שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגי האנושי, כגון כיצד תקשורת בין לויוציטים מתרחשת ברמה המולקולרית והתאירית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי תאי T אנושיים unpurified ניתן לנתח ex vivo בתקופה קצרה יחסית. הוכחת הליך זה תהיה הנינג קירשגסנר, טכנאי מהמעבדה שלנו.
התחל על ידי ערבוב מיליליטר אחד של דם היקפי אנושי שנמשך טרי עם 30 מיליליטר של חיץ תזה ACK בצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר שמונה דקות בטמפרטורת החדר, ממלאים את הצינור ב- PBS לשטיפת צנטריפוגה ומבזבזים את גלולה בשני מיליליטר של מדיום תרבות עבור דגירה של 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להוסיף חמש פעמים 10 כדי Staphylococcus aureus enterotoxin B או SEB טעון או נפרק תאים ראג'י ב 500 microliters של תרבות בינוני לתוך צינורות FACS בודדים, ואחריו 650 microliters של פאן-לויקוציטים.
לסובב את התרבויות שיתוף, ו resuspend כדורי ב 150 microliters של מדיום תרבות טרי עבור דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מערבולת עדין את התאים במשך 10 שניות ב 100 סל"ד תוך הוספת 1.5 מיליליטר של 1.5% paraformaldehyde. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, להפסיק את קיבעון עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת 1%BSA ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
תוסיפו את הכדורים ל-100 מיקרוליטרים של PBS פלוס BSA ו-0.1% סאפונין, ותוסיפו את דגימות התא לשתי בארות בודדות של צלחת U-bottom עם 96 בארות. לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הצלחת מחדש את כדורי ב 50 microliters של PBS בתוספת BSA ו סאפונין המכיל את נוגדנים פלואורופור הוסיף או תרכובות עניין עבור דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים ב 150 microliters של PBS בתוספת BSA וסאפונין ולתלות את כדורי ב 60 microliters של PBS.
כדי לדמיין את התאים לפי ציטומטריית זרימה, פתח את תוכנת הניתוח, בדוק את הרמה הנוזלית ולחץ על הפעלה בתפריט מכשיר. לאחר מכן, לחץ על טען וטען את הדגימות ליציאה כשתתבקש לעשות זאת. תחת הכרטיסיה תאורה, שנה את כוח הלייזר של העירור לאורכים המתאימים של הננומטר.
לאחר מכן, התאימו את השערים לערוצים 4 ו-11 והתאיימו את האזור לערוץ הראשון. כדי להעריך את התאמות הכוח של gating ולייזר, העבר את תפריט תצוגה לשער המתאים והתאם את השערים וכוחות הלייזר עד שהתאים וזוגות התאים יהיו גלויים. לאחר מכן, בכרטיסיה רכישת קבצים, הגדר את השם לדוגמה ואת מספר התמונות שיש לרכוש ואת השער המתאים עבור כתמי CD3 ולחץ על רכוש כדי להתחיל ברכישה.
כדי לנתח את תמונות התאים שנרכשו, פתח את תוכנת הניתוח המתאימה. בהתאם להוראות ברשימה הנפתחת פיצוי, לייצר מטריצת פיצוי ולשמור את המטריצה כמו ctm תאריך comp. לאחר מכן, פתחו קובץ תמונה גולמי לדוגמה והחלו את ctm תאריך ה-comp בחלון כדי ליצור את התמונה המפוצה ואת קבצי ניתוח הנתונים המוגדרים כברירת מחדל.
לאחר פתיחת קובצי התמונה המפוצים, המירו את התמונות למצב צבע. התאם את טבלאות בדיקת המידע כדי לקבל צבעים גלויים מיטביים בסרגל הכלים מאפייני גלריית תמונות. פתחו את מנהל המסכות בתפריט 'ניתוח' והגדירו את תאי T על-ידי בחירת מסיכת סף של 60% לערוץ 5 ומילוי המסיכה ליצירת מסיכת תא T.
לאחר מכן, בחרו 'מסיכת עמק' לערוץ 2 ברוחב של שלושה פיקסלים ליצירת מסכת העמק, ושלבו את מסכות התא T והעמק ליצירת מסיכת הסינפסה של תאי T. כדי לחשב את הביטוי הכולל של CD3 בתאי T, פתח את מנהל התכונות וצור את התכונה עוצמה, תא T, ערוץ חמש. כדי לחשב את הכמות הכוללת של F-actin בתאי T, צור את התכונה עוצמה, תאי T, ערוץ שש.
כדי להעריך את כמות ה- CD3 בסינאפסות חיסוניות, צור את התכונה עוצמה, סינפסה של תאי T, ערוץ חמש. כדי לקבוע את כמות F-actin בסינאפזה החיסונית, ליצור את התכונה עוצמה, סינפסה תא T, ערוץ שש. לבסוף, כדי להגדיר את העשרת F-actin ו- CD3, לחשב את היחסים של F-actin או CD3 בסינאפזה החיסונית ואת הביטוי הכולל של החלבון שנבחר, בהתאמה.
בגרפים אלה, סקירה של אסטרטגיית gating קריטי לכמת את העשרת החלבון בסינאפסה החיסונית בין תאים מציגי אנטיגן פונדקאית, או APCs, ותאי T ב pan-leukocytes unpurified נלקח מדגם דם אנושי בנפח נמוך מוצג. כאן מוצגות תמונות מייצגות של T-cell-APC עם רמות נמוכות של CD3 ו- F-actin בתוך הסינפסות החיסונית שלהם בהיעדר SEB, ואילו אלה T-cell-APC conjugates להפגין העשרה חזקה CD3 ו- F-actin בנוכחות SEB. בהיעדר סופראנטיג'ן, 15% מתאים T הציגו העשרה של CD3 ו- F-actin בסינאפזה החיסונית, ואילו העשרה של 29% נצפתה בנוכחות סופראנטיג'ן.
ואכן, בהיעדר סופראנטיג'ן, פחות מ-20% מכלל ה-F-actin בתאים מצטבר בסינפסה החיסונית, עם יותר מ-30% שנצפו בסינאפסה בנוכחות סופרנטיגן. יש לציין, CD3 מצטבר על הסינפסה החיסונית גם בהיעדר סופראנטיגן, אם כי הצטברות זו גדלה באופן משמעותי גם על ידי תוספת של סופראנטיג'ן, המדגים את הכושר של שיטה זו לכמת הצטברות חלבון בסינתפסה החיסונית T-cell-APC. לאחר השליטה, טכניקה זו ניתן להשלים בשש עד שבע שעות אם מבוצע כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול את כל הפקדים הרלוונטיים, כולל דגימות ללא סופראנטיג'ן, גם אם נעשה שימוש ב- APCs ללא SEB. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות על המבנה עדין של הסינפסה החיסונית. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התקשורת התאית לחקור את הסינפסה החיסונית בבני אדם למחקר בסיסי, ניסויים קליניים ומדעי התרגום.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לנתח את אזור החיבור T-cell-APC ואת הסינפסה החיסונית בתאי T אנושיים ex vivo. אל תשכח כי עבודה עם חומרים אנושיים ראשוניים יכול להיות מסוכן, כי אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות או עבודה תחת רמה biosafety שני תנאים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
