אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של אליסון הכנסייה ציפור-אובורן אוניברסיטת בית הספר של רפואה וטרינרית לזרום Cytometry המתקן, עבור מימון NIH EHS R15 R15 AI107773, סלולר וביולוגיה מולקולרית לתוכנית ב אוניברסיטת אובורן במשך הקיץ מחקר מימון PBR.

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה בהתאם להמלצות המפורטות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים.
1. הכנה איסוף מוח עצם.
<ol><li>להכין 250 מ ל מדיה מלאה על-ידי הוספת פתרון של רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני עם סרום עגל עוברית 10%, 2 מ מ גלוטמין ו 50 מיקרומטר מרקפטואתנול לחלק העליון של יחידת 0.22 של הבקבוק מסנן ואקום מיקרומטר, ולהחיל על ואקום. הערה: בינוני מלא ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 חודשים.</li>
	<li>הכן 70% אתנול פתרון על ידי ערבוב 350 מ ל 100% אתנול עם 150 מ סטרילי H2O בבקבוקון 500 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה set כדי 4 ° C.</li>
	<li>לחטא מלקחיים, אזמל, מספריים ב-70% אתנול.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סרולוגית, הוסף 5 מ של מדיה מלאה שלוש צלחות פטרי 60 מ מ.</li>
	<li>שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 30 מ של התקשורת מלאה צינור חרוטי 50 מ.</li>
</ol>2. אוסף של תאים במח העצם מאתר
<ol><li>המתת חסד עכבר C57BL/6 על ידי הרדמה2 CO לפי הכללים שנקבעו על-ידי המנחים אמריקאי וטרינרי רפואי האגודה (AVMA) 2013 על המתת חסד.</li>
	<li>
להסיר, להסיר את הרגליים האחוריות.
	<ol>
<li>להרוות את הרגליים האחוריות ואת הגוף עם 75% אתנול, ולבצע חתכים דרך העור סביב מפרק הירך עם מספריים רקמה מעוקל. באמצעות מלקחיים, בחוזקה לנתץ את העור מן הירך לכיוון הקרסול, חשיפת השריר. להשתמש במספריים כדי להסיר את תוספת העור.</li>
		<li>הסר את כל הרגל על ידי חיתוך דרך העצם מעל מפרק הירך/הירך. הערה: בנוסף חיטוי האזור, האתנול לסייע במתן חתכים נקיים, למנוע זיהום הדגימות שיער.</li>
		<li>אם הרגליים יועברו למיקום חדש עבור מח עצם קציר, להטביע את הרגליים בתקשורת מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עובד אבטחה סטרילי ארון, להעביר את הרגליים לאחת המנות המוכנות בעבר פטרי.</li>
	<li>להשתמש במספריים לחתוך הצדיק מתחת לקרסול, ובזהירות להסיר כמה של רקמת חיבור שרירים ו אלסטית ככל האפשר. להעביר את העצם נקי הפטרי מוכן השני. הערה: למרות שזה לא הכרחי להסיר את כל השרירים, מדי רקמות הנותרים יכולים להקשות. להוריד את מח העצם.</li>
	<li>
הפרד את עצם הירך, הברך, שוקה.
	<ol>
<li>באמצעות מלקחיים, החזק את הרגל בברך ואתר את מח העצם. הערה: מח עצם צריך להיות גלוי כמו קו אדום חלש בפנים חלל העצם בחלק העליון של עצם הירך, לקראת סוף עצם השוקה.<ol>
<li>בעזרת מספריים, לבצע שלושה חתכים כדלקמן.<ol>
<li>חותכים בשוקיים מעל בה מח העצם מופיע כדי לסיים.</li>
				<li>לחתוך מתחת הברך.</li>
				<li>לחתוך קצת מעל הברך.</li>
				<li>אם עדיין מקושר מפרק הירך עצם הירך, לחתוך מתחת מפרק הירך.</li>
			</ol>
</li>
			<li>להחזיר הרסיסים שלושה הפטרי וחזור על התהליך הזה על הרגל השנייה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ריקון מח עצם הירך, שוקה.
