אנו מודים ד ר דוד המלך, הווארד יוז במכון הרפואי, האוניברסיטה של קליפורניה בברקלי ספקטרומטר מסה ניתוח והערות מועילות. אנו מודים ז'ו Xuelian ד ר, שנגחאי, מכוני המחקר למדעי הביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, שנחאיי, סין למתן מבנה CENP-F באורך מלא. לבסוף, אנו מודים ד ר סוזאן ביין, ד ר בריאן קאלהן, ד ר Grewer כריסטוף באוניברסיטת Binghamton על גישה לציוד. מחקר זה מומן על ידי קרן מחקר באוניברסיטת מדינת ניו יורק, במחלקה לכימיה, אוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב- Binghamton.

המחברים אין לחשוף.

שלנו assay קינאז במבחנה היא שיטה רבת עוצמה כדי לזהות מטרות מולקולריות עבור קינאז Cdk1, אשר הוא בקר מאסטר של מחזור התא, מווסת תהליכים תאיים חשובים רבים. השיטה קובעת אם חלבון מטוהרים מצע עבור Cdk1, מאפשר זיהוי של אתרי זירחון ספציפיים. זה מקל על מכניסטית ללימודי ויסות תהליכים תאיים על ידי זרחון דרך Cdk1.
הגורם הקריטי ביותר עבור זיהוי מוצלח אתרי זירחון באמצעות ספקטרומטר מסה הוא יעילות זרחון וזמינותו קינאז. היעילות זירחון של האתרים הבודדים צריך להיות גבוה ככל האפשר, רצוי 100%. זו יכולה להיות מושגת על ידי הגדלת כמות B Cdk1/cyclin והגברת זמן הדגירה ש 16. בעת חישוב הסכום של Cdk1/cyclin B הצורך, ריכוז מולרי של החלבון ואת המספר של זרחון אתרים יש לקחת בחשבון. הדבר חשוב במיוחד אם קיימים מספר אתרי זירחון חלבון המטרה. יש גם לציין כי הפעילות של B Cdk1/cyclin מסחרי יכול להשתנות אצווה כדי אצווה, קינאז יכול לאבד במהירות פעילות. אם במבחנה זרחון אינה מצליחה, מומלץ לבחון את פעילות קינאז. כפקד חיובי לפתרון, במבחנה זירחון של CENP-F (שאריות 2,987-3,065) יכול לשמש. כפקד שלילי, תגובה ללא תוספת B Cdk1/cyclin צריך להיות שבוצעה, ניתח. פקד שלילי שימושי נוסף הוא השימוש של מוטציה קינאז-מת של Cdk1, אשר catalytically אינו פעיל, עקב48,47,נקודה פשוטה מוטציה (D146N)49. בנוסף, כדי לוודא אתרי זירחון מזוהה, גירסה phosphonegative של החלבון היעד יכולים להיווצר, איפה אתרי זירחון מוחלפים על-ידי alanines. אם אתרי זירחון מזוהה נכונים, המוטציה phosphonegative המקביל אינו יכול להיות phosphorylated חוץ גופית בתוך.
כלי פשוט כדי לאתר מוצלח זרחון היתר של החלבון המטרה היא פשוטה מרחביות-דף ג'ל shift וזמינותו המתוארים כאן. חלבונים phosphorylated בדרך כלל נודדים לאט יותר בדף-מרחביות מאשר מקביליהם unphosphorylated, עקב גודל הוסיף מטענים שליליים. שימו לב כי עבור חלבונים גדולים, אופטימיזציה של ניתוח מרחביות-דף זה כדי לשפר את הרזולוציה מספיק כדי להמחיש את המשמרת ג'ל. כלי שימושי עבור הפרדת חלבונים phosphorylated ספציפי הוא מחייב פוספט לתייג עמודים מרחביות (Phos-תג). Phosphorylated חלבונים בג'ל המוכנים Phos-תג אקרילאמיד הם דמיינו כמו להקות נודדים לאט יותר בהשוואה המתאים dephosphorylated חלבונים50,51.
כדי לקבל ספקטרום המוני באיכות גבוהה, זה מאוד חשוב כי החלבון וזמינותו קינאז במבחנה הוא טהור, הומוגניות. פרוטוקול טיהור שלנו משיג זאת על ידי שילוב של מספר שלבים סלקטיבי מאוד כרומטוגרפיה, על-ידי מניעת השפלה חלבון וחמצון באמצעות התוספת של מעכבי פרוטאז ו reductants. פרוטוקול טיהור יכול להיות שונה כדי elute החלבון על ידי גלוטתיון (קרי, עם GST-תג שלמים); עם זאת, זה יש לקחת בחשבון כי GST-התג מוסיף עוד kDa 25, חלבונים גדולים מאתגרת את מטרות ספקטרומטר מסה. לחלופין, פרוטוקול שלנו טיהור שלו6-תג פיוז'ן חלבונים יכול לשמש גם.
