על ידי ביצוע פרוטוקול זה, המשתמש יוכל לייצר וקטורים AAV של טוהר גבוה להיכנע מתאים יישומי במבחנה או in vivo. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לייצר ולטהר מגוון של Serotypes AAV עם הבדלים בתצורות. שילוב שני אלמנטים אלה יכול להיות שימושי כדי להשיג סוג תא וביטוי ספציפי לרקמות.
ייצור של כמה serotypes יכול לתת תשואה נמוכה יותר. זהו ייצור שבו יש סרוטיפים קרובים ויש להעריך אותם על בסיס אישי. הפגנת נהלים אלה תהיה שלי פריפונט, טכנאית מהמעבדה שלנו.
לאחר גידול תאי HEK, מערבבים 360 מיקרוגרם של פלסמיד עוזר, 180 מיקרוגרם של פלסמיד המקידוד את הווקטור קפסיד, ו-180 מיקרוגרם של פלסמיד המכיל את הטרנסג'נדר ב-18 מיליליטר של נתרן כלורי 150 מילימולאר להכנת תערובת הדנ"א. פזרו את התערובת הזו על פני שלושה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. בצינור חרוט חדש, מערבבים 840 מיקרוגרם של PEI ושישה מיליליטר של נתרן כלורי 150 מילימולרי כדי להכין את תערובת PEI לשש מנות תרבות תאים.
לאחר מכן, להוסיף שישה מיליליטר של תערובת PEI, טיפה אחר טיפה, לאחד הצינורות חרוט המכיל את תערובת ה-DNA. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, הסר שש מנות תרבות תאים מהחרם.
במכסה המנוע לזרימת למינאר, שאף לחלוטין את המדיום מכל מנה. לשטוף את הכלים עם חמישה מיליליטר של DPBS מחומם מראש כדי להסיר עקבות של המדיום. הטה בעדינות כל מנה כדי להבטיח ש- DPBS יופץ באופן שווה על פני השטח כולו.
לאחר מכן, שאפו בעדינות את ה-DPBS. מוסיפים 12 מיליליטר של DMEM אחד לכל מנה לאט, עם פיפטה להציב בקצה המנה. מערבבים את תערובת PEI ו- DNA על ידי צינורות אותו למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.
מוסיפים שני מיליליטר של תערובת זו לכל אחת משש מנות תרבות התאים בצורה טיפה על ידי טיפה, הקפד להפיץ אותו בזהירות על פני השטח כולו. חזור על תהליך זה באמצעות שש מנות תרבות תאים בכל פעם עד שהגיע 18 מנות תרבות התא. לנער בעדינות את מנות תרבות התא כדי להפיץ את תערובת ה- DNA PEI.
דגירה התאים המרובים ב 37 מעלות צלזיוס עם 95 אחוז לחות וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך חמש שעות. לאחר מכן, להוסיף 12 מיליליטר נוספים של DMEM 10 לכל אחד 18 מנות מבלי להסיר את המדיום קיים. המשך להחגירה של התאים המרובים באותם תנאים.
ב 72 שעות לאחר transfection, להשתמש מגרד תאים כדי לנתק בזהירות את התאים מכל צלחת תרבות. לאסוף את המדיום ואת התאים של שתי מנות תרבות בצינור חרוט 15 מיליליטר, כל הזמן על קרח. צנטריפוגה הצינורות ב 420 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עם האצה והאטה של הצנטריפוגה מוגדר למקסימום.
בזהירות להשליך את supernatant מכל צינור על ידי בעדינות לשפוך אותו לתוך מיכל סילוק פסולת. לאחר מכן, מניחים את הצינורות המכילים את כדורי התא על קרח. אנחנו משהים כל גלולה בשני מיליליטר של חיץ תיזה ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש עד 10 פעמים.
משוך AAV משלושה צינורות, יחד. כדי להתחיל, להקפיא את התאים מושעה מחדש על ידי הצבת אותם בדלי המכיל קרח יבש מעורבב עם אתנול. ואז להפשיר את התאים על ידי הצבתם מיד באמבט מים להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס.
חזור על מחזור ההקפאה וההפשרה הזה שלוש פעמים כדי ללחש את התאים ולשחרר את חלקיקי AAV. לאחר צעד ההפשרה השלישי, צנטריפוגה ב 1167 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בזהירות להעביר את supernatants לנקות 50 צינורות חרוט מיליליטר.
מוסיפים נוקלאז לכל צינור לריכוז סופי של 50 יחידות למיליליטר של על-טבעי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, תוך מערבולת הצינורות כל 10 דקות כדי להבטיח כי הגרעין מעורבב ביסודיות עם על טבעי. צנטריפוגה ב 13490 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להבהיר את העל טבעי.
