פרוטוקול זה מפשט ומבהר את השיטות ליישום סינתזת חלבון מחדש עצמית על ידי מי שאינם מומחים. גישה משופרת לשיטות אלה תסייע לבטל את השיווק של הפלטפורמה ואת קבוצת היישומים הרחבה שהיא מאפשרת. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם המהירות, העלות האפקטיבית וקלות התגובה שנקבעה בהשוואה לפלטפורמות סינתזה אחרות של חלבונים מחדש.
הפלטפורמה שלנו יכולה לאפשר מספר יישומים כולל גנומיקה תפקודית, hythopertesting, biosensors, ערכות חינוכיות, ועם שינויים קלים, הנדסה מטבולית והרחבת קוד גנטי. בעוד טכניקה זו דורשת רק אימון מעבדה בסיסי, משתמשים חדשים צריכים לתכנן להכיר טכניקות כמו sonication לביצוע מוצלח של הפרוטוקול. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את כל תאי המדיה והתרבות E.coli כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
מניחים בקבוק צנטריפוגה של ליטר אחד באמבט מי קרח. לאחר OD600 תרבויות מגיע 3.0, לשפוך את תרבות התא לתוך הבקבוק מקורר. באמצעות מאזן קרן כפולה, מוסיפים מים לבקבוק צנטריפוגה שני של ליטר אחד עד שהוא שוקל כמו הראשון כדי ליצור איזון עבור הצנטריפוגה.
לאחר קירור מראש של הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה את הבקבוקים ב 5, 000 גרם ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה את התאים. לאחר מכן, יוצקים באיטיות ונפטרים מהעל-טבעי. מניחים את גלולת התא על קרח.
באמצעות מרית סטרילית לגרד את גלולת התא מתוך בקבוק צנטריפוגה ולהעביר אותו לצינור חרוט קר, 50 מיליליטר. הוסף 30 מיליליטר של חיץ S30 קר בתוספת שני מילימולר DTT ו resuspend את גלולה על ידי מערבולת בהתפרצויות קצרות עם תקופות מנוחה על הקרח עד גלולה הוא resuspended באופן מלא ללא גושים. לאחר מכן, השתמש עוד צינור חרוט 50 מילימטר מלא במים כאיזון כדי צנטריפוגה המדגם ב 5, 000 גרם ו 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
יוצקים ונפטרים מהעל-טבעי. תן שימוש חוזר לכדור עם 20 עד 25 מיליליטר של חיץ S30 קר. צנטריפוגה ב 5, 000 גרם וב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
יוצקים ונפטרים מהעל-טבעי. לאחר מכן, להוסיף 30 מיליליטר של חיץ S30 ולתלות מחדש את גלולה באמצעות מערבולת כפי שתואר קודם לכן. תנו שלושה צינורות חרוטיים ששוקלו מראש, קרים, 50 מיליליטר.
באמצעות מילוי פיפט סרולוגי עם פיפטה סטרילית, aliquot עשרה 10 מיליליטר של השעיית גלולה לתוך כל צינור. צנטריפוגה כל הצינורות באמצעות יתרות מתאימות לפי הצורך ב 5, 000 גרם ו 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, יוצקים ונפטרים מהעל-טבעיים.
בזהירות לנגב את החלק הפנימי של כל צינור כובע עם רקמה נקייה כדי להסיר את מאגר הגישה, תוך הקפדה להימנע מלגעת גלולה. באמצעות איזון אנליטי, מחדש את הצינורות ולדווח על משקל גלולה הסופי עבור כל צינור. כדי להתחיל, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ S30 קר עם 2 מילימולר DTT לגרם אחד של מסת תא לכל גלולה.
השתמש במערבולת כדי לנצל מחדש את כדורי כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן להעביר 1.4 מיליליטר של כל גלולה resuspended לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר נפרדים. מניחים צינור אחד לתוך אמבט מי קרח בבקבוק וממקמים את החללית sonicator כך שהוא לא נוגע בתחתית או בצדדים של הצינור.
Sonicate הצינור עם משרעת להגדיר ב 50% במשך 45 שניות, ואחריו 59 שניות של מנוחה. הקפד לסגור ולהפוך את הצינורות במהלך תקופות כבויות. מיד לאחר sonication הושלם, להוסיף 4.5 microliters של DTT טוחנת אחת לתוך lysate.
להפוך את הצינור מספר פעמים לערבב ולאחר מכן למקם אותו על קרח. חזור על תהליך זה, sonicating והוספת DTT עבור כל צינור של תאים לשימוש חוזר. צנטריפוגה הדגימות ב 18, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר מכן, פיפטה כל על-טבעי לתוך צינור Microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר, משאיר כמה supernatant מאחור כדי להבטיח את גלולה לא מופרע. קח את הצינורות של supernatant לפלטפורמה רועדת של אינקובטור ולארוב אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד במשך 60 דקות. זו תגובת הברח.
לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות ב 10, 000 גרם וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר כל על-טבעי מבלי להפריע לכדור המעביר אותם לצינורות חדשים. צור 100 aliquots microliter רבים של התמצית לאחסון.
ראשית, פתרון הפשרה A, פתרון B, תבנית ה- DNA, תמצית BL21DE3, T7 RNA פולימראז, ועליקוט של מים ברמה מולקולרית על קרח. לאחר מכן, סמן את הכמות הדרושה של צינורות Microcentrifuge הדרושים לתגובת CFPS. מערבבים כל ריאגנט על ידי צינור או מערבולת, ולאחר מכן להוסיף את הפתרון צינור התגובה שכותרתו, הקפד לא מערבולת תמצית התא אלא להפוך את הצינור לערבב.
ודא כי התגובה הסופית מעורבת היטב לשלב לתוך חרוז אחד 15 microliter בתחתית כל צינור. דגירה כל תגובה מבלי לרעוד ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, או ב 30 מעלות צלזיוס לילה. כדי להתחיל, להשיג צלחת 96 היטב לטעון 48 microliters של 0.05 HEPES טוחן ב pH 8 לתוך כל הדרושים היטב לכמות.
לאחר מכן, הסר את צינורות התגובה מהחרם. מערבבים כל תגובה על ידי צינור למעלה ולמטה ולהעביר שני microliters של כל תגובה לתוך בארות המכיל HEPES. מערבבים כל באר על ידי צינור למעלה ולמטה.
לאחר שכל התגובות נטענות ומעורבות, העמיסו את הצלחת לתוך פלואורומטר ולמדוד את פלואורסצנטי נקודות הקצה SFGFP באמצעות אורך גל העירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 510 ננומטר. השתמש בעקומה סטנדרטית שנוצרה בעבר כדי לקבוע את הריכוז של GFP superfoldered מקריאת הפלואורסצנטים המתקבלת. במחקר זה, הכנת תמצית E.coli מבוסס sonication נחקרת.
כדורי התא ותמצית התא יציבים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי לפחות שנה. בנוסף, תמצית התא יכולה לעבור לפחות חמישה מחזורי הפשרת הקפאה ללא אובדן משמעותי של פרודוקטיביות. ניתן לשנות חלק מהצעדים בפרוטוקול זה מבלי לפגוע בפרודוקטיביות הכוללת של המערכת.
בעיקר, תאים ניתן לקצור בטווח של 2.7 עד 4.0 צפיפות אופטית ב 600 ננומטר ללא השפעה משמעותית על הפרודוקטיביות תמצית התא. עם זאת, איכות ה- DNA של התבנית היא מקור לשונות אצווה-לאצווה המשפיעה על התשואות הנפחיות של תגובת CFPS. זה נפתר על ידי טיהור ה-DNA באמצעות Midi או Maxiprep ואחריו שלב ניקוי DNA נוסף.
כלי התגובה משפיע גם על התשואות הנפחיות של תגובת CFPS. עלייה ביחס שטח הפנים לנפח, גורמת לתשואות נפחיות גבוהות יותר. כדי לייעל את התפוקות הנפחיות של תגובת CFPS ולהפחית את השונות בין אצווה לאצווה של תמצית תאים, יש לבצע טיטריון מגנזיום עבור כל הכנת תמצית חדשה.
עבור תמציות תאים המורכבות מ-30 מיליגרם למיליליטר חלבון כולל, ריכוז המגנזיום האופטימלי ונפח התמצית כדי למזער את השימוש בריאגנטים ולמקסם את התפוקה הנפחית הוא 10 מילימולרים וחמישה מיקרוליטרים בהתאמה. על ידי שינוי סולם התגובה, משתמשים יכולים להמשיך בשיטות החל סינון תפוקה גבוהה לביטויים בקנה מידה גדול יותר של חלבון היעד. טכניקה זו מספקת שני יתרונות מרכזיים, תחילה היא מסננת מוצרי חלבון במהירות רבה יותר, ושנית, היא מסנתזת קשה לבטא חלבונים.
דוגמאות לכך כוללות חלבונים ציטוטוקסיים או דורשים תנאי חמצון לתפקודם. כמו בכל הליך מעבדה, יש להתייחס לכל חברי ההנהלה בזהירות. בנוסף, צנטריפוגות תמיד צריך להיות מאוזן והגנה על האוזן יש להשתמש במהלך sonication.