פרוטוקול זה יכול גם להיות שונה כדי לזהות אתרי זירחון ספציפיות עבור kinases אחרים. הדרישה היחידה היא קינאז מטוהרים הוא זמין, פעיל, והוא מספיק יציב. Assay התנאים צריכים להיות מותאמים עבור כל קינאז להשגת פעילות מקסימלית. פרמטרים כדי למטב כוללים את הכמות של קינאז, התגובה מאגר (pH, ריכוז מלח), זמן הדגירה, טמפרטורת התגובה, וריכוז ATP. במבחנה קינאז מבחני שימשו בהצלחה כדי לזהות אתרי זירחון עבור רבים kinases כולל53,52,Plks (פולו דמוי kinases)54, ו- MAPK/טיפשה kinases (חלבון הופעל-mitogen kinases / חוץ-תאית-אות-מוסדר kinases)55,56.
בעוד כוחו של שיטה זו הוא לזהות אתרי זירחון ספציפי חלבון מטוהרים, יצוין כי אתר זרחון שהוא מטרה Cdk1 חוץ גופית בתוך לא יהיה בהכרח phosphorylated vivo בתוך. O בויו, מנגנונים רגולטוריים נוספים נמצאים במקום, אשר יכול לגמול אתר זרחון נגיש עבור זיהוי על-ידי Cdk1. לדוגמה, שותפים אינטראקציה נוספים עשויים להיות נוכח ויוו, תוכל להסתיר את אתר זרחון או להפוך אותו לנגיש באמצעות שינויים מבניים. יתר על כן, המצע צריך colocalize עם Cdk1/cyclin B בגרעין בשלב G2 כדי להיות phosphorylated. בנוסף, שינויים post-translational או תהליכים רגולטוריים אחרים יכול להשפיע על שיאשר היעד חלבון ויוואשר יכול לגמול אתר זרחון לא נגיש. מגבלות אלה ניתן להתגבר על ידי עיצוב המתאים ניסויים תאים או מודלים לאמת אתרי זירחון מזוהה שיש פונקציה פיזיולוגיים. כאן, אנו משתמשים וזמינותו של איגוד פשוט לצורך אימות פונקציונלי, מאז זרחון מפחיתה האינטראקציה של CENP-F עם karyopherin α. פונקציונלי אימות גם צריכה להתבצע בתוך ההקשר של תאים או במודל חיה. לכן, אנחנו גם transfected פיוז'ן פלורסנט חלבונים של CENP-F-קטעים שהכיל את cNLS לתוך תאים הלה10. מוטציות Phosphomimetic בתוך cNLS של CENP-F פחתה לוקליזציה גרעינית, אשר אישר תפקוד פיזיולוגי של אלה אתרי זירחון10.
מספר כלים זמינים עבור אימות פונקציונלי של אתרי זירחון תאים או בבעלי חיים. מוטציות Phosphomimetic, המחקות את ההשפעות של זרחון על ידי מטענים שליליים, נמצאים בשימוש נרחב למטרה זו. עבור אלה, אתר זרחון (סרין או תריאונין ברצף) מוחלף על ידי אספרטט או גלוטמט. היתרון הוא כי רק מוטציה של החלבון היעד נדרש. יצוין, בעוד phosphomimetic מוטציות שימשו בהצלחה במקרים רבים לצורך אימות פונקציונלי, הם בעיקר עובדים במקרים בהם שינויים תשלום המשתתף השולט תקנה ולא שינוי מבני. Phosphomimetic מוטציות להיכשל לחקות את ההשפעות של זרחון במקרים רבים אחרים (למשל, 11). עם זאת, גישות אחרות זמינים עבור אימות פונקציונלי של אתרי זירחון, כולל השימוש של מוטציות phosphonegative: מוטציות אלה למנוע זרחון על-ידי החלפת אתרי זירחון אלנין. גישה שימושית נוספת לאימות פונקציונלי בהקשר הסלולר היא הביטוי של מוטציה קינאז-מת של Cdk1, אשר הוא מומת על ידי48,47,קל-אל-להציג את נקודת מוטציה (D146N)49. ראוי לציין, מספר מעכבי Cdk1 מולקולה קטנה זמינים מסחרית כגון Flavopiridol ו- RO-3306, אשר יכול לשמש ללימודי פונקציונלי תאים או מודלים בעלי חיים7,8,11. מעכבי אלה מאופיין היטב, כמה הם בניסויים קליניים לטיפול בסרטן (עבור ראה סקירה9).
