משמעות השיטה שלנו היא הרבגוניות והעוצמה שלה. זה מאפשר לחוקרים יש שליטה חזקה על ביטוי גנים אנדוגני בדרכים כי היו מאתגרים להשיג באמצעות שיטות קיימות. היא מאפשרת לחוקרים לחקור את תפקודו של גן ברמות ביטוי שונות ובאופן מרחבי-זמני.
לכן זה מאפשר בדיקת הפיך של פנוטיפ, אשר שימושי בעת לימוד גנים הקשורים למחלות. כדי להשיג דיכוי, גן היעד intron מתוכנן להכיל reron R, אשר מכיל 12 אופרטורים לאק סימטרי. כאשר מדכא LacIGY בא לידי ביטוי מן האמרגן הספציפי לרקמות הרצוי, גן היעד מודחק.
דיכוי של גן היעד יכול להיות הפוך או מותאם לרמת הביטוי הרצויה על ידי הממשל של IPTG, אנטגוניסט של מדכא LacIGY. כדי להשיג רגולציה, מקדם הגנים היעד מתוכנן להכיל ארבעה או יותר מפעילי Tat, T, כאתרים מחייבים עבור מפעילי rtTA-M2. כאשר המפעיל בא לידי ביטוי מן האמרגן הרצוי ספציפי לרקמות בנוכחות דוקסיציקלין, upregulation של גן היעד הוא המושרה.
Upregulation של גן היעד יכול להיות הפוך או מותאם לרמת הביטוי הרצוי על ידי משיכת או שינוי הריכוז של דוקסיציקלין. כדי להשיג הן דיכוי והן הפעלה, ניתן לשלב את מערכות הדיכוי של Lac ו- Tat activator. כדי לשנות את הגן של עניין להדחקה, intron אינרטי שעתוק לקראת הקצה העיקרי של הגן של עניין צריך להיות מזוהה להכנסת רצף repron.
כדי להשיג את הרצף הגנומי עבור הגן של עניין, לנווט לדפדפן הגנום UCSC ולבחור את הטיוטה האחרונה של הגנום העכבר תחת לשונית הגנום. הזן את השם או הסמל של הגן המעניין לתוך סרגל החיפוש כדי להציג את התעתיקים של הגן ולאחר מכן לחץ על עבור. לאחר מכן, בחר את וריאנט התמליל הרצוי עבור הגן של עניין ולחץ על סמל הגן ליד וריאנט התמליל של עניין.
לאחר מכן, תחת הרצף וקישורים לכלים ומסדי נתונים באנר, לחץ על הקישור רצף גנומי. עבור אפשרויות אזור אחזור רצף, בחר רק exons, introns ואת רשומת FASTA אחת ברירת המחדל לכל גן. לקבלת אפשרויות עיצוב רצף, בחר exons באותיות רישיות, כל השאר באותיות רישיות ומסכה חוזרת ל- N.Then, לחץ על שלח.
לבסוף, שמור רצף זה, תוך שמירה על העיצוב באותיות רישיות וקטנות במסמך או בתוכנית שניתן להוסיף להם ביאורים. כדי למנוע הפרעה של איי CpG, בחר הצג עבור מסלול איי CpG תחת כרזת הביטוי והרגולציה של דפדפן הגנום של UCSC ולחץ על רענן. התקרבות על חמשת introns הממשלה, לחץ על כל אי CpG המוצג בירוק, ובחר להציג DNA עבור תכונה זו.
לאחר בחירת מסיכה חוזרת N, לחץ על לקבל DNA כדי להשיג את רצף איי CpG. לבסוף, שכבת-על של רצפים אלה עם קובץ הרצף המקורי, ובאר אותם כאזורים אסטרוניים שיש להימנע מהם. כדי להימנע מאזורים intronic עם חתימות משפר ברקמות של עניין, לנווט אל בסיס הנתונים ENCODE ולבחור את סמל הניסויים.
עבור סוג ההתזה, בחר ChiP-seq או DNase-seq ואכלס את הקטגוריות האחרות בהתאם לתאים שיש להנדס. לאחר בחירת התכונה, בחר את הפיקטוגרמה השמאלית ביותר בכחול, שעבורה מופיעות תוצאות התצוגה כרשימה. לאחר מכן, בחר את ערכות הנתונים עבור המטרות של מונומטילציה h3k4, h3k27 אצטילציה, DNase 1 ו- CTCF שהתאימו ביותר לתאים שיש להנדס.
