פרוטוקול זה מתאר טכניקת פלטפורמה לבידוד תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים משרירי השלד. תאים אלה יכולים לשמש, למשל, כדי לקבל תובנות נוספות על תפקודי מחסום שריר הדם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן לבודד תאים אנדותל microvascular ראשי עם טוהר גבוה.
טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות שרירים מתווכות במערכת החיסון כגון האינטראקציה בין תאים שרירים אנדותל בבריאות ומחלות. ראשית, הכינו את כל הפתרונות הדרושים וצלחות שש בארות כמתואר בפרוטוקול. כדי להתחיל את ההליך המעשי, להשיג זוג מספריים חדים / קהים כירורגית, זוג מספריים חדים / חדים כירורגיים, ומדפים ישרים ומעוקלים.
לחטא את כל המכשירים הכירורגיים עם 70% אתנול. מקם עכבר זכר בוגר המתת ים על גבו ולהרים את הרגליים עם 70% אתנול. בעזרת המספריים הכירורגיים החדים/קהים, יש לנתק כל רגל שלמה על-ידי חיתוך במפרק הירך.
מניחים את גפיים בצלחת תרבות תא סגור. מעבירים את המנה למכסה המנוע של לזרימת למינאר סטרילית. השתמש מספריים חדים מדפים מעוגלים לחתוך את העור פתוח מן הירך לקצה של בוהן.
השתמש במטחנים ישר להחזיק את בוהן או כרית כף הרגל תוך שימוש במקלפים מעוקל לקלף את העור מן בוהן אל הירך. כדי לבודד את השרירים quadriceps femoris, לחתוך את הגיד מן הברך, ולנתק את השריר לאורך עצם הירך אל הירך. נתק את גיד אכילס כדי לבודד את triceps השלד והשריבה surae.
לאחר מכן, לחתוך לאורך השוקה לאפוסה popliteal ולהסיר את השריר. כדי להסיר גידים אשר לא ניתן לנתק, להחזיק את השרירים עם מדפים מעוגלים לחתוך כל גיד מתאים. הוסיפו 2, 445 מיקרוליטרים של פתרון עיכול מוכן לצלחת תרבות תאים טרייה עם תווית וקובעים את המשקל.
מעבירים את כל חתיכות השרירים לצלחת זו. לאחר מכן, לקבוע את המשקל. ההבדל בין שני הערכים הנמדדים מספק את המשקל היבש של רקמת השריר אשר לא יעלה על גרם אחד.
באמצעות מספריים חדים כירורגית, לחתוך את כל רקמת השריר לחתיכות קטנות. דגירה ההשעיה רקמה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 1.5 שעות, הקפד לערבב את ההשעיה בזהירות עם מזרק אינסולין מיליליטר כל 20 דקות במשך כחמש דקות. לאחר הדגירה, להעביר את ההשעיה מסננת ניילון 70 מיקרומטר להציב על צינור 50 מיליליטר שכותרתו ולאסוף את הזרימה דרך.
לשטוף את מסננת התא עם שמונה מיליליטר של DMEM ולאסוף את הזרימה דרך. אם החלקים מחברים את מסננת, תן שימוש חוזר בפתרון המנותק. השליכו את מסננת התאים וצנטריפוגה את ההשעיה בכבידה של פי 300 וב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר אשלגן אמוניום כלורי lysing עבור תזה של כדוריות דם אדומות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסף תשעה מיליליטר של DMEM המכיל 10%FCS כדי לעצור את התגובה.
העבר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בתא ספירת תאים של Neubauer כדי לקבוע את מספרי התאים. כדי להתחיל לרוקן את התאים החיוביים CD45, צנטריפוגה ההשעיה ב 300 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על גלולת התא ב-90 מיקרוליטרים של מאגר MCS. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של חיידקי CD45 ומערבבים את ההשעיה. דגירה במקרר בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מאגר MCS. צנטריפוגה בכבידה של פי 300 וב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על התאים ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר MCS.
מקם עמוד מגנטי גדול בשדה המגנטי של המפריד. שטפו את מאגר העמודות בשלושה מיליליטר של מאגר MCS. לאחר מכן, מניחים צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לעמודה כדי לאסוף את הזרימה דרך.
החל את כל ההשעיה התא על העמודה ולתת לו לזרום דרך לחלוטין. לשטוף את העמודה שלוש פעמים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מאגר MCS לתוך המאגר עבור כל שלב כביסה והמתנה עד המאגר של העמוד ריק לפני תחילת שלב הכביסה הבא. אסוף את התאים ללא תריס העוברים בעמודה לשימוש בשלבי הפרדה נוספים.
כדי להתחיל לצבור תאים חיוביים ל- CD31, השתמש בתא ספירת תאים של Neubauer כדי לקבוע את מספרי התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ללא תכלית ב 300 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על גלולה ב 90 microliters של מאגר MCS.