בעוד מספר רב של אתרי זירחון חלבונים זוהו במחקרים פרוטיאומיה מבנית, יחודיות קינאז הוא ברוב המקרים לא ידוע, וזמינותו קינאז במבחנה הוא אחד מהשיטות זמין לזהות סובסטרטים של Cdk1. היו בשימוש גם גישות אחרות. Cdk1 המטרות זוהו באמצעות אנזים Cdk1 מהונדסים. כולל כיס גדול של איגוד המצע, מקבל מגושם יותר גירסאות של ATP כמו המצע6. סובסטרט מגושם זה אין אפשרות לאגד אל kinases פראי-סוג. התוספת של radiolabeled ATP מגושם לתא לחלץ המכילים האנזים Cdk1 שונה ולכן שמוביל תיוג ספציפית של סובסטרטים ישירה של Cdk1. 200 Cdk1 המטרות זוהו ניצני שמרים בשיטה זו; עם זאת, זה לא ניתן להחיל בתרבית של תאים, אשר היא מגבלה קריטית. במחקר אחר, Cdk1 סובסטרטים אותרו בתאים תרביות רקמה אנושית על-ידי ביצוע ניתוח כמותי phosphoproteomics באמצעות שני מעכבי מולקולה קטנה של Cdk1, Flavopiridol ו- RO-3306. 1215 phosphopeptides על חלבונים 551 הצטמצמו באופן משמעותי על תוספת מעכב Cdk17. שיטה זו באפשרותך לסנן פרוטאום כולו כמטרה Cdk1, אך כתוצאה מטרות צורך לאמת, למשלעל ידי קינאז במבחנה וזמינותו.
בעתיד, וזמינותו קינאז במבחנה ככל הנראה ישולב עם תפוקה גבוהה תריסים סובסטרטים Cdk1 הנמצאות בשלבי פיתוח. בגלל המספר הגדול של Cdk1 מצעים בשנת פרוטאום, סובסטרטים רבים Cdk1 האנושי להישאר להיות מזוהה, וזמינותו קינאז במבחנה יהיה כלי חשוב כדי לזהות, מפת ולוודא באתרים אלה.
וזמינותו קינאז במבחנה הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות מטרות קינאז Cdk1 וכדי לזהות אתרי זירחון ספציפי. זיהוי של אתרי זירחון אלה מאפשר מכניסטית ללימודי ויסות תהליכים תאיים על-ידי Cdk1.

Kinases הם אנזימים להעביר קבוצות פוספט מ- ATP על גבי מצעים ולווסת תהליכים תאיים רבים. זרחון זה הוא הפיך, מהר, מוסיף שני מטענים שליליים, ו מאחסן אנרגיה חופשית, לאחד השינויים posttranslational הנפוצים ביותר בשימוש על ידי התאים. Cdk1, אשר ידוע גם בשם homolog חלבון 2 מחזור חלוקת התא (cdc2) הוא בקר ראשיים עבור מחזור התא כל פרוקריוטים1,2,3,4,5, phosphorylates משוער 8-13% פרוטאום6,7.
בעוד מחקרים פרוטיאומיה מבנית זיהו אתרים רבים זרחון של חלבונים, ברוב המקרים, קינאז האחראי לבצע שינויים אלה אינו ידוע. מספר יעדים Cdk1 הידוע, במיוחד בתאי אדם הוא נמוך7. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 חשובה, שכן היא מאפשרת מכניסטית מחקרים הקובעים איך Cdk1 שולט מחזור התא. מחזור התא תקנה חשוב עבור נאמן כרומוזום סגרגציה, חלוקת התא, מספר עצום של תהליכים תאיים צריך להתרחש כדי לתמוך תפקיד פיזיולוגי החשוב הזה. זה כולל עצירת תמלול ותרגום לפני תחילתה של מיטוזה, וכן ארגון מחדש דרמטי בתוך המבנה התאי של הארגון, כגון פירוק של מעטפת הגרעין, כרומוזום עיבוי, פלך mitotic הרכבה. והסחר הבינלאומי שגיאות בתהליכים אלה לגרום סרטן, מומים מולדים או מוות של תאים mitotic. מעכבים ספציפיים של Cdk1 כגון RO-3306 היו מפותחות8, אשר מספקים כלים רבי-עוצמה ללימודי פונקציונלי, חלק מעכבי אלה הם כיום בניסויים קליניים לטיפול בסרטן (ראה9 לבדיקה).