	<ol>
<li>ממלאים מזרק 10 מ"ל עם מדיה להשלים צינור חרוטי 50 מ ל, ואת המחט 23 גרם.</li>
		<li>מחזיק את העצם עם מלקחיים מעל הפטרי השלישי מוכן, להוסיף את המחט לתוך התעלה עצם ודחף מדיה דרך, לשטוף החוצה את התאים (אשר עשויות להתגלות ללא פגע "הכנס" או כמו מספר אשכולות). חזור עד אין יותר צבע ניתן לראות דרך העצם. מילוי מחדש את המזרק עם המדיה לפי הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
למחוץ את epiphyses.
	<ol>
<li>אמנם עדיין בצלוחית הפטרי השני, להחזיק את הכובע הברך בחוזקה עם מלקחיים, מועכים את הברכיים עם קצה המזרק. ממשיכים עד epiphyses כבר לא אדום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות המזרק, להעביר את התאים השני והשלישי הפטרי הצינור 50 מ. הפרידה את הגושים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה. לא לנסות ליצור בועות. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>
Lyse כדוריות דם אדומות
	<ol>
<li>להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית, לסלק צניפה על ידי מצליף, ואת lyse כדוריות דם אדומות על ידי המקננת ב 1 מ"ל ACK (אמוניום כלוריד-אשלגן) פירוק מאגר עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בעזרת פיפטה סרולוגית, להוסיף 40 מ של מאגר HBSS (הנקס מאוזנת תמיסת מלח).</li>
	</ol>
</li>
	<li>שימוש של פיפטה סרולוגית, לסנן את התאים למרות מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סרולוגית, להסיר תאים supernatant, תשטוף עם 40 מ"ל של התקשורת מלאה. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: בשלב זה, שושלת היוחסין לימפוציטים חיובי ניתן להסיר באמצעות FACS או עמודה מגנטית טיהור. עם זאת, לימפוציטים לא נשמרות לטווח ארוך בתרבות. למרות מספר רב של תאים חיוביים שושלת היוחסין נמצאים ב- Ly6C-CD115-האוכלוסייה מח העצם ex-vivo, כמעט כולם נעדרים ביום 5 (איור 2).</li>
	<li>באמצעות פיפטה סרולוגית, הסר את תגובת שיקוע ולאחר התרבות התאים במח העצם בתקשורת מלאה עם 10 ננוגרם למ"ל של העכבר רקומביננטי GM-CSF-צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל.... הערה: בדרך כלל, 4 x 107 תאים הכולל ניתן לקצור לאחר פירוק תאי הדם האדומים. עם זאת, לצפות רק 2 x 107 למתחילים עד 5 x 107 תאים עבור תבואות מנוסים.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר את התאים תרביות רקמה צלחות, דגירה ב 37 ° C 5% CO2. אם באמצעות צלחת 24-ובכן, זרע אחד עם 2 מ"ל של התא השעיה.</li>
	<li>כל 48 שעות, להשתמש פיפטה סרולוגית להסיר חצי של המדיה ולהחליף עם מדיה שלם טרי ו- GM-CSF. הערה: תרבויות יכולה להישאר ערה עד 9 ימים. עם זאת, הרכב משתנה לאורך זמן. לקבלת מידע נוסף, ראה סעיף 3.</li>
</ol>3. בחירת יום מיון
<ol><li>כאשר תא האוכלוסייה יצירות להשתנות לאורך זמן, בחר ביום המניבה את המספר הגבוה ביותר של התאים הרצויים.</li>
	<li>עיין בטבלה 1 עבור המיון פוסט התשואה הצפויה תא לכל אחת האוכלוסיות לאחר 3, 5 ו- 7 ימים של התרבות ב- GM-CSF לכל עונה 1 פרק 107 תאים.</li>