מוסיפים 10 מיקרוליטרים של חיידקי CD31 ומערבבים את כל ההשעיה. דגירה במקרר בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ MCS וצנטריפוגה ב 300 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר MCS. מקם את העמודה המגנטית הבינונית בשדה המגנטי של המפריד. שטפו את העמודה ב-500 מיקרוליטרים של מאגר MCS.
לאחר מכן, מניחים צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לעמודה כדי לאסוף את הזרימה דרך. החל את ההשעיה של התא כולו על העמודה ולתת לו לזרום לחלוטין דרך. שטפו את העמודה שלוש פעמים על-ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של מאגר MCS למאגר עבור כל שלב כביסה, והמתינו עד שהמאגר של העמוד יתרוקן לפני שתתחילו את שלב הכביסה הבא.
תאים ללא שם העוברים בעמודה מייצגים את השבר CD45 שלילי, CD31 שלילי. אחסן אותם לפקדי איכות נוספים. לאחר מכן, הסר את העמודה מהמפריד והצב אותה על צינור איסוף מתאים.
פיפטה שני מיליליטר של מאגר MCS על העמודה. מיד לדחוף את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים המסווים מגנטית. שבר CD45 שלילי וחיובי זה של CD31 מייצג את מחשבי ה- ECs המועשרים הראשיים של Murine.
צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 פעמים כבידה ב 20 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על התאים במיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל. מעבירים את התאים ל הבאר אחת של צלחת תרבות מצופה שש בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל.
לטיפוח, חגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני באינקובטור סטרילי, הקפדה לרענן את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. כאשר התאים הם ב 80 עד 90%confluence, לשטוף כל גם המכיל תאים פעמיים עם שני מיליליטר של PBS בשני שלבי כביסה רצופים. לאחר מכן, להוסיף 800 microliters של פתרון EDTA טריפסין לכל באר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני באינקובטור סטרילי במשך שלוש עד חמש דקות.
לאחר מכן, הוסף 1, 200 מיקרוליטרים של DMEM המכילים לפחות 10% FCS כדי לעצור את הפעילות האנזימטית. צנטריפוגה בכבידה של פי 350 וב-20 מעלות צלזיוס לחמש דקות. לאחר מכן, לצבור את התאים CD31 כפי שתואר קודם לכן כדי להגדיל את הטוהר.
השתמש בשדה בהיר או במיקרוסקופ חוזה פאזה סטנדרטי עם הגדלה של 20% וצמצם מספרי של עדשה 0.35 כדי לצפות בהתכנסות התאים. במחקר זה, תאי הדם המיקרו-וסקולריים העיקריים של שריר המורין מבודדים. יום אחד לאחר הבידוד, MMECs מורין ראשוני שאריות תאים אחרים יוצרים קונגלומרטים לדבוק בתחתית מנות תרבות.
מהיום השביעי ואילך, תאים שטוחים ומוארכים ניתן לראות, עם זאת, זיהום של תאים אחרים, בעיקר כדורית עדיין גלוי. לכן, מחזור נוסף של בחירה חיובית CD31 באמצעות MCS נדרש. להלן, MMECs מורין הראשי להתרבות לצפיפות של כ 80 עד 90% על confluence, הם בדרך כלל יוצרים מונוליאר לא חופף של תאים מיושרים אורך.
התפשטות מפסיקה עם ההתכנסות עקב עיכוב מגע. בקרת איכות באמצעות ציטומטריית זרימה מציגה ערכים הן עבור הכדאיות והן עבור טוהר הנעים סביב 70% כל אחד עבור תאים מיד לאחר הבידוד. תאים המעובדים לאחר בחירה חיובית נוספת של CD31 באמצעות MCS מציגים ערכים מספקים לטוהר ולכדאיות, החל מ- 95% כל אחד.
תאים שהושגו נחקרים לאחר מכן על ביטוי הגנים של גנים סמן תא לווין שריר מזווג חלבון תיבת 7 ו M-cadherin על רמת mRNA על ידי PCR כמותי. כצפוי, רק השבר CD45 שלילי, CD31 שלילי, כמו גם תאי שריר מורין ראשוניים מבודלים מבוטא חלבון תיבת 7 ו- M-cadherin, ואילו CD45 שלילי, CD31 חיובי MMECs מורין העיקריים הם שליליים עבור סמנים אלה. לאחר השלב השני של CD31 MCS, qPCR משמש להערכת הביטוי של חלבוני צומת הדוקים ב- MMECs מורין ראשוניים.
MMECs מורין ראשי נראים להביע רמות גבוהות של קלודין-5, occludin, ו זונולה occludens-1, ואילו PMMC רק להראות ביטוי נמוך של זונולה occludens-1. טכניקה זו יכולה להתבצע בחמש עד שש שעות. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות הגירה או ניסויי לחץ בהגיה נמוכה כדי לענות על שאלות נוספות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד תאים אנדותל microvascular ראשוני שרירי השלד על ידי מכונאי דיסוציאציה אנזימטית ומיון תאים מגנטיים.