כאן, אנו מתארים של במבחנה קינאז assay המאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפית Cdk1. ב הזה assay, זמינים מסחרית B Cdk1/cyclin האנושי משמש phosphorylate יישום יעד מטוהרים חלבון במבחנה. זירחון של מצע מגבירה את המאסה שלו ומוסיף שני מטענים שליליים; לכן, זרחון מוצלחת אושר על ידי משמרת כלפי מעלה של הלהקה ג'ל חלבון בדף-מרחביות. אתרי זירחון ספציפי Cdk1 לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה ניתוח של החלבון במבחנה phosphorylated. כדי לסייע עם עיצוב ניסיוני, אנו בודקים גם כלים חישוביים והפניות לחיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מהרצף חלבון. יתר על כן, אנו גם מתארים פרוטוקולים טיהור המניבים ההכנות חלבון מאוד טהור, הומוגני מתאים וזמינותו קינאז. לבסוף, יש צורך לאמת את אתרי זירחון שזוהה על ידי מחקרים פונקציונלי, וזמינותו איגוד פשוט מתואר כאן למטרה זו. משולב, זה בגישה רב עוצמה מניב אתרי זירחון Cdk1 ספציפית ומאפשרת לימודים מכניסטית לתוך כמה Cdk1 שולט מחזור התא7,10,11. מאז בשיטה זו מסתמך על חלבונים מטוהרים, ניתן להחיל אותה על כל דגם האורגניזם, התשואות תוצאות אמינות. עם זאת, אימות פונקציונלי של ה זרחון שהושג אתרי במבחנה מומלץ, כמו תאים יש מנגנונים רגולטוריים נוספים במקום, כמו שינויים posttranslational, אינטראקציה עם שותפים או לוקליזציה הסלולר זה עלול להפוך את אתרי זירחון נגיש או נגיש עבור זיהוי על-ידי Cdk1.
Cdk1 מזהה אתר זרחון הסכמה המורכבת (Ser/חמישי-Pro-X-ליס/Arg), כאשר X הוא שאריות ו סרין או תראונין הוא האתר של זרחון. חשוב במיוחד עבור זיהוי היא הנוכחות של פרולין התנוחה +1. בנוסף, שאריות בסיסי המועדפות בעמדות +2 או +3, עם רוב אתרי זירחון ספציפי Cdk1 המכיל של ליס או Arg ב +3 מקם6,12.
הפעלה של Cdk1, והיא מובילה התחלתה של מיטוזה1,2,3,4,5. הפעילות של kinases תלויי-cyclin באופן כללי תלוי שיוכן cyclins נפרדות (cyclin A, B, C, D ו- E אצל בני אדם), אשר באים לידי ביטוי ב נדנוד רמות לאורך כל מחזור התא13. Cdk1 הביטוי הוא קבוע על פני מחזור התא וכן ברגולציה של פעילותה על השיוך שלו subunits תקינה cyclin A ו- cyclin B5,13,14,15, כמו גם שינויים post-translational. היווצרות הקומפלקס B Cdk1/cyclin נדרש קינאז הפעלה5,14,15,16,17,18. בשלב G2, הוא cyclin B המתורגמת את ציטוזול ולא לייבאו לתוך גרעין איפה זה נקשר Cdk15,14,15,16,17,18; עם זאת, Cdk1/cyclin B מתקיים לא מופעל על ידי זרחון על שאריות Thr14 ו- Tyr15 על ידי kinases Cdk1-מעכבות האנושי Myt1 (ממברנה-הקשורים טירוזין תראונין ספציפיים או cdc2-מעכבות קינאז) ו- Wee1, בהתאמה19, 20,21. בשלב G2 מאוחר, dephosphorylation Thr14, Tyr15 על ידי חלוקת התא מחזור 25 פוספטאז (cdc25) מפעילה את פעילות קינאז של המתחם B Cdk1/cyclin ותפעיל את החניכה של מיטוזה12,14, 18 , 20 , 22 , 23. זרחון של Thr161 גם נדרש עבור הפעלת B Cdk1/cyclin, מתווך על ידי Cdk7, קינאז (CAK) הפעלת Cdk18. השפלה של B cyclin "אנאפאזה" חלבונית Cdk1, המאפשר יציאה מן מיטוזה24,25. הפעלה של Cdk1/cyclin B לכן תהליך מסובך. פרוטוקול המובאת כאן מתבצע באמצעות B Cdk1/cyclin זמינים מסחרית. במהלך ביטוי רקומביננטי של מתחם זה בתאי חרקים, מופעל ויוו kinases אנדוגני14,20 , נותר פעיל במדינה מטוהרים. וכתוצאה מכך פעיל, רקומביננטי האנושי Cdk1/cyclin ב' מתאים במבחנה מבחני קינאז.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לצורך זיהוי ספציפי Cdk1 אתרי זירחון ב- F (CENP-F) חלבון10צנטרומר אנושי. CENP-F הוא חלבון קינטוכור שוכנת בגרעין במשך רוב לאטמוספרה (G1 ו- S-פאזי), ייצוא של ציטוזול ב- G2 שלב26,27,28 ב באופן תלוי-Cdk110, 11. גרעיני לוקליזציה שהוענקו דו-צדדי cNLS26. cNLSs מזוהים על ידי α karyopherin פקטור נשק גרעיני, אשר מקלה, יחד עם karyopherin β RanGDP, הייבוא של cNLS-מטען לתוך גרעין29. ייצוא גרעיני בשלב G2 הוא הקל דרך מסלול10ייצוא לא ידוע. ברגע CENP-F שוכן ציטוזול, זה הוא גויס על המעטפה גרעיני והוא בתורו מגייס חלבון מוטוריים מורכבים דינאין30,31. מסלול זה חשוב למקם את הגרעין בהתאמה centrosome במהלך בשלבים הראשונים של פלך mitotic הרכבה בצורה דינאין תלויית, וזה חשוב על העיתוי הנכון של הערך mitotic ועל תהליך מהותי במוח פיתוח30,31,32. החל בשלב G2, CENP-F הוא גם לצרפן יחד קינטוכור בהם לו תפקידים חשובים עבור נאמן כרומוזום סגרגציה27,28,33,34,35 . צעד רגולטוריות. מפתח של המסלולים הללו הוא הגרעין הייצוא של CENP-F בשלב G2, אשר תלויה Cdk110,11. נתאר כאן פרוטוקול לצורך זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 cNLS של CENP-F. Phosphomimetic מוטציות של אתרים אלה להאט גרעיניות הייבוא של CENP-F, רומז כי B Cdk1/cyclin ישירות מסדיר הסלולר לוקליזציה של CENP-F על ידי זירחון של שלו cNLS10.
