ברצוננו להודות מארק ווזניאק לסיוע וידאו. אנו רוצים גם להודות שון מוריסון ב UT Southwestern בפרוטוקול המקורי של עכברים לתאים culturing NC. עבודה זו נתמכה הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט מרכז התמיכה של תוכנית אקדמית על ידי תרומות של NIH (HD36720 HD036720 ו-11S109) ו 11GRNT7690040 AHA ל PAL, מלגות predoctoral של AHA (0615209B) ו-NIH (NS065604) לווייטנאם, היה ה-ERP נתמך על ידי מתן הכשרה NIH T32HD007502.

1. הכנת פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה סטרילית בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fibronectin (FN) על ידי דילול 100 μL מלאי אדם FN פלזמה לתוך נפח סופי של 3.3 מ&quot;ל ב PBS Dulbecco של (dPBS). הריכוז הסופי הוא 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​וזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים תחתית של כל אחד בצלחת סטרילית התרבות 4 רקמות היטב עם פתרון FN ולתת לשבת במשך 15 דקות. ודא את כל פני השטח מכוסה. הפוך את התקשורת במהלך תקופה זו (שלבים 2 ו -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחוץ Fn פתרון ולאפשר צלחות לייבוש. בעדינות ולשטוף בארות עם 500 DMEM μL, הסר DMEM, ולהוסיף 500 μL של התחדשות עצמית (SR) בינוני (ראו להלן). דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכילה 5 אחוז CO 2. להשלים כשעה לפני החיתוך כך הצלחות יהיה יבש לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנת בינוני SR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות של NC מחנק והגומתוך עשרה עוברי (כ 1 המלטה, בהתאם לרקע הגנטי של הקו העכבר), להכין 25 מ&quot;ל של מדיום SR. שלב 12.5 מ&quot;ל גלוקוז נמוכה DMEM, 7.5 מ&quot;ל Neurobasal בינוני, 25 חומצה retinoic μL (117 מיקרומטר הריכוז הסופי), ו 25 μL 2-mercaptoethanol (50 mM הריכוז הסופי). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף צ&#39;יק 3.75 מ&quot;ל תמצית העובר, 250 μL N 2 תוספת מלח, 500 μL תוסף B27 ו 250 μL פניצילין, סטרפטומיצין (הריכוז הסופי 1%). סינון בינונית דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 IGF1 סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ריכוז סופי) ו - 20 bFGF סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בריכוז הסופי). מערבבים על ידי היפוך. לאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 3. הכנת בינוני Wash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כ 10 עוברים להכין 50 מ&quot;ל של מדיום שטיפה. שלב 50 מ&quot;ג BSA עם 35 מ&quot;ל גלוקוז DMEM נמוך, בינוני 15 מ&quot;ל Neurobasal, ו 500 μL פניצילין, סטרפטומיצין (1% ריכוז סופי). מסנן סטריליים עם 0.22מיקרומטר הסינון. </li></ol> 4. הכנת collagenase / dispase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase / dispase עד 5 dPBS מ&quot;ל. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק מסנן עם 0.2 מיקרומטר לסנן ולהוסיף 1.5 מ&quot;ל לתוך כל אחת משלוש הבארות של צלחת 12 באר. פיפטה כ 1 מ&quot;ל בינוני לשטוף את הבארות הנותרות. אחסן את כל הצלחת על הקרח עד מוכנים לעכל את הרקמה גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור קצות קצה פיפטה P20 ו p1000 מסנן בסכין גילוח סטרילית. גזור מתחת הקצה המחודד של קצה. לחתוך את p1000 ישמש להעביר את העובר כולו תוך P20 ישמש להעברת פיסות רקמה מבודדת. </li></ol> 5. בידוד מחנק צינור Trunk עצבית מ 9.5 עוברים DPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הריונות זמן קבועים, סכרים עם תקע הנרתיק נחשבים 0.5 DPC בצהריים בבוקר תקע הוא ציין. להקריב את ולהסיר את הרחם ב 9.