</ol>4. צביעת אסטרטגיה
<ol><li>השתמש aliquots קטן של תאים כדי להכין דגימות הבקרה. כוללות פקד וללא רבב, דגימות הבקרה פיצוי מוכתם רק פלורסנט סוג נוגדן אחד כל אחת, ושולט זריחה-מינוס-אחד באילו נוגדנים כל נוספים. חוץ מאחד, כדי לשלוט על ידי קרינה פלואורסצנטית שאינם ספציפיים בערוץ זה. אם באמצעות תיוג עקיפה, כולל ראשי משני לבד, לבד, ואת שניהם ראשיים ומשניים. הערה: Phycoerythrin (PE) allophycocyanin (APC) מתויג נוגדנים לספק הפרדה ברורה עם דימום מינימלי מעל בעת השימוש בהן ביחד. עם זאת, אם fluorochrome האפשרויות מוגבלות, CD115 מתבטא ברמה נמוכה יחסית, בעוד Ly6C מתבטא ברמות גבוהות מאוד. לכן, fluorochromes בהיר רצוי עבור אנטי-CD115, fluorochromes אנטי-Ly6C הם נבחרו כדי למנוע דימום.</li>
	<li>הכן 100 מ של מאגר שטיפת FACS (FWB) על ידי ערבוב 97 מ ל תמיסת פוספט buffered צוננת של Dulbecco (DPBS) עם 3 מ"ל של עגל עוברית נסיוב צינור חרוטי 50 מ ל, ולמקם באמבט קרח.</li>
	<li>להשתמש על פיפטה פיפטה בעדינות, אך ביסודיות, תאים למעלה ולמטה כדי לסלק תאים חסיד באופן רופף.</li>
	<li>
שימוש של פיפטה סרולוגית, העברת תאים צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
	<ol>
<li>אם נפח התאים עולה 50 מ ל, להעביר המספר הדרוש של צינורות תאים ומשלבים בשלב מוכתמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה. הערה: אם מוות תאים גבוה צפוי, תאים יכולים להישטף עם FWB עם המתחילים 0.5% עגל עוברית סרום (FCS). פעולה זו תמנע תא הצליעה.</li>
	<li>
להשעות, כתם תאים לפי הוראות היצרן נוגדן.
	<ol>
<li>להשעות 5 x 107 תאים 1 מ"ל של FWB ולהוסיף 2 µg כל של אנטי-Ly6C, אנטי-CD115 המסומנת את fluorophores (של הבחירה של החוקר). לבידול נוסף CMP moDC (שתיהן Ly6C - ו CD115-), להוסיף 2 µg של נוגדנים אנטי-CD11c (CMP הם CD11c–; moDC הם CD11c+). תקופת דגירה של 30 דקות על קרח. הערה: איור 3 נוצר באמצעות Ly6C-PE ו- CD115-APC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 10 מ ל FWB, צנטריפוגה x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה.</li>
	<li>לפני השעיית תאים, קפיצי צינור ביסודיות כדי לסלק את גלולה. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להשהות את תאי-עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל של FWB, לסנן דרך מסנן תא 35-מיקרומטר. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר תאים מסוננים לתוך צינור פוליפרופילן, ומניחים על הקרח עד מוכנים למיון. הערה: אם פוליפרופילן אינו זמין, צינורות פוליסטירן חלבון מצופה (ללא שומן חלב יבש או FCS) יכול לשמש כדי להפחית את הכריכה.</li>
</ol>5. הגדרת שערים בהתבסס על דגימות הבקרה
הערה: כדי למנוע לשבירת תאים עקב הלחץ של הנחל זרימה מהיר, השתמש זרבובית מיקרומטר 100-130 למיון התא.
<ol><li>
להפעיל את פקד וללא רבב (ראה שלב 4.1) דרך סדרן התא, ולהחיל שער כדי לא לכלול את הריסות (פיזור קדמי נמוך; FSC) וגרגרים מאוד (פיזור גבוהים יחסית; חלקיקי האס).