בסך הכל, זה וזמינותו קינאז במבחנה מאפשר הזיהוי של סובסטרטים ספציפי עבור קינאז Cdk1. Purified היעד החלבונים הם phosphorylated במבחנה על-ידי Cdk1/cyclin B המתחם זמינים מסחרית של אתרי זירחון לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 תומך מחקרים מכניסטית לגלות איך Cdk1 שולט מחזור התא.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2800 ml baffled Fernbach flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>44232XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6506-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottletop filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENP-F (residues 2987 &#8211; 3065) pGEX6P1 plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorampenicol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-105-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D/L methionine</td>
			<td>Agros Organics / Fisher</td>
			<td>125650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting pipet tips: Zip tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZTC18S008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization Fourier transform ion</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>Apex III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclotron resonance mass spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>97040-276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC system: &#196;kta Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29032697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione, reduced</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation shaker: multitron shaker</td>
			<td>Infors</td>
			<td>I10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>karyopherin &#945; pet-28a pres plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani medium</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (0.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P6611-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 plasmid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9546-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P470-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS protease: PreScission protease</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phos-tag acrylamide</td>
			<td>Wako Pure Chem. Ind.</td>
			<td>304-93521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reduced gluthathione</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>055291D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>210518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>15 338 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>08 670B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing out rotor TX-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) הוא בקר ראשיים עבור המחזור תאים פרוקריוטים כל ו phosphorylates של % 8-13 המשוערת של פרוטאום; עם זאת, המספר של מטרות מזוהה Cdk1, במיוחד בתאי אדם הוא עדיין נמוך. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 חשוב, כפי שהם מספקים תובנות מכניסטית איך Cdk1 שולט מחזור התא. מחזור התא תקנה הוא קריטי עבור נאמן כרומוזום סגרגציה, פגמים בתהליך מורכב זה להוביל סטיות כרומוזומליות וסרטן.