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את decidua מהרחם בעדינות Remove העובר מן decidua. חוויתי פעם אחת עם פרוטוקול זה, לבודד 3-4 9.5 עוברים DPC בכל פעם dPBS סטריליים. השתמש בטכניקה סטרילית ומכשירים הנתיחה מעוקרות. מכשירים ניתן לעקר על ידי עיקור, מעוקר חום או דגירה של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקדמי מחנק NC: באמצעות מחטים אינסולין, לחתוך את הצינור העצבי על placode otic באמצע. חותכים שוב בקצה האחורי של somite 4 ה. חתוך הרקמה הגחון כדי הצינור העצבי להסיר את הקשתות הגרון והלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור NC הגזע: באמצעות מחטים אינסולין, להסיר את החלק של הצינור העצבי בין somites 16-22 (או somite האחרון אם הם עוברים שלב התפתחותי מוקדם יותר מאשר 22 somite). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את שק החלמון וכל רקמה עוברית הנותרים עבור genotyping. </li></ol> 6. הסרת האאקטודרם ללא עצבית והמזודרם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצינור העצבי המכיל קטעים לתוך collagenase / dispase בטמפרטורת החדר למשך 10 דקותs. מיד לשטוף בינוני לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור רקמות dPBS סטריליים. שימוש במחטים סטריליות אינסולין, הוצא בעדינות האאקטודרם לא העצבית מרקמת ולהפריד את somites מן הצינור העצבי. החלקים האחרונים של והמזודרם מרקמות somite ניתן להסיר על ידי triturating בעדינות באמצעות חתך למטה P20 עצה. להיזהר לא לפגוע בצינור העצבי. להתבונן מקרוב במהלך טחינה דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור העצבי מבודד באמצעות שטיפה 2 ו 3 2 30 בינוני לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם בינוני SR, ומקום בצינור העצבי מבודד למרכז גם FN מצופה שהוכנה קודם לכן (שלב 1.3). ללחלח את החדר היפוקסיה עם צלחת של מים סטריליים. מניחים את הצלחת לתוך תא היפוקסיה ולשטוף את החדר בגז מעורבת על 3% O 2 (להשתמש במיכל המכיל תערובת של 1% מ 2, 6% CO 2, 93% N 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד להתמודד עם הקאמרית מאוד בזהירות כדי להבטיח thaexplants T הם באין מפריע ולהישאר במרכז וולס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 ° C. סיכום של צעדים 5-6 מוצג באיור 1. </li></ol> 7. הסרת בצינור העצבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, הסר בצינור העצבי על ידי בעדינות מתגרה קצה הצינור העצבי מן התאים הנודדות באמצעות מחט סטרילית אינסולין. הסר וזורקים בצינור העצבי ממדיום באמצעות חתך P20 סטרילית כמו בשלב 6.2 ולהחליף בינוני עם בינוני SR טרי (איור 2). הדבר נעשה בקלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. </li></ol> 8. נציג תוצאות לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס בתנאי חוסר חמצן, תאים צפון קרוליינה היגרו מן הצינור העצבי באוכלוסייה טהור כמעט (איור 3 א). לפעמים, פחות תרבויות אידיאליים לא תניב בצמחים חזקים. לדוגמה, ייתכן כי לאחר 24 שעות לאהוא בצינור העצבי יהיה מכורבל על עצמה ו NC לא יעברו מן הצינור העצבי (איור 3 ב). מדי פעם בצינור העצבי לא יצרף את הצלחות מצופה fibronectin. מניסיוננו, תת אופטימלית הגירה NC או בעיות