Bu protokolü izleyerek, kullanıcı in vitro veya in vivo uygulamalar için uygun yüksek saflıkta ve verim AAV vektörleri üretmek mümkün olacak. Bu protokol, yapılandırmafarklılıkları olan bir dizi AAV serotipüretmek ve arındırmak için kullanılabilir. Bu iki unsuru nbirle birleştirmek hücre tipi ve dokuya özgü ifade elde etmek için yararlı olabilir.
Bazı serotiplerin üretimi daha düşük verim verebilir. Bu üretim, yakın serotiplerin olduğu ve bireysel bazda değerlendirilmesi gereken üretimdir. Bu prosedürleri gösteren Shelly Fripont, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.
HEK hücrelerini büyüttükten sonra, 360 mikrogram yardımcı plazmid, vektör capsid'i kodlayan 180 mikrogram plazmid ve 180 mikrogram plazmid içeren transgeni 18 mililitre 150 milimoler sodyum klorür ile karıştırın. Üç 50 mililitre konik tüpler üzerinde bu karışımı dağıtın. Yeni bir konik tüp, altı hücre kültürü yemekleri için PEI karışımı hazırlamak için PEI ve 150 milimolar sodyum klorür altı mililitre 840 mikrogram karıştırın.
Sonra, DNA karışımı içeren konik tüpler birine, damla damla, PEI karışımı altı mililitre ekleyin. 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Sonra, kuluçka makinesinden altı hücre kültürü yemeği çıkarın.
Bir laminar akış kaputunda, her tabaktan ortayı tamamen aspire edin. Ortamın izlerini gidermek için bulaşıkları beş mililitre önceden ısıtılmış DPBS ile durula. DPBS'nin tüm yüzeye eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak için her yemeği yavaşça yatırın.
Daha sonra DPBS'yi nazikçe aspire edin. Her çanağa yavaş yavaş 12 mililitre DMEM ekleyin ve yemeğin kenarına bir pipet yerleştirin. PEI ve DNA karışımını 3-5 kez yukarı ve aşağı boruile karıştırın.
Bu karışımın her altı hücre kültürü yemekleri bir damla damla moda, dikkatle tüm yüzeye dağıtmak için emin olun iki mililitre ekleyin. 18 hücre kültürü yemekleri ulaşana kadar bir seferde altı hücre kültürü yemekleri kullanarak bu işlemi tekrarlayın. PEI DNA karışımını dağıtmak için hücre kültürünü hafifçe sallayın.
Transfected hücreleri 37 santigrat derecede yüzde 95 nem ve yüzde beş karbondioksit ile beş saat boyunca kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, önceden varolan ortamı çıkarmadan 18 yemeğin her birine 12 mililitre DMEM 10 ekleyin. Transfected hücreleri aynı koşullarda kuluçkaya yatırmaya devam edin.
Transfeksiyon sonrası 72 saat, hücreleri her kültür kabından dikkatlice ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Buz üzerinde tutulan 15 mililitrelik konik bir tüp içinde orta ve iki kültür yemekleri hücreleri toplamak. Tüpleri 420 kez G'de ve 4 derece santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve santrifüjün hızlanması ve yavaşlaması maksimuma ayarlayın.
Dikkatle bir atık bertaraf kabına yavaşça dökerek her tüpten supernatant atın. Daha sonra, hücre peletlerini içeren tüpleri buzüzerine yerleştirin. Biz lysis tampon iki mililitre her pelet askıya ve yukarı ve aşağı 5-10 kez pipetleme tarafından karıştırın.
AAV'yi üç tüpten birlikte çekin. Başlamak için, etanol ile karışık kuru buz içeren bir kova yerleştirerek yeniden askıya hücreleri dondurun. Sonra hemen 37 santigrat derece ayarlanmış bir su banyosu yerleştirerek hücreleri eritin.
Hücreleri lyse ve AAV parçacıkları serbest bırakmak için bu dondurma ve çözülme döngüsü üç kez tekrarlayın. Üçüncü erime adımından sonra, santrifüj 1167 kez G ve dört derece santigrat 15 dakika. 50 mililitrelik konik tüpleri temizlemek için süpernatantları dikkatlice aktarın.
Supernatant mililitre başına 50 birim lik son konsantrasyona her tüpe nükleaz ekleyin. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, çekirdekten süpernatant ile iyice karıştırıldığından emin olmak için tüpleri her 10 dakikada bir döndürün. Santrifüj 13490 kez G ve dört derece santigrat 20 dakika supernatant açıklığa kavuşturmak için.
