למחקר שמתבצע על ידי המחברים נתמך בחלקה על ידי מענקים מן האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט הסכם מס 229239 ומן קרן אאו, גישוש מחקר שיתופי מחקר תוכנית חריפה הסחוס פציעה/הנגע/פגם (ה-CRP ACI) תחת הפרויקט Bioactive, פיגומים ביונים עבור התחדשות הסחוס (BIOCART).

1. עצמי וההספק פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה
<ol><li>להכין פתרון 0.5% של פפטיד RAD16-אני ב- 20% (w/v) סוכרוז, צינור מיקרו-צנטריפוגה. Sonicate הפתרון פפטיד עבור 20 דקות באמבט אולטראסוני-כוח מרבי, בטמפרטורת החדר (RT) כדי להבטיח ערבוב הומוגנית. הערה: הנפח של פתרון להיות מוכן יהיה תלוי המספר של בסיס הרצוי. RAD16-אני פפטידים אינם סובלים השפלות בתנאים אלה sonication.</li>
	<li>לדלל את הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1.1 עם נפח נחוץ סוכרוז 10% (w/v) כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי. הערה: גורם חשוב שיש לקחת בחשבון הוא ההתאמה של הריכוז ההתחלתי פפטיד מאז הקשיחות מטריקס הסופי יהיה תלוי בפרמטר זה. RAD16-אני פפטיד פתרון צריך להיות 2 x יותר מרוכז יותר הריכוז הסופי הרצוי של הבונה תלת-ממד. בדרך כלל, RAD16 האחרון-אני ריכוזים פפטיד המשמש הן בין 0.15 – 0.5% (w/v).</li>
	<li>מקם את הצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את הפתרון פפטיד לתוך באמבט אולטרא-RT במשך 20 דקות כדי להבטיח ערבוב הומוגנית. הערה: הפתרון פפטיד, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב 4 º C.</li>
</ol>2. התא ההשעיה הכנה
<ol><li>Centrifuge התליה תא (שהושג לאחר הטיפול טריפסין) 60 x g ו- RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של פסטר חיבור לקו ואקום והשהה בגדר תא ב- 3-5 מ של 10% (w/v) סוכרוז באמצעות של micropipette. להמשיך לספור תאים באמצעות מונה תא הידנית או האוטומטית. הערה: הפתרון סוכרוז 10% (w/v) היא מדיום מול, ללא יונית זה מאפשר תחזוקה התא ומונעת פפטיד gelation במהלך תהליך ערבוב.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא 60 x g ו- RT עבור 5 דק. הסר תגובת שיקוע והשהה בגדר תא שוב בהיקף הדרוש של 10% (w/v) סוכרוז להשיג להכפיל את הריכוז תא הסופי הרצוי (recommendable כ 4 x 106 תאים / mL).</li>
	<li>הכנס מספר הרצוי של תרביות רקמה מוסיף כל טוב של צלחת 6-טוב (אחד insert לכל כימוס).</li>
	<li>Sonicate הפתרון פפטיד מוכן בשלב 1 כוח מרבי, RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה, המקום µL 40 של התליה תא (להשיג ב- 2.3) עבור כל כימוס הרצוי ובנוסף כ- 10 – 15% נפח נוסף לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה רגילה.</li>
</ol>3. תלת-ממד תא כימוס לתוך לטמבלים
<ol><li>לערבב של נפח שווה RAD16-אני הפתרון ב 10% סוכרוז (w/v) (40 µL לכל כימוס) עם אמצעי אחסון שווה של התליה תא (40 µL לכל כימוס) מוכן בשלב 2 כדי לקבל השעיה של תאים ירידה בריכוז פפטיד הרצוי (ב 10% סוכרוז). מערבבים על-ידי pipetting באיטיות לאורך כ 10 פעמים. למנוע היווצרות בועה במהלך ערבוב. הערה: שלב זה הוא קריטי, חייב להתבצע בזהירות רבה מאז התאים נמצאים בתנאים עוינים עקב פפטיד pH נמוך (כ 3.5-4.0).</li>
