פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה והיישום של PODS, ריאגנט חדש עבור bioconjugation ספציפי לאתר של חלבונים ופפטידים. טכנולוגיה זו מייצגת שיפור ניכר לעומת ההתייחדות הביולוגית המסורתית המבוססת על זכרים-תיול. היתרון הגדול ביותר של הליך זה הוא הפשטות שבה הריג'נט נעשה.
השיטה מאפשרת לסנתז את הריאה כמעט בכל מעבדה. בבקבוק 10 מיליליטר עגול תחתון, להמיס 100 מיליגרם של תיול aminophenyl oxadiazole בשלושה מיליליטר של מתנול. לפתרון, להוסיף 360 microliters של diisopropylethylamine ו בר ערבוב מגנטי.
לאטום את הבקבוק עם פקק גומי, ומערבבים את הפתרון במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מזרק זכוכית מיליליטר אחד, לתקוע חור דרך פקק גומי במהירות להוסיף 32 microliters של iodomethane לתערובת. אפשר לתערובת להגיב במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
בבקבוקון עגול-תחתון 25 מיליליטר, ממיסים 387 מיליגרם של חומצה קרבוקסילית מוגנת בבוק ב-10 מיליליטר של דיכלורומטן. לפתרון, להוסיף 480 microliters של diisopropylethylamine, 264 מיליגרם של EDCI, 200 מיליגרם של אנילין, ו בר ערבוב מגנטי. לאטום את הבקבוק עם פקק זכוכית, ולאפשר את התגובה לבחוש במשך חמישה ימים בטמפרטורת החדר.
לאחר השלמת התגובה, מעבירים את תערובת התגובה למשפך נפרד, ושוטפים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של חומצה הידרוכלורית אחת דיוחה. לאסוף את השלב האורגני ולהעביר אותו משפך ההפרדה. לאחר מכן לשטוף את השלב האורגני עם נתרן פחמתי אחד תותחת ואחריו מים.
לאחר מכן, לאסוף את השלב האורגני ולהוסיף מגנזיום גופרתי כדי להסיר את כל עקבות של מים. לאחר מכן לסנן את התערובת באמצעות פריט זכוכית בינונית. באמצעות אידוי סיבובי, להסיר את הממסים נדיפים תחת לחץ מופחת להרשות לעצמו מוצק לבן.
לאחר מכן, גלה מחדש את המוצק המבודד ב-10 מיליליטר של אתיל אצטט. ואז לזרז את המוצר באמצעות תוספת הדרגתית של 30 מיליליטר של ציקלוהקסאן. סנן את הפתרון באמצעות פריט זכוכית בינוני כדי להשיג את המוצר קרבמט כמו אבקה לבנה.
בבקבוקון עגול-תחתון של 10 מיליליטר, ממיסים 30 מיליגרם של קרבמט בארבעה מיליליטר של דיכלורומטן. מוסיפים לאט 49 מיליגרם של חומצה 70%-m-chloroperbenzoic ופס ערבוב מגנטי לתערובת, ואוטמים את הבקבוק עם פקק זכוכית. מערבבים את הפתרון בן לילה בטמפרטורת החדר, ובסופו של דבר מניבים תערובת צהובה.
ביום שלמחר, מעבירים את התערובת למשפך הפרדה. לאחר מכן לשטוף את התערובת עם 0.1-טוחן נתרן הידרוקסיד ואחריו מים. לאסוף את השלב האורגני ולהוסיף מגנזיום גופרתי כדי להסיר כל עקבות של מים.
לאחר מכן לסנן את התערובת באמצעות פריט זכוכית בינונית. בבקבוקון עגול-תחתון של 25 מיליליטר, ממיסים 30 מיליגרם של קרבמט בשני מיליליטר של דיכלורומטן. מוסיפים פס ערבוב מגנטי לתערובת.