	<ol>
<li>כדי לנתח רק בשלבים מאוחרים יותר (monocytes, moMac/MoDP ו- MoDC), החל gating רק לכלול תאים גדול יותר (FSC גבוהה).</li>
		<li>אם נעשה שימוש הכדאיות כתמים, השתמש ברשימות אלה כדי לא לכלול מוכתם, כלכלית אירועים (דוגמה מודגם באיור1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להריץ את דגימות הבקרה ניאון יחיד סדרן התא, והתאם פיצוי לפי הצורך.</li>
	<li>הפעל מדגם של המדגם התווית על-ידי ריבוי. להתבונן ארבע אוכלוסיות נפרדות: Ly6C + CD115-(Gmp), Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), ו- Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). החל שער כדי לבודד כל אחת מארבע הגדולות. הערה: CMPs ו- moDC לשתף את Ly6C-CD115-פנוטיפ. עם זאת, הם ניתן להבחין בהתבסס על הביטוי CD11c: CMP חוסר CD11c, ואילו MoDCs אקספרס CD11c.</li>
</ol>6. אוסף של אוכלוסיות מבודדות
<ol><li>להכין אוסף טורפדו על ידי הוספת FCS מספיק כדי להשיג לפחות 20% ריכוז סופי כשהם מתמלאים. לדוגמה, אם משתמש מ ל צינורות, להוסיף 1 מ"ל של FCS לפני מיון, להסיר את הצינור, כאשר הוא מגיע הנפח הכולל 5 מ.</li>
	<li>
למניעת ספיגת מחזור ונוגדן ממברנה, שמור כל דוגמאות (מעורבב וממוינות) ב 4 ° C במהלך המיון.
	<ol>
<li>אם הדבר אינו אפשרי, לשמור על הצינור המכילות את התאים ניתן למיין על הקרח ככל האפשר ולהעביר aliquots בסדרן כנדרש.</li>
		<li>בנוסף, העברת ממוין דגימות קרח כל 20-30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר שנאסף מספר התאים הרצוי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים צינור חרוטי. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.<ol>
<li>לאשר טוהר עם מיון שלאחר ניתוח על aliquots קטן מתוך כל אוכלוסיה שנאספו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, להשעות ב 10 מ"ל של FWB, צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות חוזר עבור סכום של שני מנקי. הערה: זה יכול להיות קשה להסיר את כל תגובת שיקוע ללא הם מוציאים בגדר. הצמדת טיפ פיפטה קו ואקום יכול לעזור עם הסרת. אם זו אינה זמינה, הוא הציע תגובת שיקוע ייאספו בשפופרת טריים במקרה של דיסוציאציה גלולה.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע לאחר לשטוף את השני.</li>
	<li>אם עיצוב ניסיוני של המשתמש מכתיבה התאים להיות תרבותי מחדש, בצע את השלבים 2.12 – 2.14. אחרת, אם תאים ישמש לצורך בדיקה באופן מיידי, להכין תאים לפי הנוהל הרצוי. הערה: דוגמה אופיינית אנליזה פונקציונלית נכללת באיור 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+development+and+function+of+dendritic+cell+subsets+by+GM-CSF:+more+than+a+hematopoietic+growth+factor.">The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor.</a> Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+cytokine,+GM-CSF,+alters+the+developmental+outcome+of+murine+dendritic+cells.">The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells.</a> Eur J Immunol. , (2012).</li><li>van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+development+by+GM-CSF:+molecular+control+and+implications+for+immune+homeostasis+and+therapy.">Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy.</a> Blood. 119, 3383-3393 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+dendritic+cells.">Myeloid dendritic cells.</a> J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+development+and+maturation.">Dendritic cell development and maturation.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).</li><li>Pierre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+MHC+class+II+transport+in+mouse+dendritic+cells.">Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells.</a> Nature. 388, 787-792 (1997).</li><li>Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells:+antigen+presentation,+accessory+function+and+clinical+relevance.">Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).</li><li>Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+Grown+Bone+Marrow+Derived+Cells+Are+Composed+of+Phenotypically+Different+Dendritic+Cells+and+Macrophages.">GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages.</a> Mol Cells. 39, 734-741 (2016).</li><li>Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+developmental+stages,+kinetics,+and+phenotypes+exhibited+by+myeloid+cells+driven+by+GM-CSF+in+vitro.">Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro.</a> PLoS One. 12, e0181985 (2017).</li><li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c(+)MHCII(+)+Macrophages+and+Dendritic+Cells.">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42, 1197-1211 (2015).</li><li>Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+maturation+and+cross-presentation:+timing+matters!.">Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!.</a> Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).</li><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions.">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).</li><li>Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Dendritic+Cell+Maturation+in+the+Induction+of+Insulin-Dependent+Diabetes+Mellitus.">The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus.</a> Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).</li><li>Shortman, K., Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+and+inflammatory+dendritic-cell+development.">Steady-state and inflammatory dendritic-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).</li><li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking.">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li><li>Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+pro-DCs+and+pre-DCs+in+vitro.">Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro.</a> Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).</li><li>Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+stages+of+myeloid+dendritic+cells+in+mouse+bone+marrow.">Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow.</a> Int Immunol. 15, 515-524 (2003).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311, 83-87 (2006).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+CD8{alpha}-Positive+Dendritic+Cells+from+a+Common+Myeloid+Progenitor.">Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor.</a> Science. 290, 2152-2154 (2000).</li></ol>

המחברים לך אין קונפליקטים לחשוף.

