour permettre la séparation de phase.
Transférer la phase supérieure dans un tube frais pour l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit standard. Elute a extrait l’ARN dans un volume total de 50 microlitres d’eau sans RNase et l’a stocké à 80 degrés Celsius. Pour l’extraction des lipides, ajouter 800 microlitres de MTBE/méthanol et 200 microlitres d’acide formique à 0,1 % à la phase inférieure contenant du chloroforme.
Vortex pendant 45 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer la phase organique supérieure dans un nouveau tube. Évaporez-le sous un doux jet d’azote à 37 degrés Celsius.
Pour une analyse plus approfondie de la CL/SEP, reconstituer l’échantillon dans 90 microlitres de méthanol et le stocker à 20 ou 80 degrés Celsius, ou procéder immédiatement à l’analyse. Pour une analyse plus approfondie des endocannabinoïdes, passez à l’étape suivante. Prenez une aliquote de l’extrait lipidique, évaporez-la à sec et reconstituez-la dans de l’eau acétonitrile.
Ensuite, injectez 20 microlitres dans le LC/MS pour l’analyse endocannabinoïde. L’induction par l’acide kaïnique des crises d’épilepsie aiguës a conduit à une intensité de crise maximale une heure après l’injection. Le profilage lipidomique des endocannabinoïdes et des eicosanoïdes, ainsi que des phospholipides et des endocannabinoïdes, montre des changements du taux de lipides dans le cortex cérébral, le striatum, la région thalamique, l’hippocampe, l’hypothalamus, le cervelet ainsi que le tissu cardiaque et pulmonaire chez les souris épileptiques induites par l’acide kaïnique et les témoins.
Après une double extraction de phospholipides, d’endocannabinoïdes et d’ARN pour le profilage quantitatif des coups de poing cérébraux de souris, la distribution quantitative des lipides dans l’hypothalamus, l’amygdale basolatérale et l’hippocampe ventral et dorsal a été analysée. Niveaux d’expression relatifs des enzymes et des récepteurs endogènes impliqués dans la signalisation lipidique, ainsi que des marqueurs de l’activité cérébrale étudiés au niveau de l’ARNm dans différentes régions et sous-régions du cerveau chez des souris soumises à une crise d’épilepsie induite par l’acide kaïnique et des témoins. L’épilepsie induite par l’acide kaïnique a provoqué une perte massive du signal NeuN, principalement dans la région CA1, CA3 et hilus de l’hippocampe, accompagnée d’événements apoptotiques indiqués par le signal caspase-3 par rapport aux souris contrôlées injectées de solution saline.
Après un traitement par palmitoyléthanolamide subchronique, le signal de la protéine des noyaux neuronaux a été sensiblement préservé et le signal CASP3 était à peine détectable. Le coup de poing cérébral et la dissection de zones cérébrales discrètes sont assez difficiles et nécessitent des compétences fines pour obtenir un échantillonnage cohérent sur plusieurs cohortes. Par conséquent, la pratique sur les organes de test et une bonne connaissance de la morphologie du cerveau sont fortement recommandées.