עם החיבור של הצינור העצבי יכול להיות מושפע לרעה בתנאי normoxia או ריכוז של fibronectin, בהתאמה. הפעילות האנזימטית של collagenase / dispase משתנה מעט על ידי אצווה זמן עיכול חייב להיות מותאם כראוי, לעומת זאת, לא לעכל את הרקמה יותר מרבע שעה. Overdigestion של הצינור העצבי המכיל רקמות collagenase / dispase תגרור בצמחים לקויה. אם הרקמה somite לא יוסר בקלות לאחר דגירה של collagenase / dispase של הצינור העצבי, הצינור העצבי ניתן מודגרות למשך זמן ארוך יותר מעשר דקות. לפעמים בצינור העצבי לא לצרף המצע. אם זה המקרה, בדוק fibronecפח ריכוז ותנאי חוסר חמצן. למרות התנאים normoxic ניתן wild-type תרבות NC, תנאי חוסר חמצן לחקות באופן הדוק יותר בסביבה vivo 29,30. מניסיוננו, בתנאי חוסר חמצן הפכה קריטית כאשר culturing מוטציה NC. לדוגמה, כאשר Foxd3 מוטציה NC היו בתרבית בתנאים normoxic, היה המטען NC תוצאה תא הקטינה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת. פער זה בגודל תוצאה הוסר כאשר explants היו בתרבית בתנאי חוסר חמצן (איור 4). יתר על כן, כאשר wild-type explants בצינור העצבי היה מתורבת normoxia, מספר caspase-חיוביים בתאים היה גדול יותר מזה של explants דומים בתרבית היפוקסיה (מידע לא מוצג). על ידי שמירה על כל התרבות NC ב היפוקסיה, השוואות יכולים יותר בקלות בין הדינמיקה של שליטה ותרבויות מוטציה. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="איור 1" /> <strong<html> &gt; באיור 1. סכמטית כוללת של בידוד NC. א) לנתח אזורים של עניין מן העובר. ב) לקט בצינור העצבי של collagenase / dispase עשר דקות (לא יעלה על רבע שעה). ג) לשטוף בינוני לשטוף. D) לנתח משם האאקטודרם לא עצבית והמזודרם. EF) לשטוף פעמיים בינוני לשטוף. ז) צלחת בינונית התחדשות עצמית. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב 3% O 2 בתנאי חוסר חמצן. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הסרת בשלבים של הצינור העצבי מן explant. הצינור העצבי יש להסיר לאחר 24-48 שעות על מנת למנוע זיהום עם לא-NC תאים. א) הודעה הגבול בין הצינור העצבי ואת תולדה NC (קו מוצק). ב) גזור לאורך הקצה של הצינור העצבי עם מחט האינסולין. ג) מחק בצינור העצבי ולהחליף בינוני עם בינוני עצמית חדשה והתחדשות. קו מקווקו מציין היקף תוצאה. קיצור: NT, בצינור העצבי. &gt; <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. דוגמאות מייצגות תוצאות. א) תוצאה explant בדרך כלל אחרי 24 שעות הדגירה במדיום התחדשות עצמית בתנאי חוסר חמצן (קו מקווקו מציין היקף תוצאה). ב) יתגדל לאור תוצאה NC לאחר 48 שעות בתרבית. ג) תרבות אידיאלי פחות עם תשואה תוצאה נמוכה. A ו-C היו בתרבית בתנאים זהים. תמונות להדגים את טווח טבעי חוסן התרבות. זה יכול להיות מושפע יעילות הבידוד בצינור העצבי, ריכוז של FN, תנאי חוסר חמצן, ולאחר זמן collagenase / dispase digestions. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. בניתוח חוץ גופית של תרבויות צפון קרוליינה explant ב normoxia לעומת היפוקסיה. בקרה (סוג בטבע) צפון קרוליינה התאים נדדו מן explants בצינור העצבי לאחר 48 שעות בתנאים תרבות normoxic. לעומת זאת, מוטציה Foxd3NC לא פחותה בהרבה בצמחים תא normoxia (סימן אדום לרמות שולי בצמחים NC). כאשר explants דומים גדלו בתנאי חוסר חמצן, Foxd3 מוטציה explants צפון קרוליינה גברה comparably לבקרות, המאפשר ניתוח שלאחר מכן. שימו לב, התנהגות זו קשורה גם עם התנהגות של Foxd3 מוטציה NC in vivo.