Bundan sonra, 10 mililitrelik şırınganın pistini çıkarın, şırıngaya 0,45 mikrometrelik bir filtre takın ve temiz bir 50 mililitrelik konik tüpün üzerine yerleştirin. Şırıngayı açıklıklı supernatant ile dikkatlice doldurun. Filtreden lysate zorlamak için piston kullanın.
Daha sonra, metin protokolütabloda belirtildiği gibi, dört ayrı 50 mililitre konik tüpler, iodixanol fraksiyonları her birini hazırlamak. Pipet üç ultracentrifuge tüplerin her içine yüzde 15 iodixanol sekiz mililitre. Pipet 5.5 mililitre yüzde 25 iyodixanol temiz bir 50 mililitre konik tüp içine.
Mezun olmayan pasteur pipet kullanarak, yüzde 15 iodixanol çözeltisi altında yüzde 25 iyodixanol çözeltisi dikkatle katman 5.5 mililitre. Metin protokolünde açıklandığı gibi yüzde 40 ve yüzde 60 çözümleri ekleyin. Iodixanol fraksiyonları katmanlama üzerinde intermix olmamalıdır.
Pasteur pipeti kullanarak, kaba lysate ve iodixanol çözeltisi arasındaki arayüzü rahatsız önlemek için, damla damla, yüzde 15 iodixanol gradyan üstüne kaba lysate katman. Menisküs tüp boynunun tabanına ulaşana kadar her ultracentrifugation tüpünü lysis tamponuyla doldurun, böylece tüpün ultrasantrifüj sırasında oluşan çok yüksek kuvvetler altında çökmemesini sağlayın. Tüpleri uygun kapakları kullanarak kapatın.
Dijital ölçek kullanarak, üç ultracentrifugation tüpün de aynı ağırlıkta olduğundan emin olun. Ağırlığı gerektiği gibi ayarlamak, kaba lysate üstüne daha fazla lysis tampon ekleyerek. Maksimum hızlanma ve yavaşlama kullanarak tüpleri 301580 kez G ve 12 santigrat derecede bir saat 40 dakika santrifüj etmek için sabit açılı titanyum rotor kullanın.
Sonra, beş mililitrelik şırıngaya iğne batırın. Rotordaki tüplerden boşluk çıkarın ve santrifüj den sonra tüpleri geri. Vektör parçacıkları içeren sadece yüzde 40 iyodixanol fraksiyonu aspire.
Örneği ya işleyin ya da dört santigrat derecede saklayın. Burada, çeşitli kapsidler, genom konfigürasyonları, organizatör tipleri ve transgen kargoları ile AAV vektörleri üretmek için kullanılabilen bir protokol gösterilmiştir. Bu örnekte, yeşil floresan proteini kendi kendine ücretsiz bir genomdan ifade eden iki farklı AAV vektörü üretti kildi ve saflaştırdık.
İki vektör farklı kapsidler ile ayırt edilir: PHPB ve AAV9. Onlar, kuyruk damar enjeksiyonu yoluyla, yetişkin C57 siyah altı fareler içine teslim edildi. Enjeksiyon dan üç hafta sonra transjen ekspresyon düzeylerini değerlendirmek için, kesitler flüoresan boyaya konjuge sekonder antikorlar kullanılarak saptanarak GFP'ye karşı primer antikorlarla boyanır.
Floresan yoğunluğu ölçümleri PHPB vektörü AAV9'a göre kullanıldığında GFP ekspresyonunda önemli bir artış olduğunu göstermektedir. GFP'de beyin, beyincik ve beyin sapında artış lar gözlendi. Fraksiyon içeren vektörün doğru toplanması bu protokol için çok önemlidir.
Bu düzgün yapılmazsa, vektör verimi ve vektör saflığı olumsuz etkilenir. AAV vektörleri üretebilen küçük laboratuvarlar, merkezi sinir sistemindegenleri teslim etmek için çok sayıda deneysel olanaktan yararlanabilecek konumda olacaktır. Bu protokol bir ultracentrifuge kullanımını gerektirir ve kazaları önlemek için bu işleme önce uygun eğitim almak önemlidir.
Ayrıca, AAV vektörleri genellikle biyolojik tehlike olarak sınıflandırılır ve bu nedenle, bunları işleme ve yönetmeden önce yerel düzenlemelere danışmalısınız.
