עבודה זו נתמכה על ידי המוח NIH תכנית אב Core מענק (p30 NS057105, BJS) כדי אוניברסיטת וושינגטון, תוכנית פרויקט גרנט NS032636 (BJS) ועל ידי מרכז התקווה הפרעות נוירולוגיות.

1. אריזות של וקטורים lentiviral וקטורים lentiviral המיוצרים על ידי cotransfection של וקטור העברת lentiviral ו פלסמידים אחרים הנדרשים האריזה לתוך התאים 293T בשיטה סידן פוספט transfection. אנו משתמשים 10 100 מ&quot;מ בתרבית רקמה מנות בפרוטוקול זה. זה יכול להיות scaled למעלה או למטה בהתאם יישומים. קו תא 293T נשמרים שונה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM) עם גלוקוז גבוה (4,500 מ&quot;ג / ל &#39;), השלימו עם סרום 10% שור עוברית (FBS), 100 יחידות / מ&quot;ל ​​פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין ב 37 ° C חממה עם 5% CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293T זרעים תאים בכל מפגש 30-40% עד 10 100 מ&quot;מ תרבות מנות רקמות (3 x 10 6 תאים / צלחת) ב בינוני התרבות. להחזיר את התאים חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20-24 שעות תרבות, לבדוק את צפיפות התאים. התאים צריך להיות בערך 80% המפגש בזמן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורית 50 מ&quot;ל. הוסף 4.4 מ&quot;ל TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0.1 מ&quot;מEDTA, pH 7.9) פחות נפח כולל של DNA פלסמיד הבאה. להוסיף 100 מיקרוגרם העברת lentiviral פלסמיד (איור 1), 58 מיקרוגרם pMDLg / pRRE, 31 מיקרוגרם pCMV-G, 25 מיקרוגרם pRSV-Rev, 600 μl 2M CaCl 2. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עוד צינור 50 מ&quot;ל. הוסף 5 מ&quot;ל 2x בהרוורד (0.05 HEPES M, 0.28 M NaCl, 1.5 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, pH 7.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את ה-DNA-CaCl 2 תערובת של 10 מ&quot;ל פיפטה ולהוסיף צינור המכיל 2 x בהרוורד, dropwise תוך vortexing צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תגובה משקעים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הכלים מן התרבות בחממה. מערבבים את התגובה משקעים היטב על ידי vortexing. הוסף 1 מ&quot;ל של השעיה על כל 100 מ&quot;מ המכילים תאים צלחת. ההשעיה יש להוסיף לאט, תוך dropwise בעדינות מתערבל בינוני בצלחת. להחזיר את הכלים ולעזוב את החממה H 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מתרבות. הוסף 6 מ&quot;ל תרבות טרי בינוני המכיל 6 נתרן mM butyrate על כל מאכל. להחזיר את התרבויות כדי חממה. לאחר לילה תרבות, אם יש כתב ניאון לבנות, לבדוק ביטוי גנים כתב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, מעל 80% של התאים לבטא את הגן הכתב אם הוא מונע על ידי האמרגן נמצא בכל מקום (למשל האמרגן CMV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים (40-44 שעות) לאחר transfection, לאסוף supernatant מ -10 מנות לתוך צינורות 2 50 מ&quot;ל (כ - 30 מ&quot;ל כל הצינור). להקפיא את supernatant ב -80 ° C או במקפיא עבור לשלב הבא. </li></ol> 2. ריכוז וטיהור של הווקטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה אסף טרי או מופשר supernatant ב 900 גרם (כ סל&quot;ד 2000) במשך 10 דקות כדי להסיר כל פסולת תא supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק של 60 מ&quot;ל ל-מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק SFCA. העברת supernatant מהצינור 50 מ&quot;ל ל המזרק. סנן supernatant לתוך צינור צנטריפוגות polyallomer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 5 מ&quot;ל סוכרוז 20% (שהוכנה PBS) בתוך פיפטה של ​​5 מ&quot;ל. להכניספיפטה אל החלק התחתון של הצינור צנטריפוגה המכילה supernatant. לאט לאט להוסיף את הפתרון סוכרוז תחת supernatant וקטור. חזור על שלבים אלה עבור supernatant מהצינור אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה supernatant ב 11000 סל&quot;ד ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם הרוטור SW28 הנדנדה Beckman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. הוסף 150 μl לקטוז 4% (להכין PBS) על צינור כל צנטריפוגות. Resuspend את כדורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את וקטור מרוכז מכל צינורות צנטריפוגות כדי צינור 1.5 מ&quot;ל. השאירו את הצינור על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה על ידי וקטור pipetting. להסתובב עם microcentrifuge במלוא המהירות (כ 16000 ז) דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור 1.5 מ&quot;ל חדשה. מחלקים את המדגם הסופי ל -20 aliquots μl ומאחסנים אותם במקפיא -80 ° C. </li></ol> 3. טיטרציה של הווקטורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 5 X 10 4 / היטב HT1080 תאים בצלחת 12-היטב בינוני 1 DMEM מ&quot;ל השלימו עם FBS 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר overnigתרבות HT, לספור תאים מאחד וציון מספר התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 5 פי דילול סדרתי (01:05, 1: 25, 1:125, 1:625 ו) של וקטור מרוכז עם המדיום לתרבות. הוסף אני μl של וקטור כל בדילול מלא לבארות נפרדים. דוגמאות ניתן לשכפל להגדיל את הדיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Polybrene (Hexadimethrine ברומיד) ב וקטור המכיל כל טוב, אל גם בלי וקטור. מערבבים בעדינות את ידי רועדת בצלחת. חזור אל חממה H 48. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות תרבית תאים. לשטוף היטב עם כל PBS. הוסף 250 μl 1x trypsine-EDTA הפתרון התאים. כאשר תאים מנותקים (3-5 דקות), להוסיף 1 מ&quot;ל התרבות בינוני. Resuspend את התאים על ידי pipetting. להעביר את ההשעיה התא 1.5 צינורות צנטריפוגות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת ב 900 גרם של 6 דקות. עבור וקטורים עם הגן כתב ניאון (למשל GFP), עבור לשלב 3.7 לניתוח FACS. עבור וקטורים ללא כתב, עבור לשלב 3.8 עבור QPCR בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור וקטורים המכילים fluoהגן כתב rescent, הסר supernatant ו resuspend גלולה עם 300 μl של פורמלדהיד 3.7% ב PBS. לקבוע את אחוז התאים הכתב חיוביות בניתוח FACS. Titer יהיה מיוצג כיחידות התמרה למיליליטר מרוכזת וקטור (TU / ml). </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" /> לדוגמה, אם 1 x 10 5 תאים היה transduced עם μl 1/25 (0.04 μl) וקטור תאים 30% הם עיתונאי חיובי, titer יהיה: <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" /> השתמש רק דילולים נופלים במערכת יחסים לינארית בין אחוז התאים החיוביים כמות וקטור הוסיף לחשב titer. Titer הסופי צריך להיות הממוצע של המתקבלים titers transductions של לפחות 2 כמויות שונות של וקטור. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור וקטורים ללאהגן הכתב ניאון, לחלץ הדנ&quot;א הגנומי של HT1080 תאים באמצעות QIAamp DNA מיני קיט (Qiagen) לפי הפרוטוקול של היצרן. להגביר את רצף וקטור ב-DNA גנומי באמצעות ABI Prism 7000 זיהוי רצף System (Applied Biosystems) עם פריימרים (באזור ה-HIV-1 PBS / psi 17) 5&#39;-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3 &#39;ו 5&#39;-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3&#39;, ו TaqMan בדיקה 5 &quot;-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-טמרה-3&quot;. הגן אלבומין כי הוא גן עותק יחיד בגנום (2 עותקים / תא) היה מוגבר גם primers 5&#39;-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3 &quot;ו 5&#39;-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3&quot;, ו החללית 5&#39;-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-טמרה-3 &quot;כמו שליטה פנימי. לקבוע את המספרים עותק של וקטור ואלבומין ידי PCR בצלחת 96-גם על פי הוראה של ייצור עם התוכנית הבאה: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ו 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. פי עשרה דילולים סדרתי של פלסמידים של ריכוז ידוע (המיוצג כעותקמספר) המכיל את רצפי תבנית צריך גם להיות מוגבר כדי ליצור עקומת תקן כימות של דגימות לא ידועות. Titer יהיה מיוצג כיחידות אינטגרציה למיליליטר מרוכזת וקטור (IU / ml). </li></ol><img alt="המשוואה 3" src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" /> 4. התמרה של תרבויות הניאוקורטקס תרבויות הניאוקורטקס המכילים שני נוירונים גליה מוכנים מן הקורטקס העכבר באמצעות הליך דו שלבי ציפוי כפי שתואר קודם 18. Neocortices שהתקבלו בעכברים העובר על ההריון 14-16 ימים הם מצופה על monolayer גליה הקימה בעבר MEM השלימו עם 10% FBS, גלוקוז 20 מ&quot;מ ו 2 מ&quot;מ גלוטמין צלחת 24 גם בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים במבחנה, מוסיפים 10 מיקרומטר ציטוסין arabinoside (ערה, ג) ב neocתרבות ortical לעכב שאינם העצבית חלוקת התא. המשך התרבות תאים של 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני התרבות חם 37 ° C אמבט מים למשך 5-10 דקות. החלף ערה-C המכיל בינוני עם בינוני תרבות טרי (500 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף וקטור עם הרצוי משרד הפנים (ריבוי של זיהום, היחס בין מספר החלקיקים וקטור למספר תאים היעד) לתרבות. המשך התרבות עבור H 24. אנו משתמשים משרד הפנים של 1-10 (בדרך כלל 5) בתרבויות קורטיקליים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני עם התרבות בינוני טרי. המשך התרבות. אם יש גן הכתב מבנה וקטור, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 2 ימים לאחר התמרה. ביטוי גנים הכתב יהיה גלוי בנוירונים 2-7 לאחר התמרה, בהתאם לעיצוב וקטור והמנה בשימוש. </li></ol> 5. נציג תוצאות את titers של וקטורים lentiviral מיוצר עם מגוון זה פרוטוקול 8 10 -10 10 IU / mL, whicH מתאימים התמרה של מגוון רחב של סוגי תאים מתוך מערכת העצבים המרכזית הן במבחנה in vivo. טבלה 1, איור 2 מראה תוצאה נציג באמצעות וקטורים המיוצרים על ידי פרוטוקול