	<li>שימוש של micropipette, טען בקפידה µL 80 של ההשעיה כל הוספה.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ"ל של תרבות התקשורת לתחתית הבאר להרטיב את הכנס רפידה, המאפשר תקשורת דיפוזיה לקדם פפטיד הרכבה עצמית ויצירת הידרוג. תן את פפטיד ג'ל למשך כ 20 דקות בארון זרימה. הערה: המניפולציה של הדגימות במהלך הגדרת זמן יכול להסתיים שבירת ג'ל.</li>
	<li>לאט לאט להוסיף 40 µL בינוני הכנס ולתת לו להחליק החומה הפנימית לג'ל. הערה: בדרך כלל, הטעינה של אמצעי אחסון זה צריך לקחת בין 20 – 30 s.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) במשך 20 דקות. זה שלב ותוספות בינוני רצופים יעדיפו שטיפת של סוכרוז, equilibration של תאים עם תרבות בינוני.</li>
	<li>להוסיף µL 60 בינוני החומה הפנימית של הקדמי, ולאפשר לו לזרום מטה לאורך הקיר. האחות המדיום של הבאר, שהינו עשיר סוכרוז, ולהוסיף 0.5 מיליליטר בינוני טריים.</li>
	<li>להוסיף µL 60 בינוני לאט הכנס ולמקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) למשך 10 דקות.</li>
	<li>האחות המדיום היטב ולהוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים לתוך הבאר. להוסיף 200 µL בינוני תותב. מקם את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) כדי לשמור את התאים בתנאים המתאימים.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל יום. הסר את המדיום הישן מתחתית הבאר. להוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים µL טוב ל- 200 הכנס. הערה: אם תאית התמיינות נמשכת, התקשורת inducing ספציפיים יתווספו התרבויות, וכתוצאה מכך המחויבות סוג התא הרצוי (ראה להלן, תא בידול).</li>
</ol>4. תא הכדאיות ב- 3D-לטמבלים
<ol> <li>הערה: תא הכדאיות וזמינותו ידועה בשם המתים/Live — הכדאיות/Cytotoxicity assay גם כן.</li>
	<li>בשפופרת 15 מ"ל, להכין את אמצעי האחסון הדרושים של פתרון טריים של calcein מיקרומטר 2 בבוקר ו- 2 מיקרומטר של אתידיום homodimer-1 (EthD-1) ב- PBS מאת vortexing עבור 10 ס' לשמור בחושך. הערה: עוצמת הקול כדי לשמש עבור כל דגימה יהיה תלוי בגודל טוב על פי האפשרויות הבאות: mL 2 עבור כל טוב של צלחת 6-multiwell; 1 מ"ל לכל אחד טוב של צלחת 12-multiwell ו- 0.5 מ עבור כל טוב של צלחת 24-multiwell.</li>
	<li>שימוש של micropipette, לשטוף את הדגימות 3D-לטמבלים 3 פעמים עם 2 מ"ל ל- PBS, ואז, לכסות את זה עם הפתרון המוכן בשלב 4.1. תקופת דגירה זה ב RT של 40 דקות בחושך.</li>
	<li>שימוש של micropipette, יש לשטוף את בונה עם 2 מ של PBS 5 פעמים.</li>
	<li>דמיינו את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות 10 X או 20 X הגדלה.</li>
</ol>5. תאית התמיינות
<ol><li>התרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אווירה humidified) ב Chondrocyte הבזליים בינוני (CBM) עם צמיחה תוספי. הערה: הכנת המדיום מתואר בהוראות היצרנים (ראו טבלה חומרים).</li>
	<li>זירוז תאית התמיינות ביום 2 עם chondrogenic בינוני המכיל רקומביננטי האדם צורה של גורם גדילה-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), חומצה אסקורבית L 2-פוספט [AA2P] (25 µg/mL), דקסמתזון (100 ננומטר).</li>