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של מונחי-GM-CSF קדמון, קודמן סוגי תאים במספרים מספיק עבור מספר סוגי ניתוחים כולל מבחני הביוכימי, מבחני תפקוד התאים בתוך חוץ גופיתאו החדרה בתוך vivo. שיטה זו מייצגת התקדמות משמעותית בתחום של פיתוח נגזר מונוציט תא דנדריטי, המאפשר את אמין בידוד וזיהוי של תאים בתחילת מסלול זה של התפתחות, כמו גם סוגי תאים הבדיל האלה יותר נפוץ מבודדים במחקרים קודמים.
הפרוטוקולים הקודמים עבור בידוד של אבות ו מבשרי המופקים מח עצם במבחנה צריכים לסמוך על CFSE מכתים לזהות תאים proliferative קדמון 17 או על צביעת עם CD31 ו- Ly6C כסמנים של התאים מיאלואידית 18 . CFSE מכתים פרוטוקול שתואר על ידי Naik תוכנן לשימוש בדור של אבות ו מבשרי DC מבוססת Flt3L 17. כאשר ניסינו גישה זו במערכת התרבות GM-CSF, נתקלנו בשני נושאים עיקריים. CFSE היה ציטוטוקסיות במקצת על התאים המתפתח והיה כל כך בהיר (אפילו בתאים חצויות) שהוא גרם פיצוי קשה. גישה זו הוכיחה להיות מתאימים עבור המטרות שלנו של בידוד סוגי תאים מוקדמת (אבות), כמו גם תאים הקשת התפתחותית, מ מאוד המקדימות (CMPs/Gmp) כדי מפותחת (MoDC/MoMac). ניסינו גם את אסטרטגיית המיון עבור תאים מונחה-GM-CSF, שתואר על ידי הקבוצה של Leenen, אשר היה מבוסס על CD31 ו- Ly6C 18. עם זאת, מצאנו כי CD31 היה בעייתי. זה בא לידי ביטוי ברמות נמוכות מאוד (מה שהופך אותו קשה resolve האוכלוסיות למיון נקי) על ידי תת קבוצה קטנה vanishingly של תאים, ולא רק מוקדם מאוד במהלך תקופת תרבות. למעשה, ביטוי CD31 לא היה לזיהוי אחרי היום 2 של התרבות ב- GM-CSF 10.
Ly6C, לעומת זאת, היה מולקולה מאוד שימושי עבור הפרדת תאים בשלבים שונים של פיתוח בשל דפוס שלו ארעית של הביטוי 10. התוספת של CD115 אפשרה לנו להבחין באופן הדוק יותר תאים ביניים ולאחר מכן שלבי ההתפתחות היתה בלתי אפשרית עם CD31. בדקנו גם סמנים אחרים של אבות CD34 ו CD117 בתקווה לבודד מספר גדול של תאים מוקדמת אלה 10. עם זאת, בניגוד שדיווח במערכת Flt3L, מצאנו כי CD34 ו- CD117 באו לידי ביטוי גם על תת קבוצה קטנה מאוד של תאים, נעדרו כמעט על ידי יום 3 של תרבות 17. סמנים אלה תאי גזע עשוי להיות שימושי ב מחקרים עתידיים עם זאת, כדי להבחין בין קבוצות משנה בתוך האוכלוסיות CMP או GMP.
