מדידה של מיני חמצן תגובתי או ROS הוא בעייתי לשמצה. בסרטון זה, נדגים את המדידה לשחזור של ROS בתגובה להצלבת קולטן FC-גמא באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות וציטומטריית זרימה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הרבייה של ההתרשאות והשימוש בשיטה זו עם גירויים אנטיגניים ספציפיים, לא רק מיטוגנים או מעוררי ROS ידועים.
ייצור ROS Dysregulated הוא מרכזי להתפתחות של מחלות רבות כגון מחלה גרנולומטוס כרונית או CGD. מדידה מדויקת של ROS יכולה להוות חלק אחד של האבחנה המולקולרית של CGD. לימוד ייצור ROS מתווך FC חשוב בחקר immunodeficiencies, כגון CGD, אלא גם בחקר מחלות אוטואימוניות, או מחלות ניווניות, שבו יותר מדי ROS מוביל ללחץ חמצוני ודלקת.
העיתוי של ההתרגם הוא קריטי. הייתי מייעץ למישהו שמנסה את הפרוטוקול הזה בפעם הראשונה להתכונן ביסודיות ולעשות ניסוי מדומה במידת האפשר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית על מנת להדגיש את צעדי ההתנסויות הזקוקות לתשומת לב מיוחדת כגון עיתוי ההתרגםות.
כדי להתחיל, הכן מקרופאגים שמקורם במח העצם באמצעות מדיה מותנה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר priming מקרופאגים לילה, שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. הסרום מרעיב את התאים על-ידי החלפת מדיה באותו אמצעי אחסון של DMEM עם סרום נמוך.
עבור כל עכבר, צלחת אחת תטופל עם אנטי BSA IgG1 בעוד סרום רעב בעוד השני יישאר מטופל. הוסיפו רק DMEM עם סרום נמוך לצלחות שלא טופלו והוסיפו DMEM עם סרום נמוך המכיל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של מורין נגד BSA IgG1 לצלחות המטופלות. הקפד לכלול לוח אחד נוסף לא מטופל עבור כל ניסוי לפעול כבקרת פיצוי ציטומטרי זרימה.
דגירה הצלחות ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. במהלך הדגירה של ארבע שעות, הכינו פתרון פי 2 לבדיקות של מיני החמצן תגובתי. עבור כל 10 מיליליטר של DMEM בסרום נמוך הדרושים, להוסיף ארבעה microliters של reagent גילוי סטרס חמצוני וארבעה microliters של reagent זיהוי סופראוקסיד.
לאחר מכן, להכין את פתרונות בדיקה 2X המכיל רק את reagent זיהוי סטרס חמצוני או המכיל רק את reagent זיהוי סופראוקסיד. לאחר הדגירה של ארבע שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד עדין של הצלחות, איסוף אותם בצינורות מסומנים, חמישה מיליליטר עם תחתית עגולה. צנטריפוגה הצינורות ב 750 פעמים g במשך חמש דקות.
הקפד לעקוב אחר התאים שטופלו עם מורין נגד BSA IgG1. לאחר מכן, לשטוף את כדורי התא עם שני מיליליטר של PBS כדי להיפטר כל שאריות אנטי BSA מהתאים המטופלים. צנטריפוגה הצינורות ב 750 פעמים g במשך חמש דקות.
לאחר מכן, שאף את ה- PBS ולחץ מחדש על גלולת התא ב- 600 מיקרוליטרים של DMEM עם סרום נמוך. מהשעיית תא 600 מיקרוליטר, aliquot 200 microliters לתוך צינורות תחתונים עגולים 5 מיליליטר prelabeled. מן התאים מטופלים, לקחת 200 microliters עבור צינורות שכותרתו unstimulated, 200 microliters עבור צינורות שכותרתו תמריץ חיובי, ו 200 microliters עבור הצינורות שכותרתו גורם חיובי בתוספת מעכב.
