פתרון המבנה של תחום קולטן ריאנודין יכול לעזור בהבנתנו את המנגנון המולקולרי של תפקוד החלבון, פעולת קוטלי חרקים והתפתחות עמידות קוטלי חרקים. מדד זה מרמז על שימוש בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן להמחשה של מבנה, הנחשבת לסטנדרט זהב לקביעת מבנה החלבון ברזולוציה כמעט אטומית. מבנה ברזולוציה גבוהה זה של תחום קולטן החרקים ריאנודין חושף את מנגנון התעלות ומספק תבנית חשובה להתפתחות קוטלי חרקים ספציפיים למינים באמצעות גישות עיצוב תרופות מבוססות מבנה.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי קריסטלוגרפים חלבון פוטנציאלי חייב להיות מיומן ביוכימיה, ביופיזיקה, מדעי המחשב, ומתמטיקה. התחל על ידי הגברת ה- DNA המתאים לחלבון המעניין על ידי תגובת שרשרת פולימראז. בסוף התגובה, להפעיל את כל 50 microliters של תערובת התגובה על 2% ג'ל agarose, ולחלץ את ה-DNA עם ערכת מיצוי ג'ל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
לאחר מכן, ליניארי את ה-DNA וקטור LIC על ידי ערבוב 20 microliters של ה-DNA וקטור עם 6 microliters של חיץ תגובה 10X ו 4 microliters של אנזים הגבלת SspI ב 30 microliters של מים מזוקקים כפולים. הדגירה תערובת תגובה זו במשך שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להפעיל את כל תערובת התגובה על ג'ל 1%agarose, ואחריו החילוץ של DNA וקטור ליניארי עם ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.
לאחר מכן, לבצע טיפולים נפרדים T4 DNA פולימראז על 5 microliters של DNA וקטור ליניארי ו PCR מוגברת להוסיף DNA, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. דגירה במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו 20 דקות של איון חום אנזים ב 75 מעלות צלזיוס. בצע את תגובת חישול שיבוט עצמאית קשירה על ידי שילוב של 2 microliters של T4 מטופלים להוסיף DNA עם 2 microliters של T4 מטופלים LIC וקטור DNA עבור דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
כדי להפוך BL21(DE3)E. קולי תאים עם פלסמיד רקומביננטי, להפשיר 50 microliters של תאים מוכשרים על קרח, ולהוסיף כ 1 microliter של פלסמיד annealed לצינור. בעדינות להעיף את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב את התאים ואת ה-DNA, ולה מניחים את הצינור בחזרה על הקרח במשך 20 דקות.
בסוף הדגירה, הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות, ואחריו שתי דקות בחזרה על הקרח. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום LB בטמפרטורת החדר לצינור, ומ מניחים את התאים על שייקר 250 סל"ד במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה הרועדה, צלחת 150 עד 200 microliters של תערובת זו על צלחות הבחירה, ולהפוך את הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, תרבות מושבה אחת ב 100 מיליליטר של מדיום 2-YT, בתוספת קאנאמיצין, באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לחסן ליטר אחד של 2-YT בינוני, בתוספת kanamycin, עם 10 מיליליטר של תרבות הלילה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד עד קריאת OD600 מגיע כ 0.6. לאחר מכן, לגרום לתרבות עם IPTG לריכוז סופי של 0.4 מילימולאר, ולגדל את התאים במשך חמש שעות ב 30 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה, ולהשעות מחדש את גלולה ל 10 גרם של חיידקים לכל 40 מיליליטר של ריכוז מאגר תמוגה. לשבש את קירות התא על ידי sonication ב משרעת 65%, ושנייה אחת על שנייה אחת את, במשך שמונה דקות. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה.
לאחר מכן, סנן את העל-טבעי למרות מסנן של 22 מיקרומטר וטען את הפתרון בלולאה לדוגמה. כדי לטהר את חלבון ההיתוך, להזריק את supernatant מסונן מן לולאת המדגם לתוך עמודה ניקל-nitrolotriacetic חמישה מיליליטר על מערכת טיהור עם שיפוע ליניארי של 20 כדי 250 imidazole מילימולרית. Cleave חלבון היעד eluted עם פרוטאז וירוס תחריט טבק, ביחס של 1 עד 50, לילה ב 4 מעלות צלזיוס, ולטהר את תערובת תגובת המחשוף על עמודת שדון amylose, וטור ניקל-nitrolotriacetic, כדי להסיר את התג ואת פרוטאז נגיף תחריט טבק.
דיאליזה לזרום דרך מן העמוד ניקל ניטרולטריאקטי נגד חיץ דיאליזה כדי להפחית את ריכוז המלח, ולטהר את המדגם על עמוד חילופי אניון על ידי שיפוע ליניארי של 20 כדי 500 מילימולר אשלגן כלורי במאגר אלוטיון. לאחר מכן, לרכז את החלבון במרכז צנטריפוגלי. הזרק את החלבון המרוכז לעמודת סינון ג'ל Superdex 200 26/600 כדי לבדוק את ההומוגניות, ולהעריך את טוהר החלבון ב-15%SDS-PAGE.