זה. אנחנו transduced תרבויות שבמוח Murine עם וקטורים lentiviral המבטאים ירוק ניאון חלבון (GFP) הנשלטת על ידי היזם (SYN) synapsin או גליה fibrillary חומצי (GFAP) האמרגן חלבון. שבעה ימים לאחר התמרה, ביצענו immunostaining לנוירונים התווית לבין האסטרוציטים עם נוגדנים נגד NeuN ואנטי GFAP, בהתאמה. כפי שמוצג בטבלה 1, איור. 2 א, אחרי התמרה עם וקטור נושא את האמרגן synapsin, מעל 90% של נוירונים (תאים NeuN +) אקספרס GFP ולא האסטרוציטים (GFAP + תאים) להביע את הגן הזה כתב. כאשר היזם GFAP משמש מבנה וקטור (איור 2 ב), כ -80% האסטרוציטים (GFAP + תאים) הבעהשל ה-GFP, כל + תאים GFP הם האסטרוציטים כפי שאישרה colocalization עם GFAP והיעדר ביטוי GFP בתאים NeuN, שכותרתו. תוצאות אלו מראות כי וקטורים lentiviral יעילים מאוד כדי לספק transgenes לתאים של מערכת העצבים המרכזית של התא ספציפי ביטוי גנים יכולה להיות מושגת כאשר היזמים המתאימים משמשים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של HIV מבוססות וקטורים lentiviral ואת פלסמידים אריזה. Provirus-1-HIV מוצג בחלק העליון. גורמים לייצור וקטור מופרדים לארבע פלסמידים שונים. העברת lentiviral הפלסמיד מכיל LTR היברידית &#39;5 שבו האזור U3 מוחלף ציטומגלווירוס (CMV) האמרגן, האות אריזה (ψ), רצף RRE, מערכת polypurine המרכזית (cPPT), הגן של עניין (לדוגמה: כתב ניאון) יחד עם האמרגן של בחירה, LTR &#39;3 שבורצפים רגולטוריים חבר העמים יוסרו לחלוטין מאזור U3. pMDLg / pRRE מכיל איסור פרסום וגנים pol ורצף RRE מ-HIV-1 בשליטת היזם CMV. pRSV-Rev מכיל את רצף הקידוד של Rev מונע על ידי האמרגן RSV. pCMV-G מכיל את הגן VSV-G חלבון בשליטת היזם CMV. הרשות מציינת את האות polyadenylation מן הגן β-גלובין האדם. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" /> איור 2. הביטוי של גנים הכתב בתרבות העכבר הניאוקורטקס מעורבת transduced עם וקטורים lentiviral שנשאו סוג ספציפי מקדמי סלולריים. התרבויות היו transduced עם LV-SYN-GFP () או LV-GFAP-GFP וקטורים (ב) משרד הפנים של 5. שבעה ימים לאחר התמרה, התאים היו immunostained עם נוגדנים נגד NeuN או נגד GFAP. לוחות העליונות להראות GFP הקרינה, לוחות הביניים מראים immunostaining לוחות נמוכות מתמזגים תמונות (GFP: ירוק NeuN או GFAP: אדום). </p&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> וקטור </td><td> GFP + תאים נוירונים </td><td> GFP + ב האסטרוציטים </td></tr><tr><td> LV-SYN-GFP </td><td> 92.2 ± 7.3 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> LV-GFAP-GFP </td><td> 0 </td><td> 78.3 ± 11.5 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. השוואה בין ביטוי של GFP בתרבויות שבמוח Murine transduced עם וקטורים lentiviral נושאים שונים כמה יזמים. תרבויות כמה שבמוח Murine (5 X 10 5/24 טוב גם צלחת) היו transduced עם LV-SYN-GFP או LV-GFAP-GFP על משרד הפנים 5. שבעה ימים לאחר התמרה, תרבויות קובעו immunostained עבור NeuN או GFAP. מספר התאים ה-GFP ו NeuN / GFAP המבטאים נמנו תמונות 10 שדות בכל תנאי הניסוי. הערכים מייצגים את האחוז של נוירונים (תאים NeuN +) אוהאסטרוציטים (GFAP + תאים), אשר הביע את הגן כתב ה-GFP. הערכים המוצגים הם ממוצעים ± סטיית תקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים.