לאחר מכן, להסיר את הבוכנה של מזרק 10 מיליליטר, לחבר מסנן 0.45 מיקרומטר למזרק ולהכניס אותו על גבי צינור חרוט נקי 50 מיליליטר. ממלאים בזהירות את המזרק עם העל-טבעי המובהר. השתמש הבוכנה כדי לכפות את lysate דרך המסנן.
לאחר מכן, להכין כל אחד שברי יודיקסנול בארבעה צינורות חרוט 50 מיליליטר נפרדים, כפי שמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. פיפטה שמונה מיליליטר של 15 אחוז יודיקסנול לתוך כל אחד משלושת צינורות אולטרהצנטריפוגה. פיפטה 5.5 מיליליטר של 25 אחוז יודיקסנול לתוך צינור חרוט נקי 50 מיליליטר.
באמצעות פיפטה פסטר לא מדורגת, בזהירות שכבה 5.5 מיליליטר של 25 אחוז יודיקנול פתרון מתחת 15 אחוז יודיקנול פתרון. הוסף את הפתרונות של 40 אחוז ו- 60 אחוז כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שברי יודקסנול לא צריכים להתערב בשכבות.
באמצעות פיפטה פסטר, שכבת lysate גולמי על גבי 15 אחוז iodixanol שיפוע, טיפה אחר טיפה, כדי למנוע הפרעה הממשק בין ליאזט גולמי פתרון יודיקסנול. מלאו כל צינור אולטרה-מרכזי במאגר תמוגה עד שהמניסקוס יגיע לבסיס צוואר הצינור, כדי להבטיח שהצינור לא יתמוטט תחת הכוחות הגבוהים מאוד הנוצרים במהלך אולטרהצנטריפוגה. סגור את הצינורות באמצעות מכסים מתאימים.
באמצעות סולם דיגיטלי, ודא שלכל שלושת צינורות האולטרה-צנטריפוגה יש משקל זהה. התאמת המשקל לפי הצורך, על ידי הוספת מאגר תזה נוסף על גבי lysate גס. השתמש רוטור טיטניום זווית קבועה כדי צנטריפוגה הצינורות ב 301580 פעמים G ו ב 12 מעלות צלזיוס במשך שעה ו 40 דקות באמצעות תאוצה מקסימלית האטה.
לאחר מכן, חבר מחט למזרק חמישה מיליליטר. הסר את המרחב מן הצינורות רוטור, לשחזר את הצינורות לאחר צנטריפוגליזציה. שאף רק את שבר יודיקסנול 40 אחוז המכיל את החלקיקים הווקטוריים.
או לעבד את המדגם או לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. כאן, הוכח פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לייצר וקטורים AAV עם מגוון רחב של capsids, תצורות הגנום, סוגי האמרגנים, מטענים מהומשים. בדוגמה זו, ייצרנו וטיהרנו שני וקטורים שונים של AAV שהביעו את החלבון הפלואורסצנטי הירוק מהגנום העצמי המשלים.
שני הווקטורים נבדלים על ידי קפציידים שונים:PHPB ו- AAV9. הם נמסרו, באמצעות הזרקת וריד הזנב, לתוך בוגר C57 שישה עכברים שחורים. כדי להעריך את רמות ביטוי הטרנסג'ין שלושה שבועות לאחר ההזרקה, חלקים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים נגד GFP עם זיהוי באמצעות נוגדנים משניים נדונים לצבע פלואורסצנטי.
מדידות עוצמת פלואורסצנטיות מראות עלייה משמעותית בביטוי GFP כאשר וקטור PHPB משמש ביחס AAV9. עליות GFP נצפו במוח הקטן, במוח הקטן, ובמוח. האוסף המדויק של הווקטור המכיל שבר חיוני לפרוטוקול זה.
במקרה זה לא נעשה כראוי, התשואה הווקטורית, כמו גם את טוהר וקטור מושפעים לרעה. להיות מסוגל לייצר וקטורים AAV, מעבדות קטנות יהיה בעמדה לנצל אפשרויות ניסיוניות רבות כדי לספק גנים במערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה דורש שימוש באולטרהצנטריפוגה וחשוב לקבל הכשרה מתאימה לפני הטיפול בזה כדי למנוע תאונות.
יתר על כן, וקטורים AAV מסווגים לעתים קרובות biohazards, ולכן, אתה צריך להתייעץ עם תקנות מקומיות לפני הטיפול וניהול אותם.