כאן, אנו מתארים של במבחנה קינאז assay המשמש כדי לזהות אתרי זירחון ספציפית Cdk1. זה assay, חלבון מטוהרים שוכן phosphorylated במבחנה על ידי זמינים מסחרית מוצלחת ב' בני אדם Cdk1/cyclin זרחון אושר על ידי עמודים מרחביות, אתרי זירחון לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה. נתאר גם פרוטוקולים טיהור המניבים ההכנות חלבון מאוד טהור, הומוגני מתאים וזמינותו קינאז, ואת וזמינותו של איגוד עבור אימות פונקציונלי של האתרים זרחון מזוהה, אשר חוקרת את האינטראקציה בין אות לוקליזציה הגרעינית הקלאסית (cNLS), שלה α karyopherin קולטן של נשק גרעיני. כדי לסייע עם עיצוב ניסיוני, אנו בודקים גישות לחיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מ רצפי חלבונים. יחד פרוטוקולים אלה מציגים גישה רבת עוצמה מניב אתרי זירחון Cdk1 ספציפית ומאפשרת מחקרים מכניסטית לתוך כמה Cdk1 שולט מחזור התא. מאז בשיטה זו מסתמך על חלבונים מטוהרים, יכול להחיל אותה על כל דגם האורגניזם, התשואות תוצאות אמינות, במיוחד בשילוב עם לימודי תפקודי התא.

השתמשנו לאחרונה במבחנה קינאז assay (איור 1) כדי לזהות אתרי זירחון ספציפי Cdk1 קטע CENP-F שהכיל cNLS10. האות הזה מקנה גרעיני לוקליזציה של CENP-F במשך רוב לאטמוספרה. בשלב G2, CENP-F מיוצא מהגרעין ציטוזול באופן תלוי-Cdk1. כדי לקבל תובנות מכניסטית על איך Cdk1 מווסת את הסלולר לוקליזציה של CENP-F, ניתחנו את רצף CENP-F כדי לחזות אתרי זירחון Cdk1 ספציפי, באמצעות iGPS שרת36,37. בתוך cNLS של CENP-F, שלושה אתרי זירחון ספציפי Cdk1 היו החזוי ב שאריות 3,042, 3045, ואת 3,048 (טבלה 1). אתר זרחון Cdk1 ספציפי אחר היה גם חזתה שאריות 3,007 (טבלה 1)10. לכן, שיערנו כי Cdk1 מסדיר CENP-F לוקליזציה ישירות על-ידי זירחון של cNLS שלה.
כדי לבדוק אם cNLS של CENP-F הוא מצע עבור Cdk1, ביצענו וזמינותו קינאז במבחנה עם השבר CENP-F האנושי מטוהרים (שאריות 2,987-3,065), אדם Cdk1/cyclin דרב במבחנה phosphorylated CENP-F נותחו על 16% מרחביות עמודים, יחד עם פקד שלילי חסרה את קינאז Cdk1 (איור 2 א)10. עבור במבחנה phosphorylated CENP-F, משמרת ברור כלפי מעלה הוא ציין ללהקה על הג'ל לעומת הפקד שלילי. זה אופייני של חלבונים phosphorylated כל קבוצת פוספט מוסיף שני מטענים שליליים והמסה נוספים. תוצאות אלו מראים כי CENP-F הוא phosphorylated על ידי Cdk1/cyclin B10.
כדי לקבוע את מספר אתרי זירחון CENP-F וכדי לכמת את היעילות זירחון של אתרים אלה, ללא פגע במבחנה phosphorylated CENP-F השבר (84-mer) נותחה על ידי ספקטרומטר מסה (ESI-ITMS)10. נצפתה ESI-יון השמנה המונית הספקטרום (איור 2B) עולה כי הרסיס פגע CENP-F הוא phosphorylated ארבעה אתרים (טבלה 1)10.
המיקום של האתרים חומצת אמינו phosphorylated ברצף של CENP-F הוערכה על ידי בחינת מעכל tryptic על ידי גב' ESI-FTICR טריפסין cleaves שרשראות חלבון לאחר lysines, arginines, תקציר טריפסין השבר CENP-F הביא כמה פפטידים, כולל אחד שהכילו משקעים 3,031-3, 052. ספקטרום המונית של פפטיד CENP-F זה עלו בקנה אחד עם זרחון על שאריות T3042 T3045, S3048, אשר ממוקמים בתוך cNLS (טבלה 1)10. ספקטרום המונית של פפטיד tryptic אחרת (שאריות 2,995-3,016) היו בקנה אחד עם זרחון על S3007 (טבלה 1)10. כל אתרי זירחון ספציפי Cdk1 ארבע כהכרחיים גם מהרצף. Cdk1 ספציפיים סובסטרטים לעתים קרובות מכילים פרולין ליד השאריות זה phosphorylated6, כפי שנצפו שאריות T3042, T3045 ו- S3007. יצוין כי S3048 הוא אתר זרחון Cdk1 ספציפי בלתי רגיל, כמו פנילאלנין, ממוקם ליד סרין. לסיכום, התוצאות מראים כי CENP-F הוא במיוחד phosphorylated-שאריות 3,007, 3,042, 3,045 ו 3,048 מאת קינאז Cdk1. 3. שאריות אלו ממוקמים במרחק cNLS של CENP-F (טבלה 1), המציין כי Cdk1 יכול לווסת את CENP-F לוקליזציה הסלולר דרך זירחון של cNLS בשלב G2, כאשר Cdk1 הופך להיות פעיל10.