<ol>
	<li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neural crest. , (1999).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Developmental biology. 344, 566-568 (2010).</li><li>Saint-Jeannet, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural crest induction and differentiation. , (2006).</li><li>Plank, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+and+timing+of+arrival+of+murine+neural+crest+on+pancreatic+beta+cell+development+and+maturation.">Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation.</a> Developmental biology. 349, 321-330 (2011).</li><li>Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+neural+crest+regulate+beta-cell+mass+in+the+pancreas.">Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas.</a> Development. 135, 2151-2160 (2008).</li><li>Freem, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre;YFP+reporter+mice.">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> J. Anat. 217, 651-664 (2010).</li><li>Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+approach+to+the+problem+of+neural+crest+determination.">A clonal approach to the problem of neural crest determination.</a> Developmental biology. 46, 262-280 (1975).</li><li>Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+quail+neural+crest+cells:+they+are+pluripotent+and+differentiate+in+vitro+in+the+absence+of+noncrest+cells.">Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells.</a> Developmental biology. 80, 96-106 (1980).</li><li>Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+precursors+for+neural+and+mesectodermal+derivatives+in+the+cephalic+neural+crest.">Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest.</a> Development. 112, 301-305 (1991).</li><li>White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+undergo+cell-intrinsic+developmental+changes+in+sensitivity+to+instructive+differentiation+signals.">Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals.</a> Neuron. 29, 57-71 (2001).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+avian+neural+crest:+migration+and+maturation+of+mixed+neural+crest+clones+injected+into+host+chicken+embryos.">Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos.</a> J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).</li><li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest.">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).</li><li>Chung, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+property+of+postmigratory+cranial+neural+crest+cells+and+their+utility+in+alveolar+bone+regeneration+and+tooth+development.">Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development.</a> Stem Cells. 27, 866-877 (2009).</li><li>Biernaskie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKPs+derive+from+hair+follicle+precursors+and+exhibit+properties+of+adult+dermal+stem+cells.">SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).</li><li>Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P0+and+PMP22+mark+a+multipotent+neural+crest-derived+cell+type+that+displays+community+effects+in+response+to+TGF-beta+family+factors.">P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors.</a> Development. , 126-3781 (1999).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2.">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells.">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).</li><li>Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+clonal+analysis+of+mouse+neural+crest+development.">In vitro clonal analysis of mouse neural crest development.</a> Developmental biology. 157, 517-525 (1993).</li><li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+chick,+mouse+or+human+neural+crest+cells.">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).