ו-400 מיקרוליטרים של חומצה טריפלואורואצטית ואותמים את הבקבוק עם פקק זכוכית. ואז מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות. לאחר השלמת התגובה, הסר את הנדיפים תחת לחץ מופחת בטמפרטורת החדר באמצעות אידוי סיבובי כדי להשיג שאריות שמנוניות.
ממיסים את השאריות השמנוניות בשבעה מיליליטר מים. ולהעביר למשפך הפרדה. לשטוף את הפתרון המים שלוש פעמים עם ארבעה מיליליטר של אתיל אצטט.
בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, להמיס 10 מיליגרם של PODS ו 300 microliters של דימתיל סולפוקסיד. לאחר מכן הוסיפו 26 מיקרוליטרים של N, N-diisopropylethylamine לפתרון. ממיסים 15.2 מיליגרם של DOTA NCS ב-100 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד, ומשלבים את הפתרון עם פתרון PODS.
לאטום את צינור microcentrifuge, ולאפשר את התגובה דגירה לילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לדלל 61 microliters של פתרון מלאי trastuzumab עם 859 microliters של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר מחייב חלבון נמוך. לתערובת זו, מוסיפים 6.7 מיקרוליטרים של פתרון טרי של 10 מילימולר של TCEP במים.
הוסף 73 מיקרוליטרים של פתרון PODS-DOTA של מיליגרם למיליליטר לתערובת התגובה. לבסוף, לאטום את צינור microcentrifuge ו דגירה הפתרון במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. סינתזת PODS היא חזקה ואמינה.
Deproteination והחלפה של תיול aminophenyl oxadiazole העניק thioether אחד בתשואה כמותית. קשירה של תיות'ר אחד וחומצה קרבוקסילית מוגנת בבוק הניבו תרכובת 2 בתפוקה של 55%. חמצון העניק תרכובת שלוש בתשואה של 90%.
והסרת הקבוצה המגנה על בוקס הניבה PODS בתשואה של 98%. זהותו של כל מוצר אושרה באמצעות פרוטון NMR, פחמן NMR, ו טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה. גרסה נושאת isothiocyanate של DOTA chelator היה יחד עם אמין התליון של PODS כדי לקבל את chelator דו-תכליתי בתשואה של 75%. זהות המוצר אושרה באמצעות פרוטון NMR, פחמן NMR, ו טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה. ביו-קונגציה ביו-קונקטוציה סלקטיבית של PODS-DOTA לטרסטוזומפ נוגדן HER2-מיקוד מוצג כאן.
הקשרים הדיסולופידיים של אזור הציר של הנוגדן צומצמו באופן סלקטיבי, והנוגדן היה אז דגירה עם PODS-DOTA כדי להרשות לעצמו את immunoconjugate נושאת DOTA תשואה של 80%. ניתוח MALDI-TOF גילה מידה מסוימת של תיוג של 1.8 DOTA לכל נוגדן. אשר נשאר עקבי על פני מגוון של נוגדנים אנושיים, אנושיים, כימריים IgG1.
עם זאת, אותם תנאים מייצרים immunoconjugates עם מידה של תיוג של 1.5 עבור נוגדנים IgG1 מורין. בשל רגישות האור של תרכובת זו, חשוב לשמור על כל התגובות בכלי מכוסה בנייר כסף. זה יגדיל את התשואה הכוללת של המוצר.
בעוד פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של PODS-DOTA, הליך דומה ניתן להחיל על מגוון רחב של מטענים פוטנציאליים, כולל פלואורופורים, רעלנים, וכלטורים אחרים. שיטה זו תקל על בניית חיסונים מוגדרים היטב, הומוגניים ויציבים ביותר שניתן להשתמש בהם במגוון רחב של תחומים. חשוב לזכור כי iodomethane הוסיף בשלב אחד של ניסוי זה יכול להיות השפעות מזיקות, ולכן יש להשתמש ברדס אדים.
