שיטה זו מספקת חלופה לתיוג פלואורסצנטי קונבנציונלי ולהליך ניתוח ציטומטריית זרימה, שהם זמן רב, יקרים, ומוצאים את הסיכון לשינוי התפקוד התאי של הדגימות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא טומוגרפיה תלת מימדית של מדד שבירה ולמידת מכונה הן שיטות ללא תוויות וכמותיות המאפשרות זיהוי לימפוציטים מהיר ומדויק. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול של סרטן הדם ומחלות אוטואימוניות כמו זיהוי של לימפוציטים יכול להיות חיוני עבור אבחון המחלה ויישום הטיפול המתאים.
למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לאוכלוסיות לימפוציטים, זה יכול להיות מיושם גם על ניתוח של תאים בודדים אחרים של עניין, כולל חיידקים. הדגמה חזותית של טכנולוגיית הדמיה שלב כמותי תלת מימדי היא קריטית, מכיוון שהיא מאפשרת הוראה ברורה כיצד לבצע את הטכניקה יכולה לספק תובנות על יישומיה. התחל על ידי איסוף כל תת קבוצה לימפוציטים על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות.
להדמיה אופטימלית, לדלל כל דגימת תא לריכוז של 180 תאים לכל microliter של מדיום RPMI, ולאט לאט להזריק 120 microliters של המדגם מדולל הראשון לתוך תא הדמיה. לאחר אישור מחסור בבועות בתוך התא, מניחים טיפת מים מזוקקים על העדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ שלב כמותי תלת מימדי, ומ מניחים את תא ההדמיה על שלב התרגום של המיקרוסקופ. התאימו את הבמה כך שהדגימה תתיישר עם עדשת המטרה, ולחצו על המיקוד והמשטח בכרטיסיית הכיול של נקודת המבט של המיקרוסקופ של תוכנת ההדמיה כדי להתאים את המיקומים האקסימיאליים של עדשות המטרה והמעיבוי, בהתאמה.
לחץ על מצב אוטומטי כדי ליישר את עדשות המטרה והמרכז. כדי למטב את היישור, פתח את מצב הסריקה והתאם ידנית את העדשות כדי ליישר את תבנית התקן המיקרו-מינרור הדיגיטלי למרכז. לאחר מכן, חזור למצב רגיל והתאם את שלב התרגום כדי לאתר תא בשדה התצוגה.
התאימו את המיקום הצירי של העדשה האובייקטיבית כדי למצוא את מישור המוקד עד שגבול הדגימה המדמיין במסך יהיה כמעט בלתי נראה. חשוב להתאים באופן מושלם את המוקד של התא כדי ליצור טומוגרם 3DRI אופטימלי. אם התמונה אינה נלקחת כראוי, שחזור תלת-מימדי ייפגע, וכתוצאה מכך תוגם רועש.
התאם את שלב התרגום כדי למצוא מיקום ללא תא ולחץ על כיול כדי למדוד הולוגרמות דו-מימדיות מרובות עם זוויות תאורה משתנות. התאם את שלב התרגום כדי לאתר תא במרכז שדה התצוגה. ותחת הכרטיסיה רכישה, תן שם לדוגמה המדמיין.
לחץ על תצלום בזק תלת-מימדי כדי למדוד את ההולוגרמות של התא באמצעות אותן זוויות תאורה כמו בהולוגרמות הדו-מימדיות שנמדדו זה הרגע. כאשר הנתונים שנרכשו מופיעים בחלונית 'ניהול נתונים', לחצו לחיצה ימנית על הנתונים ולחצו על 'תהליך' כדי לבנות מחדש טומוגרמת אינדקס שבירה תלת-ממדית מההולוגרמות הדו-ממדיות באמצעות אלגוריתם טומוגרפיה defraction המיושם בתוכנת ההדמיה. לאחר ההדמיה, בחלונית 'ניהול נתונים', לחצו לחיצה ימנית על הנתונים ולחצו על 'פתח' כדי להמחיש את הנתונים.
לחצו על מרכז התא כדי למקם אותו מחדש ולחצו על RI Tomogram בחלונית 'מנהל הנתונים'. בכרטיסיה קבוע מראש, לחץ על טען ולחץ פעמיים על לימפוציטים. xml, שהיא פונקציית העברה מוגדרת מראש המסופקת על-ידי תוכנת ההדמיה כדי להמחיש את הטומוגרם בהתאם להפצות 3DRI.