בתוך כל ערכת נתונים רלוונטית, גלול אל מקטע הקובץ, ודא שה- mm10 ו- UCSC נבחרו ולחץ על לחצן הפריט החזותי. עכשיו, בדפדפן הגנום של UCSC, התקרבו לחמשת האסטרונים המובילים ולחצו על כל שיא במסלולי השיא המבארים. השג את רצף הדנ"א עבור כל אזור שיא על ידי לחיצה על הקואורדינטות הכרומוזומליות לכל שיא.
בתפריט הנפתח של התצוגה, בחר DNA ולחץ על מסיכה חוזרת ל- N.Finally, שכבת-על רצפים אלה עם קובץ הרצף המקורי ובאר אותם כאזורים אנטרוניים שיש להימנע מהם. כדי לזהות sgRNA באזורים האסטרוניים הנותרים עם ספציפיות גבוהה וציוני יעילות חזויים, נווט אל כלי עיצוב sgRNA מקוון לבחירה, כגון CRISPOR. הזן את הרצף של אזור העניין האסטרוני, ציין את גנום הייחוס הרלוונטי ובחר את המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר הרצוי.
לאחר מכן, לחץ על שלח. לאחר מכן, למיין את sgRNA של חזוי לפי ציון ספציפיות ולבחור אחד או יותר sgRNA של כי יש גם ציון יעילות חזוי גבוה. לבסוף, תכנן תבנית דנ"א המכילה רצף משטח נחיתה PITT מוקף משני הצדדים בזרועות הומולוגיה של 60 בסיס התואמות לאתר החיתוך sgRNA.
עבור היפוך של דיכוי גנים היעד, לנהל IPTG במי השתייה של עכברים הומוזיגוס bred עם אלל שונה של עניין על ידי המסה מלאה את הכמות הרצויה של IPTG במים מזוקקים סטריליים ביום הממשל. עוטפים את הבקבוק בנייר כסף ומנהלים את מי ה-IPTG בבקבוק מוגן באור לעכברים של הגנוטיפ המתאים ושולטים במשך שבוע לפחות. המשך לניתוח הביטוי של הגן של עניין ברקמת היעד.
כדי לגרום לגן upregulation, לנהל דוקסיציקלין בתזונה במשך שבוע ולהמשיך לנתח את הביטוי של הגן של עניין ברקמת היעד. qRT PCR anaylisis הראה כי ביטוי DNMT1 הודחק ל 15% של רמות ללא פיקוח באמצעות גישה מבוססת מקדם. הדיכוי התהפך באופן תלוי מינון על ידי טיפול בעכברים עם כמויות משתנות של IPTG.
דיכוי DNMT1 שנצפה ואת היפוך של דיכוי DNMT1 על ידי טיפול IPTG אומת ברמת החלבון על ידי immunostaining. ניתוח PCR qRT של ביטוי mKate2 הראה כי הגישה מבוססת intron השיגה יותר מ 90% דיכוי ממפעילים הממוקמים כמה קילו-בייזר במורד הזרם של אתר התחלת שעתוק על ידי הארכת שעתוק. תמונות קונפוקליות של ביטוי mKate2 ב intenstine הקטן של העכברים עם או בלי מדכא LacIGY מאומת הגישה מבוססת intron.
רגולציה חזקה ורגולציה של ביטוי DNMT1 הושגו בתאי גזע עובריים המכילים את אלל DNMT1 אנדוגני שונה עם רצפי אופרטור Tat ו Lac. שתי התקנות היו הפיכות לחלוטין ובלתי ניתנות לעיכול על ידי טיפולים IPTG ו- Dox. upregulation חזק של DNMT1 נצפתה מן הכבד, הטחול, והכליות.
עם זאת, לא נצפתה שום רגולציה ניתנת לגילוי בלב, דבר המצביע על כך שדפוס הביטוי התלוי במחזור התא של DMNT1 והמחסור בתאים מתרבים בלב עשויים ביסוד תצפית זו. לימוד הפונקציה in vivo של גן קריטי על ידי מניפולציה הביטוי שלה היה לעתים קרובות מאתגר בשל קטלניות. השיטה שלנו אפשרה לנו להתגבר על הפנוטיפ הקטלני לגן העניין שלנו ואיפשרה לנו ללמוד את תפקידה בגידולוגנזה ב-vivo.
כמו כן, טכנולוגיה זו תאפשר חקירה של גנים חיוניים אחרים שהיה קשה ללמוד.
