Questo metodo fornisce un'alternativa all'etichettatura convenzionale della fluorescenza e alla procedura di analisi della citometria del flusso, che richiedono molto tempo, sono costose e corrono il rischio di alterare la funzione cellulare dei campioni. Il principale vantaggio di questa tecnica è la tomografia tridimensionale dell'indice di rifrazione e l'apprendimento automatico sono metodi quantitativi e senza etichette che consentono un'identificazione dei linfociti rapida e accurata. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dei tumori del sangue e delle malattie autoimmuni in quanto l'identificazione dei linfociti può essere cruciale per la diagnosi delle malattie e un'adeguata applicazione del trattamento.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle popolazioni di linfociti, può anche essere applicato all'analisi di altre singole cellule di interesse, compresi i batteri. La dimostrazione visiva della tecnologia di imaging di fase quantitativa 3D è fondamentale, in quanto facilita una chiara istruzione su come eseguire la tecnica e può fornire informazioni sulle sue applicazioni. Inizia raccogliendo ogni sottoinsieme di linfociti mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza.
Per un'imaging ottimale, diluire ogni campione di cellule a una concentrazione di 180 cellule per microlitro di mezzo RPMI e iniettare lentamente 120 microlitri del primo campione diluito in una camera di imaging. Dopo aver confermato la mancanza di bolle all'interno della camera, posizionare una goccia di acqua distillata sulla lente oggettiva di un microscopio di fase quantitativa 3D e posizionare la camera di imaging sullo stadio di traduzione del microscopio. Regolare lo stage in modo che il campione si allinei all'obiettivo e fare clic sulla messa a fuoco e sulla superficie nella scheda di calibrazione della prospettiva del microscopio del software di imaging per regolare rispettivamente le posizioni assiali delle lenti obiettivo e condensatore.
Fare clic su Modalità automatica per allineare gli obiettivi e gli obiettivi del condensatore. Per ottimizzare l'allineamento, aprire la modalità di scansione e regolare manualmente gli obiettivi per allineare il modello di dispositivo micromirror digitale al centro. Quindi, tornare alla modalità Normale e regolare la fase di traslazione per individuare una cella nel campo visivo.
Regolare la posizione assiale dell'obiettivo per trovare il piano focale fino a quando il limite del campione visualizzato nello schermo è quasi invisibile. È importante regolare perfettamente la messa a fuoco della cella per generare un tomogramma 3DRI ottimale. Se l'immagine non viene scattata correttamente, la ricostruzione 3D sarà compromessa, con conseguente tomogramma rumoroso.
Regolare la fase di traslazione per trovare una posizione senza cella e fare clic su Calibra per misurare più ologrammi 2D con angoli di illuminazione variabili. Regolare la fase di traslazione per individuare una cella al centro del campo visivo. E sotto la scheda Acquisizione, assegnare un nome all'esempio da immagini.
Fare clic su Snapshot 3D per misurare gli ologrammi della cella utilizzando gli stessi angoli di illuminazione degli ologrammi 2D appena misurati. Quando i dati acquisiti vengono visualizzato nel pannello Gestione dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati e scegliere Processo per ricostruire un tomogramma indice di rifrazione 3D dagli ologrammi 2D utilizzando l'algoritmo di tomografia di defrazione implementato nel software di imaging. Dopo l'imaging, nel pannello Gestione dati fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati e scegliere Apri per visualizzare i dati.
Fate clic sul centro della cella per riposizionarla e fate clic su Tomogramma RI (RI Tomogram) nel pannello Gestione dati . Nella scheda Preimpostato fare clic su Carica e doppio clic su linfocita. xml, che è una funzione di trasferimento predefinita fornita dal software di imaging per visualizzare il tomogramma in base alle distribuzioni 3DRI.
Scorrere il mouse per ingrandire e trascinare la cella per ruotarla in qualsiasi direzione. Per l'estrazione quantitativa morfologica e biochimica, inserire tutti i dati tomografici in un'unica cartella e dividere i tipi di cella all'interno delle singole sottocartelle nella cartella principale. Aprire quindi il file di estrazione delle funzionalità supplementari nel software di imaging appropriato e modificare la riga 14 per designare la cartella del tomogramma da cui devono essere estratti i dati.
Modificare la riga 15 per designare la cartella in cui devono essere salvati i dati della funzionalità estratta ed eseguire il codice. Per ogni tomogramma del set di dati il codice calcolerà l'area della superficie, il volume cellulare, la sfericità, la densità proteica e la massa secca per soglia dell'indice di rifrazione. Per l'apprendimento e l'identificazione supervisionati utilizzare il semplice algoritmo di suddivisione casuale in MATLAB per dividere casualmente i dati delle funzionalità estratte in cartelle separate di training e set di test.
Aprire il file di formazione supplementare e modificare la riga 14 per designare la cartella del set di training, la riga 16 per designare la cartella per il salvataggio del classificatore sottoposto a training e la riga 17 per impostare un nome di file per il classificatore. Quindi eseguire il codice. Utilizzando le funzionalità selezionate del set di training, il codice addestra un classificatore con l'algoritmo K neighbor più vicino e salva il classificatore nella cartella designata.
Aprire quindi il file di test supplementare tre e modificare le righe da 14 a 15 per designare il classificatore addestrato da testare e la riga 17 per designare il set di test addestrato. Quindi eseguire il codice. Il classificatore identificherà i tipi cellulari dei singoli linfociti nel set di test.
Qui vengono mostrati tomogrammi rappresentativi dell'indice di rifrazione resa in 3D di linfociti B, linfociti T positivi CD4 e linfociti T positivi CD8 con diverse combinazioni di colori, assegnati in base ai valori dell'indice di rifrazione assegnati tramite il software di imaging. Dai valori dell'indice di rifrazione è possibile calcolare le caratteristiche morfologiche e biochimiche quantitative. In questo esperimento l'accuratezza della classificazione dei linfociti T e B è stata rispettivamente del 93,15% e dell'89,81% per i casi di allenamento e di prova.
I linfociti T positivi al CD4 e al CD8 sono stati classificati statisticamente e l'accuratezza è stata rispettivamente dell'87,41% e dell'84,38% per i set di training e test. Infine, l'accuratezza del classificatore multiclasse di tipo cella è stata dell'80,65% e del 75,93% rispettivamente per le fasi di training e test. La qualità e il numero di immagini sono essenziali per il successo di questa tecnica.
Migliore è la qualità dell'immagine e maggiore è il volume di dati, migliore è l'accuratezza dell'identificazione. Il deep learning può essere utilizzato per analizzare più completamente i dati complessi dei tomogrammi, migliorando al contempo le prestazioni di identificazione. Inoltre, la fluorescenza e l'imaging di fase quantitativa 3D possono essere utilizzati per studiare il percorso dei ruoli fisiologici dei linfociti identificati.
Dopo il suo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare e della biomedicina per esplorare specifiche malattie di interesse all'interno di diversi organismi. In effetti, gli immunologi in particolare possono trarre vantaggio dall'utilizzo di questa nuova tecnologia per identificare la popolazione di interesse.