ישנם מספר פוטנציאלי שינויים בפרוטוקול שעשויים להשפיע על התשואה של אוכלוסיות התאים הרצויים. ראשית, המשתמש עשוי לבחור להחיל כתם הכדאיות כדי לא לכלול תאים מתים. על סמך התצפיות, הקצב של תאים מתים בתוך קדימה טיפוסי עם השער הצדדי פיזור נמוך יחסית באופן כללי, בעייתית רק במהלך הימים הראשונים של תרבות, חופפת ירידות לימפוציטים חיובי השושלת. עם זאת, עבור יישומים בתא שבו מספרים חייב להיות מדויק, כתם הכדאיות תבטיח אי-הכללה של תאים מתים.
שינוי פוטנציאליים השני הוא דלדול של לימפוציטים שושלת היוחסין-חיוביות לפני תרבות. ניסינו בגישה זו כדי לטפל באוכלוסייה קטן של תאים חיוביים שושלת היוחסין כי נצפו באופן קבוע בתוך האוכלוסיה Ly6C-CD115-תא. התשואה הכוללת של תא היה מעט נמוך יותר ימים 5 ו- 6, הטוהר לא היה גבוה משמעותית (נתונים לא מוצג). לפיכך, הטוהר אינו מצדיק את התשואה מופחת. באופן דומה, אם המשתמש מתכננת למיין ביום 5 או לאחר, התדירות של לימפוציטים בתוך התרבות נמצא מתחת 1%, לא צריך להציג את הבעיה.
בסופו של דבר, כי אסטרטגיה זו נועד לבודד תאים על-פני קשת התפתחותי גדול המשתמש צריך להתאים העיתוי של המיון שלהם כדי לאסוף כמה שיותר של אוכלוסיות הרצוי ככל האפשר. אסטרטגיה זו המיון התשואות בנאמנות את סוגי תאים שצוין ללא קשר היום של התרבות שבה התאים מסודרים. לדוגמה, תאים עם פנוטיפ Ly6C + CD115-CD11c-הם נאמנים פנוטיפ GMP ו- function באופן דומה אם הם ממוינים, מבודד ביום 3 או 5 של תרבות. עם זאת, התדירות של תאים אלה גדול בהרבה ביום 3 5, אז אם המטרה היא בידוד מסוג זה התא, מיון ביום 3 להיות מומלץ. זה גם ראוי לציון כי תאים ממוינים לפי יום 3 ההתקדמות בשלבים התפתחותיים הבאים עם קינטיקה איטי יותר מאשר אם הם היו מיון ביום 5 או 7 (איור 3).
אמנם שיטה זו מאפשרת בסימון ברור של בידוד של 5-6 אוכלוסיות שונות לאורך הקשת התפתחותית, ישנם סביר אוכלוסיות רבות יותר או שלבי המעבר לאורך מסלול זה. בתוך כל אחת חמש שתואר ייתכנו מספר אוכלוסיות תת-דרגות שונות במקצת של פיתוח. לדוגמה, הבחנו "ברורים" אוכלוסיות עם רמות בינוניות של CD115 ושל Ly6C אשר עוברים דפוסי שונה במקצת של פיתוח, מבחינת כמה moMac ו moDC הם שנוצר (נתונים לא מוצג). סביר גם כי אוכלוסיות שנצפו בעבר ויוו נמצאים תרבות ובמערכת המיון, אך אלה היה קשה לזהות עקב תדירות נמוכה מאוד שלהם. אוכלוסיות כגון cMOP 19, MDP 20או CDP 21 המתנה סביר, אך ייתכן יהיו מטושטשים בתוך האוכלוסיות גדול יותר. מחקרים עתידיים, יהיה צורך כמוסיף בשלבים התפתחותיים רבים שעשויים להיות מבודד במסגרת המיון עם התוספת של סמנים ספציפי של בידול. הערך של אסטרטגיה זו המיון הוא שהיא מאפשרת עקבי בידוד מספר גדול של אנשים. שלבים במהלך DC ontogeny.