כדי לוודא כי אתרים זרחון Cdk1 ספציפיים אלה יש פונקציה פיזיולוגיים, יצרנו את phosphomimetic משתנה S3048D10. מוטציות Phosphomimetic לחקות את ההשפעות של זרחון על ידי שאריות טעונים שלילית. בשלב הבא, אנחנו טהור הגרסה phosphomimetic של השבר CENP-F שהכיל את cNLS. CNLS של CENP-F מזוהה על-ידי α karyopherin קולטן נשק גרעיני, אשר נקשר עם זיקה גבוהה והוא נדרש עבור ייבוא הגרעין של CENP-F. כדי לבדוק אם המוטציה phosphomimetic מחליש את האינטראקציה בין cNLS של CENP-F עם α karyopherin הקולטן שלו נשק גרעיני, נוכל לבצע איגוד וזמינותו (איור 3)10. בניסויים אלה, קטע CENP-F מטוהרים (הפראי-סוג או S3048D variant) היה מעורב עם α מטוהרים karyopherin האנושי, התערובת הופרד על ידי גודל אנליטי אי-הכללה של כרומטוגרפיה. בנוסף, החלבונים נותחו גם בנפרד. ניתוח מרחביות-דף של השברים • תנאי גילה כי השבר CENP-F פראי-סוג עם cNLS אינטראקציה חריפה עם karyopherin α, מאז שני חלבונים משותפת elute (איור 3)10. עם זאת, רק כמות זניחה של השבר CENP-F S3048D נקשר karyopherin α, חלבונים אלה elute בנפרד (איור 3)10. תוצאות אלו מציע את זרחון היתר של שאריות 3,048 של cNLS של CENP-F יהיה השפעה חזקה על האינטראקציה עם α karyopherin פקטור נשק גרעיני. יצוין כי המחירים גרעיניות הייבוא הם תלויים במידה רבה זיקתו של איתות לוקליזציה הגרעיני לעבר פקטור נשק גרעיני46, לפיכך, הוא צפוי כי מוטציות אלה להאט גרעיניות הייבוא10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של Cdk1 במבחנה קינאז וזמינותו. <a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig2.jpg"> איור 2: CENP-F הוא phosphorylated על ידי Cdk1/cyclin B. (א) כדי לזהות Cdk1 אתרי זירחון ספציפיים, assay קינאז במבחנה בוצעה עם מטוהרים CENP-F (שאריות 2,987-3,065). ניתוח מרחביות-דף של פקד שלילי ללא Cdk1/cyclin B מוצג בנתיב השמאלי (-Cdk1), ליד במבחנה phosphorylated CENP-F בליין נכון (+ Cdk1). משקל מולקולרי בתקנים מצוינים. הערה את השינוי כלפי מעלה של CENP phosphorylated-F בדף מרחביות, וזה מתאים זרחון מוצלחת. Cdk1 ו- cyclin B מופיעות להקות להתעלף 34 kDa ו 60 kDa. (B) ESI-יון מלכודת ספקטרומטר מסה של שלמה phosphorylated CENP-F (א) נעשה שימוש כדי לקבוע את העומס פוספט של שלמה phosphorylated CENP-F (84-mer). הספקטרום המוני המתאים מוצג. עוצמת מותווים לעומת היחס בנפח גדול לתשלום (מ/z). הספקטרום מראה את +10 +14 הברית תשלום של השבר CENP-F ללא פגע לאחר זרחון. הם מצביעים על אוכלוסייה מינים עם 0, 1, 2, 3, ו 4 אסטרים פוספט. כדי לכמת את היחס של כל מין לכמות החלבון הכולל, הגולן שיא היו נחושים, בהשוואה (טבלה 1). דמות זו שונתה מ-10 , שוחזר עם הרשאה על ידי טיילור ופרנסיס publisher. <a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig3.jpg"> איור 3: אימות פונקציונלי: phosphomimetic מוטציות של CENP-F חריפה לצמצם את האינטראקציה עם α karyopherin קולטן נשק גרעיני. (A–F) לטהר שברי CENP-F (שאריות 2,987-3,065) (0.1 מ ג) מטוהר karyopherin α (0.7 מ ג), היו מעורבים ב- 1:1 יחס טוחנת ואת נותחו על ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. שברי CENP-F ו- karyopherin α נותחו גם בנפרד. ניתוח מרחביות-דף של שברים שיא מוצג. • תנאי אחסון מצוינים על החלק התחתון (במרווחים של 0.6 מ"ל). בצד השמאל, עמדות של להקות סמן משקל מולקולרי של גושים שלהם kDa מצוינים. כוכבית מסמנת עקבות של משקעי GST (גלוטתיון S-טרנספראז). (א) Karyopherin (B) α. • תנאי פרופילים. ספיגת ב 280 ננומטר מותווים לעומת • תנאי האחסון. הפרופיל • תנאי karyopherin α (אדום) הוא בשכבות עם פרופילים • תנאי של תערובות של α karyopherin עם שברי CENP-F (פראי-סוג: ירוק; phosphomimetic S3048D מוטציה: כחול). שימו לב כי תוספת של השבר CENP-F פראי-סוג משמרות הנפח • תנאי של הפסגה α karyopherin למסה גבוה יותר, אשר עולה בקנה אחד עם קשירה של השבר פראי-סוג CENP-F. שינוי זה לא נוצרת כאשר השבר CENP-F עם המוטציה phosphomimetic S3048D נוספת, רומז כי המוטציה phosphomimetic פוחתת במידה רבה את האינטראקציה של CENP-F עם karyopherin α. (ג) CENP-F פראי-סוג שבר (wt) ו karyopherin α-(D) CENP-F wt פרגמנט. (E) S3048D CENP-F המקטע וגם karyopherin α. קטע S3048D CENP-F (F). איור זה נוצר עם נתונים מ-10. <a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">טבלה 1 א. רצף של השבר CENP-F (שאריות 2987-3065) עם חזה אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מודגשת על ידי גודל גופן גדול יותר. קטעים tryptic מסומן באותיות מודגשות, עם קו תחתון.