<ol>
	<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery.">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).</li><li>Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-promoter+lentiviral+vectors+for+constitutive+and+regulated+gene+expression+in+neurons.">Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).</li><li>Hioki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transduction+of+neurons+by+lentivirus+with+enhanced+neuron-specific+promoters.">Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters.</a> Gene Ther. 14, 872-882 (2007).</li><li>Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+promoter+usage+for+lentiviral+vector-mediated+transduction+of+cultured+central+nervous+system+cells.">Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells.</a> J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Blomer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector.">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).</li><li>Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+transgene+expression+in+rat+brain+using+lentiviral+vectors.">Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors.</a> J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).</li><li>Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-activator+gene+of+human+T-lymphotropic+virus+type+III+(HTLV-III).">Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III).</a> Science. 229, 69-73 (1985).</li><li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+immunodeficiency+virus+type-1+central+DNA+flap+is+a+crucial+determinant+for+lentiviral+vector+nuclear+import+and+gene+transduction+of+human+hematopoietic+stem+cells.">The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 96, 4103-4110 (2000).</li><li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors:+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells.">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).</li><li>Farson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new-generation+stable+inducible+packaging+cell+line+for+lentiviral+vectors.">A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).</li><li>Broussau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).</li><li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titering+lentiviral+vectors:+comparison+of+DNA,+RNA+and+marker+expression+methods.">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).</li><li>Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+heat+stress+reduces+excitotoxic+and+apoptotic+components+of+oxygen-glucose+deprivation-induced+neuronal+death+in+vitro.">Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro.</a> J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).</li><li>Mazarakis, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+virus+glycoprotein+pseudotyping+of+lentiviral+vectors+enables+retrograde+axonal+transport+and+access+to+the+nervous+system+after+peripheral+delivery.">Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery.</a> Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).</li><li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-specific+gene+transfer+through+retrograde+transport+of+lentiviral+vector+pseudotyped+with+a+novel+type+of+fusion+envelope+glycoprotein.">Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).</li><li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production.">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li><li>Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+production+and+concentration+of+HIV-1-based+lentiviral+vectors+using+HYPERFlask+vessels+and+anion+exchange+membrane+chromatography.">Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography.</a> BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).</li><li>Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulation+of+HIV-1+gene+expression:+a+novel+mechanism+of+induction+independent+of+NF-kappa+B.">Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B.</a> J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).</li><li>Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+efficient+production+and+transduction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+vectors.">Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors.</a> J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).</li><li>Palsson, B., Andreadis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physico-chemical+factors+that+govern+retrovirus-mediated+gene+transfer.">The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer.</a> Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-{kappa}B+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats.">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li><li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoters+and+serotypes:+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo.">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בפרוטוקול זה, הראינו את הייצור של וקטורים lentiviral ויישום של וקטורים אלה בתרבויות המוח. הראינו יעיל תא סוג ספציפי התמרה עם וקטורים המיוצרים בשיטות אלה. כאשר היזם synapsin משמש, ביטוי של GFP הוא בהחלט נוירון מסוים. כאשר היזם GFAP משמש, ביטוי של GFP הוא אך ורק האסטרוציטים. אם לא ביטוי סוג ספציפי התא נדרש, האמרגן בכל מקום ניתן להשתמש. מצאנו גם ubiqutin ו קינאז phosphoglycerate (PGK) מקדמי יכול לנהוג ביטוי גבוהה רמת גן בתרבויות שבמוח 6. ביטוי גנים מונע על ידי וקטורים lentiviral יכול להיות מותאם אישית עבור רמות ספציפיות של סוגי ביטוי או תאים מתוך בחירה של יזמים (לדוגמה, בכל מקום או תאים מסוג מסוים) או באמצעות חלבוני מעטפת שונים או pseudotypes וקטור למקד רקמות ספציפיות או יישומים. לדוגמה, pseudotyping עם חלבון G כלבת או שילוב של VSV-Gחלבון ד כלבת תומך תחבורה axonal מדרדר 19,20. פרוטוקול transfection חולף מאפשר אריזה וקטור עם חלבונים שונים המעטפה. וקטורים lentiviral מרוכזים בדרך כלל ללא צעדים טיהור ידי ultracentrifugation. אלו וקטורים unpurified מתאימים סוגי תאים רבים. עם זאת, תרבויות עצביים העיקריים הם רגישים מזהמים מתאי המפיק, וכתוצאה מכך אצווה כדי אצווה וריאציה על cytotoxicity. כרית 20% סוכרוז צעד טיהור עושה את דרכי באופן עקבי רעיל בנוירונים ראשוניים. אנו ממליצים להשתמש וקטורים מטוהרים עבור התמרה של נוירונים יסודיים ושל זריקה לתוך בעלי החיים. אם בקנה מידה גדול יותר או הטוהר גבוהה יותר של ההכנות וקטור נדרשים, טכניקות טיהור אחרים, כגון זיקה כרומטוגרפיה 21 וחילופי אניון קרום כרומטוגרפיה 22 ניתן להשתמש. לטווח ארוך התמרה נדרש בדרך כלל בתרבויות עצביים העיקריים, זהירות מיוחדת יש לנקוט כדי לצמצם את זיהום במהלך הכנת את הווקטורים. עובר supernatant וקטור עם מסנן מיקרומטר 0.2 ושימוש autoclavable צנטריפוגות צינורות polyallomer במהלך הריכוז של וקטור ישרת מטרה זו. הבקבוק העליון מסננים ניתן להשתמש אם כמות גדולה של supernatant צריך להיות מסונן. בוטיראט נתרן דווחה כדי לעורר את הפעילות של מקדמי 23. תוספת של סודיום בוטיראט עד בינוני לאחר transfection התרבות של תאים המפיק יכולים להגדיל את titer וקטור יותר מ -10 קפלי 24. Polybrene (hexadimethrine ברומיד) נמצאת בשימוש נרחב עבור פרוטוקולי העברת גנים כדי להגביר את היעילות של העברת גנים retroviral ידי ניטרול המטענים השליליים, ובכך להקל על וקטורים תא האינטראקציה 25. בידינו, polybrene רעיל הנוירונים בתרביות המוח. לכן, polybrene יש להימנע transducing תרבויות עצביים העיקריים. אם ישכתב ניאון בווקטור, נוח לקבוע titer וקטור ידי ניתוח FACS. כאשר הכתב לא זמין או גן הכתב הוא מונע על ידי QPCR ספציפי רקמות, האמרגן לאיתור שילוב של וקטור בתאי היעד צריך להיות בחירה טובה יותר כמו שילוב של וקטור אינה תלויה ביטוי transgene. כייל של וקטורים ספציפיות שנקבעו על ידי ניתוח FACS יהיה נמוך מזה של QPCR כמו שלא כל העותקים משולבת של וקטור הם פונקציונליים. Titers וקטור יכול גם להיקבע על ידי מדידת חלבון p24 HIV על ידי ELESA או וקטור RNA הגנומי של qRT-PCR בהכנות וקטור. עם זאת, שיטות אלו פחות מדויק בשל מספר משמעותי של חלקיקים נגיפיים פגומים שנוצרו באופן בלתי נמנע בתהליך האריזה חלקיקים תפקודית שאינם בהצלחה transduce תאים היעד 26. הווקטורים שנעשו על ידי פרוטוקול זה שימשו בהצלחה ro הן במבחנה in vivoשקע המוח 27. החוקרים צריכים לבדוק במערכות שלהם בנפרד, כמו וקטור בתיווך ביטוי גנים אינו זהה בהכרח בתרביות תאים והן מערכות ב vivo אפילו סוג התא אותו 6,28. וקטורים lentiviral היה בשימוש נרחב עבור overexpressing או להרוס את הגנים של עניין במגוון רחב של סוגי תאים של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול שלנו צריך להיות מועיל עבור חוקרי מדעי המוח לפתח וקטורים lentiviral ביישומים המחקר שלהם.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Hyclone </td><td> SV3001403 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CM </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3924 </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Hexadimethrine ברומיד (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> 293T תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td></tr><tr><td> HT1080 תאים </td><td> ATCC </td><td> CCL-121 </td></tr><tr><td> פלקון 100 x 20 מ&quot;מ רקמת תרבותה מנה </td><td> BD Biosciences </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 1 x 3 ½ בצינור צנטריפוגות polyallomoer </td><td> Beckman Coulter- </td><td> 326823 </td></tr><tr><td> 0.2 מיקרון המסנן המזרק </td><td> קורנינג </td><td> 431219 </td></tr><tr><td> QIAamp DNA מיני קיט </td><td> Qiagen </td><td> 51304 </td></tr></tbody></table>

production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System at JoVE.com

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים אחרים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt;.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.9K Views.  Washington University School of Medicine. בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים אחרים במבחנה ו In vivo.

Video: Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

תרופות משלוח מערכתית מקומי לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית מודלים מכרסמים

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

משלוח פנימי של אנטי-סנס וליגונו, במערכת העצבים המרכזית של חולדה

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...