</li><li>Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates.">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation.">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia.">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li><li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin/neuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick.">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li><li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification.">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li><li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function.">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li><li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+or+in+situ+normoxia:+The+stem+cell+paradigm.">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן בשלב ההתפתחותי של העובר על מנת להבטיח את ההצלחה של גישה זו. ספירת somites של עוברי עכברים מוקדם הוא קריטי גם לשלב התאמת עוברים בתוך פסולת וקביעת אזורים הנכונות של הצינור העצבי של בידוד. וריאציה של אחד או שניים somites בין העוברים נמצא בטווח סביר של עיתוי התפתחותי, תלוי ברזולוציה של הניסוי שנערך. העובר בין 9 ל 9.5 DPC תהיה בין 17 ו -25 somites. אם לעובר יש יותר מ -25 somites, צפון קרוליינה היא מתקדמת עוד יותר בזמן התפתחותית, ואת בצמחים צפון קרוליינה יהיה פחות חזק בתרבות. קביעת עוברים מבוסס על מספר somite מאפשר דיוק בניסויים כאשר בשלב ההתפתחותי של העובר, ולכן NC, יכול להשפיע על תוצאות הניסויים. בעובר DPC 9.5, NC מחנק נודד מן הצינור העצבי הגבי ב-anterior האחוריים גבולות מוגדרים: מ placode באמצע otic כדי somite 7.באופן דומה, תא המטען NC נודד מן הצינור העצבי ברמות somite 8 עד 24 somite. לבודד אוכלוסיות נפרדות של אבות צפון קרוליינה כמתואר בפרוטוקול זה, דיסקרטית תתי אזורים בתוך כל אחד התחומים האלה מבודדים. באזור של הצינור העצבי המשמש משתנה מבוססת על עיצוב של הניסוי ובאזור הקדמי, האחורי של NC הנלמד. התנאים תרבות שתוארו לעיל, לרבות אמצעי ותנאי הדגירה, מותאמים במיוחד עבור תרבות של NC murine. דומה בינוני SR שימש לראשונה לתרבות של עכברוש NC 11. בידיים שלנו, זה בינוני חולדה, עם תוספת של Neurobasal בינונית, מייצרת תוצאה החזקה של Murine אבות NC. יתר על כן, שלא כמו הקודמים culturing עבודה תאים העופות NC, שכבת מזין מיותר לתרבות של NC יונקים בשיטה זו 11,13,21,22. אמנם יש פרוטוקולים רבים המפרטים תרבות NC גם העופות וגם היונקים ב normoxic conditi<html> תוספות 9,22, אנחנו 23 (איור 4), יחד עם אחרים בתחום 20, מצאו כי Murine culturing תאים צפון קרוליינה בתנאי חוסר חמצן שתוארו כאן הישרדות עזרי מאוד עצמית והתחדשות, יש להניח כי היפוקסיה יותר מקרוב מחקה רמות החמצן פיזיולוגיים בתוך העובר 20,29,30. הערכת ביטוי של סמנים מולקולריים מאוד מקל על זיהוי תאים צפון קרוליינה נגזרות הבדיל שלהם. אלה כוללים ביטוי Foxd3, p75, ו Sox10 בתאי גזע צפון קרוליינה. סמנים של NC הבדיל כוללים חלק השריר אלפא אקטין (SMA) עבור myofibroblasts, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) עבור, גליה microphthalmia הקשורים גורם שעתוק (MITF) עבור מלנוציטים, ו-III בטא טובולין, הגן חלבון המוצר 9.5 (PGP9.5 ), ו peripherin על הנוירונים. סמנים אלה יכולים לשמש כדי לקבוע את היעילות explant והבחנה של אבות NC. תוכן &quot;&gt; פעם בטכניקה זו נעשה במיומנות, NC תרבותי ניתן להשתמש במגוון רחב של מבחני כולל כימות של שגשוג, מוות של תאים, הגירה Dynamics, ו / או בידול המצב. NC יכול להיות גם תרבותי clonally לחקור עצמית חידוש או multipotency של בודדים אבות צפון קרוליינה 23. לאחר הצינור העצבי יוסר התרבויות, לנתק את התאים צפון קרוליינה ב 100 μl טריפסין-EDTA (0.25%) עבור בדיוק 5 דקות על 37 ° C. דובדבני טריפסין-EDTA בינוני לשטוף עודף (8-10 MLS) על ידי הוספת 800 μl לכל גם והעברת ל -15 צינורות בודדים מ&quot;ל המכילים בינוני לשטוף. בעדינות סרכזת תאים ב XG 150 במשך 3 דקות, להסיר תאים גלולה supernatant ו resuspend במדיום 1 SR מ&quot;ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer וצלחת אותם צפיפות של 25 תאים / 2 ס&quot;מ. מושבות אלה ניתן passaged סדרתי כדי assay עצמית והתחדשות. כדי multipotency assay, לשמור על התאים צפון קרוליינה על צפיפות משובט במדיום SR עבור 6 ימים ולאחר מכן לעבור התמיינותבינונית (10 ng / mL bFGF ו 1% העובר תמצית חומוס). התרבות התאים בינוני בידול תחת היפוקסיה במשך 8 ימים לפני ניתוח הרכב מושבת עם סמנים מולקולריים כנ&quot;ל 11. לסיכום, זו שיטה לבודד תאים מעוברים צפון קרוליינה עכבר מייצר תרבות חופשית מזין חסיד של premigratory תאים צפון קרוליינה ללא שימוש FACS. ניתוח של ניסויים באמצעות תאים אלה ניתן בקלות לכמת. אמנם שיטה זו היא פשוטה, היישומים שלה עבור המחקר של תכונות של צפון קרוליינה, הגירה בידול עצמי התחדשות, הם עצום. יתר על כן, בידוד NC מ עוברי עכברים מהונדסים גנטית מאפשר לימוד ישיר של גנים ושבילים מסוימים בהקשר של NC הגירה, הישרדות, ו / או בידול.