לאחר מכן, מן התאים נגד BSA IgG1 מטופלים, לקחת 200 microliters עבור צינורות שכותרתו FC-גמא קולטן crosslinking, ו 200 microliters עבור צינורות שכותרתו קולטן FC-גמא crosslinking בתוספת מעכב. מהתאים הלא מטופלים שישמשו לבקרות פיצוי, יש ליטול 200 מיקרוליטרים עבור הצינור המסומנים כלא מזוהמים, 200 מיקרוליטרים לבקרת גרין פלוס תמריץ, ו-200 מיקרוליטר לבקרת תפוזים פלוס מעוררים. הכן פתרון מעורר חיובי 2X על ידי דילול pyocyanin אחד עד 100 לתוך כל אחד פתרונות בדיקה 2X לריכוז של 500 micromolar.
לאחר מכן, הכינו פתרון BSA 2X על ידי דילול פתרון המלאי של BSA בתסרון הבדיקה 2X כדי להשיג ריכוז פי 2 של שני מיקרוגרם למיליליטר. לפני תחילת הגירוי הספציפי, כגון הצלבת קולטן FC-גמא, ודא כי כל reagents ותאים מוכנים למקם את הצינורות על קרח בסדר שבו הם יהיו מגורה. עבור ציטומטר זרימה עם מדגם אוטומטי, שים לב לזמן שלוקח לציטומטר לנתח דגימה אחת ולעבור לדגימה הבאה.
הקפד לכלול את כל שלבי ערבוב ושטיפת בדיקה. התזמון הוא קריטי מאוד להתרגם הזה. על מנת שכל תנאי יהיה מבוקר היטב, הגירוי צריך להתבצע בדיוק 30 דקות עבור כל תנאי.
לעורר את התאים לפי הסדר ולשלב את זמן ההשהיה בין רכישות מדגם על ידי ציטומטר זרימה. אם מבצעים פיצוי ידני בשלב זה, לעורר צינורות בקרה לשמש לפיצוי על ידי הוספת 200 microliters של פתרון בדיקה 2X המכיל את reagent זיהוי מתח חמצוני ואת המזרז לתוך הצינורות מסומן ירוק בתוספת inducer. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של פתרון בדיקה 2X המכיל את reagent זיהוי סופראוקסיד ואת המריץ לתוך צינורות מסומן כתום בתוספת inducer.
דגירה התאים במשך 30 דקות בחושך. באמצעות תוכנת cytometry זרימה, ליצור ולתייג שלושה קבצים לדוגמה עבור הפקד, לא מוכתם, מטופל, ירוק בתוספת inducer, ואת כתום בתוספת דגימות inducer, הקפד לציין את הערוצים ואת הפרמטרים שיש לנתח. כמו כן, הזן תנאי עצירה רצויים.
לאחר הגדרת דגימות הבקרה, צור ותייג קבוצה דומה של קבצים עבור הדגימות הניסיוניות. עכשיו, תריץ את הדגימה הלא מזוהמת והלא מטופלת. פתח חלקת נקודה עבור פיזור קדימה על ציר X לעומת פיזור צד על ציר Y ולצייר שער סביב התאים של עניין, למעט תאים מתים ופסולת.
לאחר מכן, השתמש בשער של תא זה כדי לפתוח חלקת נקודה נוספת של סמן הפלואורסצנטיות הראשון, FL1, על ציר ה- X, לעומת סמן הפלואורסצנטיות השני, FL2, על ציר Y. צייר שער רבעים ראשוני ולאחר מכן התאם את שער הרבע כך שהאירועים יופיעו ברביע השמאלי התחתון של התוויית FL1 לעומת FL2. בסיום, הפעל את דגימת המזרז הירוק בתוספת.
כוונן את המתח כך שהאירועים יופיעו ברבעים השמאליים והימין התחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2. לאחר מכן, החל מטריצת פיצוי זו על כל שלושת הקבצים לדוגמה. עכשיו, תריץ את דגימת התפוז פלוס המזרז.