Culturing תאי מח עצם מאתר עם ציטוקינים גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) נעשה שימוש נרחב ככל שיטה לייצר נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC; ידוע גם בשם DC דלקתיות) מספרים גדולים 1, 2,3,4,5. תאים אלה היה שימושי ביותר במגוון רחב של מחקרים של תא דנדריטי (DC) פונקציה 6,7,8. בדרך כלל, אלו תאים במח העצם מאתר בתרבית למשך 6-8 ימים הינם ואז משמשים למחקר של הפונקציה תא דנדריטי 5. תרבויות אלה היו מזמן נחשב בעיקר הומוגנית, המורכב רוב moDC הבדיל. לאחרונה, כבר ברור כי בסוף תקופה זו תרבות 6-8 יום, ישנם רבים אכן moDC, כמו גם משנה גדולה מתוך הבדיל נגזר מונוציט מקרופאגים (moMacs) 9,10,11. מחקרים שלנו עוד יותר הרחיבו ממצאים אלה מדגימים כי קבוצות אחרות משנה של תאים פחות מפותח, כמו סימנים מקדימים moDC (moDP) ומונוציטים, יישארו בתרבויות בתדר נמוך גם לאחר 7 ימים 10. לכן, מחקרים של תאים דנדריטים (DC) פונקציה באמצעות תאים שנוצרו על-ידי מערכת זו יכול לשקף את התגובות של קבוצה רחבה יותר של סוגי תאים מאשר בעבר מוערך.
למדנו הרבה מאוד מן המחקר של GM-CSF-שנוצר moDC הנוגעים הפונקציה של תאים אלה בשלבים האחרונים של בידול 12,13,14. עם זאת, אנו מבינים באופן משמעותי פחות על מסלול התפתחותי אלה תאים15, 2,16 , של איך ומתי הם מציגים ספציפי פונקציות כגון: היענות הפתוגן הקשורים מולקולרית דפוסי (PAMPs), phagocytosis, עיבוד והצגת אנטיגן 13ועל פעילות אנטי בקטריאלי. פרוטוקול עבור בידוד של מספרים גדולים של אבות DC מבוססת Flt3L המקובלת, מבשרי כבר דווח על 17. בידוד של אוכלוסיות שונות אלה הושג באמצעות אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE)-צבעונית תאים במח העצם (כדי לעקוב אחר תאים החלוקה) ותרבות Flt3L במשך 3 ימים. התאים היו אז דלה של תאים חיובית linage, מתמיינים קדמון לאוכלוסייה קודמן בהתבסס על הביטוי CD11c 17. גישה אחרת על ידי הקבוצה של Leenen כדי לזהות מוקדם המוצא לאגס התרבותי DC בתרבות מונחה-GM-CSF היה כדי למיין התאים בהתאם CD31 ו- Ly6C 18. המטרה הראשונית היתה ליצור שיטה דומה עבור קבלת אבות סימנים מקדימים של moDC מונחה-GM-CSF. בשל סוגי תאים מסוים שנוצר על ידי GM-CSF, שינינו את הגישה ומיון אסטרטגיה המבוססת על הביטוי של מולקולות שבאו לידי ביטוי מוקדם ומאוחר יותר שלבי ההתפתחות. בסופו של דבר קבענו את זה Ly6C, CD115 (קולטן CSF-1), CD11c היו הסמנים הטוב ביותר עבור הבחנה תא אלו סוגי 10.