כדי להכין את החלבון להתגבשות, לרכז את דגימת החלבון המטוהר ל 10 מיליגרם למיליליטר במרכז הצנטריפוגלי, ואת חילופי חיץ כדי לגבש חיץ לפני 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי לבצע סינון התגבשות, השתמש בשיטת דיפוזיה של אדי טיפת ישיבה ב- 295 קלווין, עם מספר ערכות התגבשות, ובמערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים בפורמט של 96 בארות. בסוף הגדרת הירידה, לאטום את צלחת התגבשות 96 היטב כדי למנוע אידוי, ולאפשר את שיווי המשקל של טיפת החלבון בתוך מאגר המאגר.
מניחים את הצלחות באינקובטור קריסטל ב 18 מעלות צלזיוס. בדוק את הצלחות מעת לעת תחת מיקרוסקופ אור כדי לפקח על היווצרות הקריסטל וצמיחתו. כדי להבדיל את גבישי החלבון מקריסטלי המלח, הוסיפו מיקרוליטר אחד של צבע גביש חלבון לירידה למטרה, והתבוננו בגבישים מתחת למיקרוסקופ לאחר שעה.
גבישי החלבון יופיעו כחולים. כדי לייעל עוד יותר את הגבישים, השתמש בתנאי ההתגבשות החיוביים ובשיטת דיפוזיה של אדי טיפה תלויים בצלחות 24 בארות, ואחריהן דגירה באינקובטור הגבישים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את מבנה החלבון, הר את הגבישים על קרילופ תחת מיקרוסקופ אור לקירור הבזק בחנקן נוזלי, והצב את הגבישים בחוסר מזל לאחסון ולהובלה.
סנן מראש את הגבישים במפזר קרני רנטגן, תוך שימוש בפונקציית הריווח הידנית כדי להרכיב ולרכז את הגבישים. לאחר מכן, השתמש בתוכנת דיפוזיה של קרני רנטגן כדי לאסוף את הנתונים. כדי ליצור אינדקס, לשלב את ערכת הנתונים וקנה המידה שלה, באמצעות חבילת HKL-2000, בחר תחילה את הגלאי וטען את ערכת הנתונים.
לאחר מכן, בצע את פונקציית החיפוש שיא כדי למצוא את כתמי ההתפזרות. צור אינדקס עבור הנקודות, בחר את קבוצת הרווחים הנכונה ובצע שילוב שיא. לאחר מכן, שנה את קנה המידה של ערכת הנתונים.
התאם שוב את מודל השגיאה וקנה המידה. שמור את קובץ sca של הפלט. כדי לקבוע את המבנה באמצעות חבילת התוכנה של Phenix, צור פרוייקט חדש.
ראשית, הפעל Extriage עם קובץ sca כדי לחשב את מספר העותק האפשרי של מולקולות חלבון ביחידה האסימטרית. לאחר מכן, כדי לפתור את בעיית הפאזה על ידי החלפה מולקולרית, הפעל את Phaser, באמצעות קובץ נתוני ההפרדה, קובץ מבנה התבנית עם זהות רצף גבוה ודמיון מבני כמו חלבון היעד, ואת קובץ רצף החלבון, כדי למצוא את הפתרון. בצע בנייה אוטומטית בפניקס כדי ליצור את הדגם הראשוני, באמצעות קובץ הפלט של Phaser וקובץ הרצף מחלבון היעד.
בנה ידנית את המבנה לתוך צפיפות האלקטרונים הניסיונית ששונתה באמצעות COOT, ומקד באמצעות פיניקס עידון במחזורים איטרטיביים. אמת את המודל הסופי באמצעות כלי האימות ב- Phenix. בניסוי מייצג זה, טיהור תחום מסוף הקצה של חלבון קולטן עש היהלומים ריאנודין, כפי שהוכח, הניב רצועה אחת בערך 21 קילודלטון על ידי ניתוח STS-PAGE.
נפח האלוטיון מעמוד סינון הג'ל אישר את תחום מסוף הקצה של קולטן ריאנודין המטוהר כמונומר. עבור התגבשות, התנאים האופטימליים ביותר שבהם נוצרו גבישים בצורת צלחת באיכות גבוהה היו בנוכחות 1 HEPES טוחן של pH של 7, ו 1.6 אמוניום גופרתי טוחן. קביעת מבנה החלבון מתוך ערכת נתוני דיפירציה ניצול תוכנות כפי שהודגם חשף את התחום קצה מסוף קולטן עש diamondback ryanodine מכסה שאריות 1 עד 205.
חלבונים עם הפרעה גדולה, אזורים גמישים, או עם זיקה חלשה מאתגרים להתגבש. בתרחישים אלה, אסטרטגיות הנדסת חלבון כגון הפחתת אנטרופיה פני השטח, חיתוך לולאה, וקישור צולב, עשוי להגדיל את הסבירות של קבלת גבישי חלבון טובים יותר. בנוסף לחשיפת מבני חלבון ברזולוציה גבוהה, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן עשויה לשמש גם לחקר אינטראקציות של חומרי הדברה חלבונים, אשר יכולות לסייע בתכנון חומרי הדברה מבוססי מבנה.