גלול את העכבר כדי להגדיל את התצוגה ולגרור את התא כדי לסובב אותו לכל כיוון. עבור מיצוי תכונות מורפולוגיות וביוכימיות כמותיות מקם את כל הנתונים הטומוגרפיים בתיקיה אחת ופצל את סוגי התאים בתוך תיקיות משנה בודדות בתיקיה הראשית. לאחר מכן, פתח את קובץ החילוץ של התכונות המשלימות בתוכנת ההדמיה המתאימה וערוך את קו 14 כדי לייעד את תיקיית הטוסמוגרם שממנה יש לחלץ את הנתונים.
ערוך שורה 15 כדי לייעד את התיקיה שאליה יש לשמור את נתוני התכונה שחולצו ולבצע את הקוד. עבור כל טומוגרם ב ערכת הנתונים הקוד יחשב את שטח הפנים, נפח התא, הכדוריות, צפיפות החלבון והמסה היבשה לכל סף מדד שבירה. ללמידה וזיהוי בפיקוח השתמש באלגוריתם הפיצול האקראי הפשוט ב- MATLAB כדי לפצל באופן אקראי את נתוני התכונות שחולצו לתיקיות נפרדות של אימונים ובדיקות.
פתח את קובץ ההדרכה המשלים וערוך את קו 14 כדי לייעד את תיקיית ערכת ההדרכה, קו 16 כדי לייעד את התיקיה לשמירת המסווג המיומן, וקו 17 כדי להגדיר שם קובץ עבור המסווג. לאחר מכן בצע את הקוד. באמצעות התכונות שנבחרו של ערכת ההדרכה, הקוד יכשיר מסווג עם אלגוריתם השכן הקרוב ביותר של K וישמור את המסווג בתיקיה המיועדת.
לאחר מכן, פתח את קובץ הבדיקה המשלים שלוש וערוך שורות 14 עד 15 כדי לייעד את המסווג המיומן לבדיקה וקו 17 לייעד את ערכת הבדיקה המאומנת. לאחר מכן בצע את הקוד. המסווג יזהה את סוגי התאים של הלימפוציטים הבודדים במערכת הבדיקה.
כאן נציג 3D שניתנו tomograms אינדקס שבירה של לימפוציטים B, לימפוציטים T חיוביים CD4, ו CD8 לימפוציטים T חיוביים עם ערכות צבעים שונות, שהוקצו על פי ערכי אינדקס שבירה שהוקצו באמצעות תוכנת ההדמיה מוצגים. מתוך מדד השפירה ניתן לחשב תכונות מורפולוגיות וביוכימיות כמותיות. בניסוי זה הדיוק של סיווג לימפוציטים T ו- B היה 93.15% ו 89.81% עבור מקרי אימון ובדיקה בהתאמה.
לימפוציטים חיוביים CD4 ו- CD8 חיובי T היו מסווגים סטטיסטית, ואת הדיוק היה 87.41% ו 84.38% עבור ערכות אימון ובדיקה בהתאמה. לבסוף, הדיוק של מסווג ריבוי המחלקות וסוג התא היה 80.65% ו- 75.93% עבור שלבי האימון והבדיקה בהתאמה. האיכות ומספר התמונות חיוניים להצלחת טכניקה זו.
ככל שאיכות התמונה טובה יותר ונפח הנתונים גבוה יותר, כך דיוק הזיהוי טוב יותר. ניתן להשתמש בלמידה עמוקה כדי לנתח באופן מלא יותר את הנתונים המורכבים של הטומוגרם, ולשפר מאוד את ביצועי הזיהוי. כמו כן, פלואורסצנטיות והדמיה שלב כמותי תלת מימדי ניתן להשתמש כדי לחקור את הנתיב של תפקידים פיזיולוגיים של לימפוציטים מזוהה.
לאחר התפתחותה סללה טכניקה זו לחוקרים בתחומי הביולוגיה של התא והביו-רפואי לחקור מחלות עניין ספציפיות בתוך אורגניזמים שונים. ואכן, אימונולוגים בפרט, עשויים להפיק תועלת משימוש בטכנולוגיה חדשה זו לזיהוי אוכלוסייה מעניינת.
