Этот метод может ответить на ключевые вопросы о генетике рецепторов НК-клеток, таких как разнообразие гаплотипа и как это связано с болезнью. Визуальная демонстрация этого метода поможет установить протокол в лаборатории, включая процесс автоматизации и анализ данных. Основными преимуществами этого метода являются то, что, в отличие от обычных методов, qKAT, который выступает за количественный KIR автоматизированного ввода, является высокой пропускной способностью и обеспечивает номер копии гена.
qKAT может дать представление об ассоциации болезней. Последствия этого метода могут быть полезны для терапии вирусных инфекций, таких как ВИЧ и гепатит С, при раке, при трансплантации стволовых клеток и нарушениях беременности. qKAT также может быть применен при изучении генетики популяции, а также в изучении экспрессии и функциональных взаимодействий между молекулами KIR и HLA.
qKAT состоит из 10 мультиплексных реакций, которые специально нацелены на экзоны двух генов KIR и одного эталонного гена. В этом протоколе, конкретные грунтовки предназначены для обнаружения аллелей данного гена и PCR результаты в коротких ампликонов. После этого для мониторинга усиления ПЦР в режиме реального времени используются специальные гидролизные зонды с двойной маркировкой.
Анализ числа копий использует относительную количественную оценку целевых генов KIR для эталонного гена. qKAT разработан и настроен как высокая пропускная способность. Таким образом, каждая реакция может быть выполнена на чуть менее 1000 образцов.
Следующие шаги показывают шаги, участвующие в подготовке и покрытие из каждого 96-хорошо пластины ДНК. Для начала, после количественной оценки ДНК, разбавить ДНК в 96-ну глубокой пластины. Включите по крайней мере один образец управления с известным номером копии и один элемент управления без шаблона.
Центрифуга пластины на 450 г в течение двух минут. Затем, обойтись каждый образец в четыре раза в 384-хорошо qPCR пластин. После этого воздух высушит ДНК в чистом месте при комнатной температуре в течение 24 часов.
Чтобы настроить одну реакцию qKAT для 10 пластин 384-колодец, во-первых, разморозить буфер qPCR, грунтовка, и зонд aliquots на четыре градуса по Цельсию. Подготовь мастер-микс на льду в соответствии с текстовым протоколом. Затем используйте многоканаражную пипету для равномерного распределения мастер-микса по 96-ну глубокой пластине.
Выпределите 9,5 микролитров мастер-микса в каждый колодец пластины с высушенными образцами ГДНК. После этого, печать пластины с фольгой и сразу же хранить его при четырех градусах по Цельсию. Не забудьте выполнить короткую промывку воды, чтобы очистить иглы жидкой системы обработки, если дозирование мастер смеси на более чем одной 384-хорошо пластины ДНК.
Центрифуга пластины с образцами ГДНК на 450 г в течение трех минут. Затем инкубировать пластину при 4 градусах по Цельсию, чтобы повторно использовать ДНК и рассеять любые пузырьки воздуха. После инкубации пластины на ночь, повторите центрифугу, чтобы рассеять любые пузырьки воздуха.
Затем поместите тарелку в охлажденный док для хранения. Подключите машину qPCR к обработчику микроплатформ. Затем запрограммировать обработчик микроплатформ в соответствии с текстовым протоколом.
После завершения пробега, закажите робота, соберите пластину из машины qPCR и поместите ее в док-станцию. После завершения усиления откройте программное обеспечение qPCR. Под вкладкой Navigator откройте файл эксперимента сохраненной реакции для пластины.
Затем откройте окно Create New Analysis и выберите подходящие настройки для второго метода производного Max. Затем выберите Гребень фильтра и убедитесь, что данные, собранные для STAT6, выбраны. Выберите соответствующую цветовую компенсацию.
Нажмите Рассчитайте, а затем нажмите сохранить файл. Для анализа данных с помощью метода Fit Points откройте новое окно анализа и выберите подходящие настройки для метода Fit Points. Затем выберите правильные фильтры и цветовые компенсации для STAT6.
Установите шумовую полосу, чтобы исключить фоновый шум. После этого откройте вкладку Анализ и установите подходящие точки до трех, а также выберите Show Fit Points. Сохранить изменения и повторить шаги с соответствующими настройками для Fit Point и 2-й производный анализ для генов KIR.
Откройте вкладку Navigator в программном обеспечении qPCR и выберите результаты экспорта пакетов. Затем откройте папку, содержащую файлы эксперимента, и перенесите их на правую сторону окна. Нажмите далее и выберите имя и местоположение экспортного файла.
После этого выберите тип анализа интереса и нажмите Далее. Убедитесь, что имя файла, экспортная папка и тип анализа являются правильными, прежде чем нажать Далее, чтобы начать процесс экспорта. Когда статус экспорта изменяется до OK, экран автоматически переходит к следующему шагу.
Убедитесь, что все выбранные файлы были успешно экспортированы и нажмите Готово. Затем используйте скрипты в текстовом протоколе, чтобы разделить экспортируемые пластины на отдельные реакции и преобразовать файлы в программное обеспечение, читаемое программным обеспечением для анализа номеров копий. Затем откройте программное обеспечение для анализа номеров копий и выберите файл результатов Import в режиме реального времени для загрузки текстовых файлов, созданных скриптами.
Наконец, выберите анализ и проведем анализ, выбрав наиболее частый номер копии образца. В этом протоколе для копирования генов KIR был использован полуавтоматический тип ввода, или qKAT. Наиболее частым номером копии KIR2DL4 было два экземпляра, в то время как наиболее частый номер копии для KIR3DS1 был нулевым.
При попытке этой процедуры, крайне важно убедиться, что ДНК количественно точно, провести все шаги на льду, и убедиться, что реагенты покрыты от света. Важно также провести тщательную проверку необработанных данных для образцов, которые не соответствуют известным правилам LD для генов KIR. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, наличие генов синтеза или идентификация новых аллелей.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области иммуногенетики, чтобы исследовать роль KIR в биологии клеток НК, устойчивость к болезням, и воспроизводства человека.