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">GPLGSQQSKQDSRGSPLLGPVVPGPSPIPSVTEKRLSSGQNKAS</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">GKRQRSSGIWENGGGPTהרשות הפלסטיניתTPESFSKKSKKAVMSGIHPAE</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">טבלה 1. ניתוח ספקטרומטר מסה של CENP-F ללא פגע</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">מר 84 לאחר זרחון במבחנה עם Cdk1/cyclin B</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td># של אתרי זרחון (P) זוהה</td>
			<td>עומס פוספט המבוטא % חלבון סה</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">CENP-F 2987-3065</td>
			<td>P 0</td>
			<td>6%</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 P</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, P</td>
			<td>40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>P 3</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
<tr>
<td>P 4</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">שולחן 1C. ניתוח ספקטרומטר מסה של פפטידים tryptic של CENP-F לאחר זרחון במבחנה עם Cdk1/cyclin B</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td># אתרי זירחון</td>
			<td>עומס פוספט</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryptic phosphopeptide,</td>
			<td>P 0</td>
			<td>57%</td>
		</tr>
<tr>
<td>שאריות 2995-3016</td>
			<td>1 P</td>
			<td>43%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryptic phosphopeptide,</td>
			<td>P 0</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td>שאריות 3031-3052</td>
			<td>1 P</td>
			<td>64%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2, P</td>
			<td>29%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>P 3</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מסה ספקטרומטר ניתוח של השבר CENP-F לאחר זרחון במבחנה עם Cdk1/cyclin B. טבלה זו נוצר עם נתונים מ-10.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

18.4K Views.  State University of New York at Binghamton. קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

Video: Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. Y-27632 is a highly potent inhibitor of Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase (RhoA/ROCK) and is used to prevent dissociation-induced cell apoptosis (anoikis). We demonstrate that Y-27632 pretreatment for human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs+RI) prior to implantation results in a cell engraftment rate improvement in a mouse model of acute myocardial infarction (MI). Here, we describe a complete procedure of hiPSC-CMs differentiation, purification, and cell pretreatment with Y-27632, as well as the resulting cell contraction, calcium transient measurements, and transplantation into mouse MI models. The proposed method provides a simple, safe, effective, and low-cost method which significantly increases the cell engraftment rate. This method cannot only be used in conjunction with other methods to further enhance the cell transplantation efficiency but also provides a favorable basis for the study of the mechanisms of other cardiac diseases.

In this protocol, we demonstrate and elaborate on how to use human induced pluripotent stem cells for cardiomyocyte differentiation and purification, and further, on how to improve its transplantation efficiency with Rho-associated protein kinase inhibitor pretreatment in a mouse myocardial infarction model.

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...