התאם את המתח כך שהאירועים יופיעו ברבעים השמאליים העליונים והתחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2, ולאחר מכן החל מטריצת פיצוי זו על כל שלושת הקבצים לדוגמה. בדוק כל קובץ פיצוי וודא שאירועים לא נגועים ולא מטופלים מופיעים ברביע השמאלי התחתון, אירועי ה-green plus inducer מופיעים ברבעים השמאליים והימניות התחתונים, ואירועי המזרז הכתומים פלוס מופיעים ברבעים השמאליים העליונים והתחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2. לאחר מכן, החל את מטריצת הפיצוי על כל קבצי הדוגמה הניסיוניים.
לאחר ביצוע פיצוי ידני והתקבלה תבנית ניסיונית, עבור אל הדגימות הניסיוניות. לפני הטיפול בתאים עם מעורר חיובי או ביצוע גירוי תא קולטן FC-גמא, לסמן אילו צינורות יקבלו מעכב ROS. לטפל בתאים אלה עם מעכב ROS לפחות 30 דקות לפני מעורר חיובי או גירוי קולטן FC-גמא על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של המעכב ל 200 microliters של תאים resuspended לריכוז סופי של חמישה מילימולרים.
עבור תאים לא מנומקים, לטפל בתאים עם 200 microliters של פתרון בדיקה 2X ללא כל גירוי נוסף 200 microliters של השעיית תא שכותרתו מוכתם, ללא גירוי. עבור פקדים חיוביים, לטפל בתאים עם 200 microliters של פתרון תמריץ חיובי 2X כדי 200 microliters של השעיית התא שכותרתו תמריץ חיובי או מעורר חיובי בתוספת מעכב. לבסוף, עבור תאים מגורה על ידי הצלבת קולטן FC-גמא, לטפל בהם עם 200 microliters של פתרון 2X BSA הוסיף 200 microliters של המתלה התא שכותרתו FC-גמא קולטן crosslinking או קולטן FC-גמא crosslinking בתוספת מעכב.
דגירה התאים במשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, לנתח את הדגימות בסדר שבו הם היו מגורים, באמצעות ציטומטר זרימה ותבניות ניתוח שנוצר במהלך שלבי הפיצוי הראשוניים. הנתונים המוצגים כאן מדגימים את הזיהוי הציטומטרי של זרימה של ייצור מיני חמצן תגובתי הנובע מגירוי של מקרופאגים באמצעות קולטן FC-גמא.
יש עלייה ניכרת פלואורסצנטיות FL1 ו FL2 כאשר תאים מגורים עם סוכן crosslinking קולטן FC-גמא. כאשר תאים טופלו עם מעכבי מיני חמצן תגובתי לפני הצלבת קולטן FC-גמא, פלואורסצנטיות מוגברת זו מוחזרת לרמות בסיס. לעומת זאת, חלקות נקודה אלה מציגות ניסוי לא מוצלח, שבו נצפתה ייצור מיני חמצן תגובתי תת-אופטימלי כתוצאה מגירוי קולטן FC-גמא.
כדי להדגיש את ההבדלים הגדולים בין האחוזים הצפויים, או עליות MFI, נתונים אלה מראים מה דגימות עם עלייה מינימלית FL1 ו FL2 פלואורסצנטי נראה. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשלב של 24 שעות ביממה. כאשר משווים זמן של 24 שעות לעומת זמן של 48 שעות, לא היה הבדל ניכר באחוז התאים החיוביים עבור רוח הלחץ החמצוני הירוק.
עם זאת, הגדלת זמן הפרימינג ל-48 שעות הגדילה את אחוז התאים החיוביים עבור הפלואורסצנטיות הכתומה. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת ביצוע הליך זה הוא תכנון מראש, ולהיות עקבי על העיתוי של הבדיקה כדי לקבל תוצאות לשחזור.
