שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח על גנטיקה קולטן תא NK כגון מגוון haplotype וכיצד זה קשור למחלות. הדגמה חזותית של שיטה זו תסייע להגדיר את הפרוטוקול במעבדה שלך, כולל תהליך האוטומציה וניתוח הנתונים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם, שלא כמו שיטות קונבנציונליות, qKAT, אשר מייצג הקלדה אוטומטית KIR כמותית, הוא תפוקה גבוהה והוא מספק מספר עותק גנים.
qKAT יכול לספק תובנה על שיוך מחלות. ההשלכות של טכניקה זו יכולות להיות שימושיות לטיפול בזיהומים ויראליים כמו HIV והפטיטיס C, בסרטן, בהשתלת תאי גזע והפרעות הריון. qKAT יכול להיות מיושם גם בחקר גנטיקה האוכלוסייה, כמו גם לחקור ביטוי אינטראקציות תפקודיות בין מולקולות KIR ו HLA.
qKAT מורכב 10 תגובות מולטיפלקס כי במיוחד למקד exons של שני גנים KIR גן התייחסות אחד. בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים נועדו לזהות את אללים של הגן נתון תוצאות PCR אמפילונים קצרים. לאחר מכן, בדיקות הידרוליזה ספציפיות עם תווית כפולה משמשות לניטור הגברה של PCR בזמן אמת.
ניתוח מספר העתקה משתמש לכמות יחסי של גנים KIR היעד לגן ייחוס. qKAT מתוכנן ומוגדר כטכניקת תפוקה גבוהה. לפיכך, כל תגובה יכולה להתבצע על קצת פחות מ 1, 000 דגימות.
השלבים הבאים מראים את השלבים הכרוכים בהכנה וציפוי מתוך כל צלחת DNA של 96 באר. כדי להתחיל, לאחר כימות ה-DNA, לדלל את ה-DNA בצלחת 96 היטב עמוק היטב. כלול דוגמת פקד אחת לפחות עם מספר עותק מוכר ופקד אחד שאינו של תבנית.
צנטריפוגה הצלחת ב 450 gs במשך שתי דקות. לאחר מכן, מחלקים כל דגימה ברביעייה לתוך 384 גם צלחות qPCR. לאחר מכן, האוויר מייבש את הדנ"א באזור נקי בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
כדי להגדיר תגובת qKAT אחת עבור 10 לוחות 384 באר, הראשון, להפשיר את מאגר qPCR, פריימר, ו aliquots בדיקה בארבע מעלות צלזיוס. הכינו את תערובת האב על הקרח בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמשו בפיגט רב-ערוצי כדי להפיץ את תערובת המאסטר באופן שווה על פני צלחת עמוקה של 96 בארות.
לוותר על 9.5 microliters של תערובת האב לתוך כל באר של הצלחת עם דגימות gDNA מיובשות. לאחר מכן, לאטום את הצלחת עם נייר כסף ומיד לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. זכור לבצע שטיפת מים קצרה כדי לנקות את המחטים של מערכת הטיפול בנוזל אם מחלקים את תערובת האב על יותר מצלחת DNA אחת של 384 באר.
צנטריפוגה הצלחת עם דגימות gDNA ב 450 gs במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס כדי להשתמש שוב את ה-DNA ולפזר את כל בועות האוויר. לאחר הדגירה של הצלחת בן לילה, חזור על הצנטריפוגה כדי לפזר את כל בועות האוויר.
לאחר מכן, מניחים את הצלחת ברציף האחסון מקורר. חבר את מחשב ה- qPCR למטפל במיקרו-לוחית. לאחר מכן, תכנת את המטפל במיקרופלסטיק בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לאחר השלמת הריצה, יש הרובוט לאסוף את הצלחת ממכונת qPCR ולמקום אותו ברציף להשליך. לאחר השלמת ההגברה, פתח את תוכנת qPCR. תחת הכרטיסיה נווט, פתח את קובץ ניסוי התגובה שנשמר עבור לוח.
לאחר מכן, פתח את החלון יצירת ניתוח חדש ובחר את ההגדרות המתאימות עבור פעולת השירות 2 Derivative Max. לאחר מכן בחרו 'מסרק סינון' ודאו שהנתונים שנאספו עבור STAT6 נבחרו. בחר את פיצוי הצבע המתאים.
לחץ על חשב ולאחר מכן לחץ על שמור קובץ. לניתוח הנתונים בעזרת השיטה Fit Points, פתחו את החלון 'צור ניתוח חדש' ובחרו בהגדרות המתאימות לפעולת השירות Fit Points. לאחר מכן, בחר את המסננים ופיצוי הצבע הנכונים עבור STAT6.
הגדר את רצועת הרעש כך שלא תכלול את רעשי הרקע. לאחר מכן, פתחו את הכרטיסיה 'ניתוח' והגדירו את נקודות התאמה לשלוש ובחרו 'הצג נקודות התאמה'. שמור שינויים וחזור על השלבים עם ההגדרות המתאימות עבור Fit Point וניתוח נגזרת שנייה עבור הגנים KIR.
פתח את הכרטיסיה נווט בתוכנת qPCR ובחר ייצוא אצווה תוצאות. לאחר מכן, פתח את התיקיה המכילה את קבצי הניסוי והעבר אותם לצד הימני של החלון. לחץ על הבא ובחר את השם והמיקום של קובץ הייצוא.
לאחר מכן, בחר את סוג הניתוח של עניין ולחץ על הבא. ודא ששמו של הקובץ, תיקיית הייצוא וסוג הניתוח נכונים לפני שתלחץ על הבא כדי להתחיל בתהליך הייצוא. כאשר מצב הייצוא ישתנה ל'אישור', המסך יעבור באופן אוטומטי לשלב הבא.
ודא שכל הקבצים שנבחרו יוצאו בהצלחה ולחץ על בוצע. לאחר מכן השתמש בקבצי ה- Script בפרוטוקול הטקסט כדי לפצל את הלוחות המיוצאים לתגובות בודדות ולהמיר את הקבצים לתוכנה הניתנת לקריאה על-ידי תוכנת ניתוח מספר העתקה. לאחר מכן, פתח את תוכנת ניתוח מספר ההעתקה ובחר יבא קובץ תוצאות PCR בזמן אמת כדי לטעון את קבצי הטקסט שנוצרו על-ידי קבצי ה- Script.
לבסוף, בחר נתח ונהל את הניתוח על-ידי בחירה במספר העותק לדוגמה השכיח ביותר. בפרוטוקול זה, הקלדה אוטומטית למחצה, או qKAT, שימשה להעתקת גנים KIR מסוג מספר. מספר העותק השכיח ביותר עבור KIR2DL4 היה שני עותקים בעוד שמספר העותק השכיח ביותר עבור KIR3DS1 היה אפס.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לוודא כי ה-DNA הוא כימת במדויק, כדי לנהל את כל השלבים על הקרח, ולוודא כי reagents מכוסים מן האור. חשוב גם לבצע בדיקות יסודיות על הנתונים הגולמיים עבור דגימות שאינן תואמות את הכללים הידועים LD עבור גנים KIR. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו רצף על מנת לענות על שאלות נוספות, למשל, נוכחות של גנים היתוך, או זיהוי של אללים הרומן.
לאחר התפתחותה, שיטה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונוגנטיקה לחקור את תפקידה של KIR בביולוגיה של תאי NK, עמידות למחלות ורבייה אנושית.