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM (גלוקוז נמוכה) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal בינוני </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354037 </td><td> חנות 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> BD Biosciences </td><td> 354060 </td><td> חנות 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> מאוחסן 1mg/mL אלiquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Retinoic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> R2625 </td><td> חנות 35 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​aliquots לאחר לשחזר באתנול ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 תוספת </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> תוסף B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Steriflip 0.22 מיקרומטר מסננים </td><td> Millipore </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> מסננים 0.20 מיקרומטר </td><td> קורנינג </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> מזרקים (לסינון) </td><td> BD Biosciences </td><td> 301604 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> ארבע צלחות גם </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> רוש </td><td> 269 ​​638 </td><td> פעילות משתנה לפי אצווה. חנות 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> אינסולין מחטים (29 מד ½) </td><td> בקטון דיקסון </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> היפוקסיה הקאמרית </td><td> Billups-רוטנברג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חמצן Analyzer </td><td> Billups-רוטנברג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים # 5 </td><td> מדע כלים עדינים </td><td></td><td> להסרת הרחם decidua. </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (0.25%) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube

עובריים עצביים לפסגה (NC) היא האוכלוסייה אבי multipotent שמקורו ב היבט הגב של הצינור העצבי, עובר אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) ו נודד ברחבי העובר, והוליד סוגי תאים שונים 1-3. NC גם יש את היכולת הייחודית להשפיע על התמיינות והתבגרות של אברי המטרה 4-6. כאשר explanted במבחנה, אבות צפון קרוליינה לעבור עצמית והתחדשות, להעביר להתמיין למגוון של סוגי רקמות כולל נוירונים, גליה, תאים שריר חלק, סחוס ועצמות. Multipotency NC תוארה לראשונה מ explants של הצינור העצבי העופות 7-9. בבידוד מבחנה של תאים צפון קרוליינה מאפשר לימוד NC Dynamics כולל התפשטות, הגירה, ו multipotency. עבודה נוספת במערכות העופות ואת העכברים הראו כי explanted תאים צפון קרוליינה NC לשמור על הפוטנציאל שלהם כאשר מושתלים בחזרה העובר 10-13. בגלל מאפיינים אלה הסלולר הטמונות נשמרים explanted אבות צפון קרוליינה, assay עצבית explant הצינור מספק אופציה אטרקטיבית ללימוד NC במבחנה. כדי להשיג הבנה טובה יותר של NC יונקים, שיטות רבות הועסק לבודד אוכלוסיות NC. NC-derived אבות יכול להיות מתורבת מתוך הפוסט נודדות למקומות בעובר וגם למבוגרים ללמוד את הדינמיקה של פוסט נודדות אבות צפון קרוליינה 11,14-20 עם זאת הבידוד של אבות צפון קרוליינה כפי שהם להגר הצינור העצבי מספק שימור מיטבי של NC תא הפוטנציאל ומאפיינים נודדות 13,21,22. פרוטוקולים מסוימים להעסיק תא הקרינה מיון מופעל (FACS) כדי לבודד את האוכלוסייה NC מועשר עבור אבות מסוימים 11,13,14,17. עם זאת, כאשר החל עוברים בשלבים מוקדמים, מספרים סלולריים הולמים עבור ניתוחים קשה להשיג עם FACS, שמסבך את בידודה של צפון קרוליינה מוקדם populatioNS מעוברים בודדים. כאן, נתאר גישה זו אינה מסתמכת על FACS ותוצאות ב האוכלוסייה כ 96% טהור NC על פי כתב Wnt1-Cre שושלת הופעל 23. השיטה המוצגת כאן הוא עיבוד פרוטוקולים מותאם לתרבות של עכברוש NC 11,13. יתרונותיה של פרוטוקול זה לעומת שיטות קודמות הן כי 1) התאים לא גדלים על שכבה מזין, 2) FACS לא נדרש לקבל האוכלוסייה טהור יחסית NC, ​​3) premigratory תאים צפון קרוליינה מבודדות 4) התוצאות בקלות לכמת. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש הבידוד של צפון קרוליינה מהמודל כל עכבר מוטנטי, להקל על מחקר של מאפיינים צפון קרוליינה עם מניפולציות גנטיות שונות. הגבלה של גישה זו היא כי NC מוסר בהקשר של העובר, אשר ידוע להשפיע, הישרדות הגירה והבחנה של NC 2,24-28.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube at JoVE.com

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטות לחקר ההגירה, התחדשות עצמית, ו multipotency של הרכס העצבי.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

isolation-culture-neural-crest-cells-from-embryonic-murine-neural

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K Views.  Vanderbilt University Medical Center. הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש במבחנה שיטות לחקר ההגירה, התחדשות עצמית, ו multipotency של הרכס העצבי.

Video: Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...