כאן, אנו מציגים שיטה עבור בידוד של תאים-מספר שלבים של פיתוח לאורך מסלול של בידול מונע על ידי GM-CSF: נפוץ מיאלואידית קדמון (CMP), גרנולוציט-מקרופאג קדמון (GMP), מונוציט, נגזר מונוציט מקרופאג (MoMac), נגזר מונוציט DC (MoDC). האוכלוסייה moMac יכול להיות עוד יותר הפרדה המבוססת על רמה של מחלקה MHC II ביטוי, חשיפת האוכלוסייה (moDP) קודמן 10moDC. אנו מנצלים במהירות גבוהה תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) אסטרטגיה כדי לבודד אוכלוסיות אלה 5 מבוסס על הביטוי של Ly6C, CD115 ו- CD11c. ואז נדגים את הבדיקה של תאים אלה במבחני פונקציונלי חושף את התגובות שלהם PAMP גירוי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30014.04</td>
			<td>to supplement complete medium and FWB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050</td>
			<td>to supplement complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>190242</td>
			<td>to supplement complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75mM Vacuum Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4045</td>
			<td>to sterilize complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>to lyse red blood cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CM</td>
			<td>to rescue leukocytes after red blood cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco&#39;s</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>must be endotoxin free; chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35&#181;m Cell filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>to break apart clumps before running through cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Biosource</td>
			<td>PMC2011</td>
			<td>usable concentration of 10ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cultured treated plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td>for bone marrow cells after harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6C, Clone HK1.4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD115, Clone AFS98</td>
			<td>Tonbo Bioscience</td>
			<td>20-1152-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11c, Clone HL3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557400</td>
			<td>to differeniate CMP and MoDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XPD Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>660517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Petri Dish</td>
			<td>Corning, Inc</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Female; 10-20 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8354-30-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810&#160;R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software v10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Version 10</td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of large numbers of myeloid progenitors and dendritic cell precursors from murine bone marrow using a novel cell sorting strategy

תרבויות נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC) המופקים מח עצם העכבר באמצעות גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) הוכרו לאחרונה להיות הטרוגניות יותר מאשר בעבר מוערך. תרבויות אלה מכילים באופן שגרתי moDC גם נגזר מונוציט מקרופאגים (moMac), ואפילו כמה תאים פחות מפותחת כמו ומונוציטים. המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק שיטה עקבית עבור זיהוי והפרדה של סוגי תאים רבים נוכח בתרבויות אלו כפי שהם מפתחים, כך הפונקציות הספציפיות שלהם עשויים ייחקר בהמשך. האסטרטגיה מיון המוצגים כאן מפריד תאים תחילה לתוך ארבע אוכלוסיות בהתבסס על הביטוי של Ly6C ו CD115, אשר שניהם באים לידי ביטוי transiently על ידי תאים כפי שהם מפתחים בתרבות מונחה-GM-CSF. אוכלוסיות אלה ארבעה כוללות אבות מיאלואידית נפוצות או CMP (Ly6C-, CD115-.), אבות גרנולוציט/מקרופאג או GMP (Ly6C +, CD115-.), ומונוציטים (Ly6C +, CD115 +), ו מקרופאגים נגזר מונוציט או moMac (Ly6C-, CD115 +.). CD11c נוספה גם אסטרטגיית המיון כדי להבחין בין שתי האוכלוסיות בתוך ה Ly6C-, CD115-האוכלוסייה: CMP (CD11c-), moDC (CD11c +). לבסוף, שתי האוכלוסיות עשויים להבחין נוסף בתוך ה Ly6C-, CD115 + אוכלוסייה בהתבסס על הרמה של מחלקה MHC II הביטוי. MoMacs אקספרס רמות נמוכות יותר של מחלקה MHC II, בעוד הקדמה DC נגזר מונוציט (moDP) מבטא גבוה יותר מחלקה MHC II. שיטה זו מאפשרת בידוד אמין מספר אוכלוסיות שונות מבחינת במספרים מספיק עבור מגוון רחב של ניתוחים פונקציונליים וההתפתחותי. אנחנו מדגישים אחד כזה פונקציונלי את המחוון דיפרנציאלית התגובות אחד מסוגי התאים גירוי עם דפוסים מולקולרית של Pathogen-Associated (PAMPs).

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy at JoVE.com

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.0K Views.  Auburn University. כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

Video: Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.