	<li>לשמור על התרבות 4 שבועות באינקובטור עם אווירה humidified-CO 37 ° C ו-5%2. שינוי chondrogenic בינוני בכל יום אחר.</li>
</ol>6. טולדין כחול (TB) מכתים
<ol><li>לשטוף את התרבויות 3D-לטמבלים פעמיים על-ידי הוספה והסרה ואז 2 מ של PBS עם micropipette. לתקן אותם על-ידי הוספת 2 מ של 2% (w/v) p-פורמלדהיד ב- PBS עבור 2 h-RT.</li>
	<li>לשטוף פעמיים עם 2 מ של 0.1% X-100 Triton ב- PBS (PBST).</li>
	<li>דגירה 2 מ של טרה-בתים 0.05% במים למשך 20 דקות ב- RT.</li>
	<li>לשטוף מספר פעמים (לפחות 3 פעמים) עם 2 מ של PBS עד הפתרון PBS הוסר ברור.</li>
	<li>ניתוח דוגמאות על ידי בדיקה חזותית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי11,13,14. הערה: טרה-בתים יוצרת קומפלקסים עם glycoconjugates anionic-מטריצה חוץ-תאית, כגון proteoglycans (עמוד), glycosaminoglycans (איסור פרסום), אשר מופרשים בעיקר על ידי תאים, כמו chondrocyte. דוגמאות חיוביות הן מוכתם כחול.</li>
</ol>7. תספיג חלבון
הערה: ההליך בשימוש פרוטוקול זה תוארה בעבר התייחסות11.
<ol><li>Lyse 3D-בונה ב ריפה מאגר המכיל פרוטאז מעכב קוקטייל על-ידי pipetting.</li>
	<li>הכנת ג'ל אקרילאמיד בהתאם לדרישות של אמצעי אחסון ג'ל (של ציוד ריצה ג'ל ספציפי) ולהפעיל את lysates תא במשך 90 דקות ב 150 V16. הערה: ג'ל אקרילאמיד מוכן בדרך כלל בריכוז של 7.5-10% (w/v), תלוי משקל מולקולרי של החלבון.</li>
	<li>העברת החלבונים הכלול את הג'ל לתוך קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על-ידי החלת ארבעים V 2 h-RT.</li>
	<li>דגירה קרום PVDF-RT עבור 2 h במאגר חסימה (4% (w/v) ללא שומן אבקת חלב ב- PBST) במיכל נפרד עם נפח מספיק כדי לכסות את הקרום.</li>
	<li>דגירה הקרום-RT מאובטח עם נוגדנים ראשי-ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב- PBST. עיין בטבלה חומרים.</li>
	<li>להוסיף נוגדנים משניים ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. ראו טבלת חומרים.</li>
	<li>הכינו את הקרום לגילוי hP עם המצע Chemiluminescent16. עיין בטבלה חומרים.</li>
	<li>קח תמונות chemiluminescent16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבר, הקבוצה שלנו ואחרים תיארו את השימוש פלטפורמות תרבות תלת מימדי (3D) עם תא מגוון מערכות3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים שיטה קלה ומהימנה של קבלת התרבות 3D תאי גזע מערכות המתאימים לכל סוג של תאים בתרבית של כולל לכל סוג של תא פונקציונלי, עובריים או למבוגרים, או בסופו של דבר, תאים מתפקדות מבודד ביופסיות או גידולים, וכן הלאה. בנוסף, באופן עצמאי, אם בתאי גזע עובריים או מבוגר המקור יהיה להם קיבולת מחויבות שושלת היוחסין טוב יותר בסביבת 3D מאשר התרבות הקלאסית 2D מנות10,11,12, 13,14,15. לכן, התרבות תאים במערכת זו תוביל בידול לתוך מבנים דמויי רקמה תפקודית שיכול לשמש ביישומים שונים, מן וההתערבות תיקוני או משובי כדי רעילות פלטפורמות תרופתי.
הראו לנו רווח ברור בתפקוד התא. כי microenvironment תאית דומה לזה של רקמות טבעי מבחינת מבנה מטריצה של ביו-מכני, biophysical, ביולוגי פרמטרי. יחד עם זאת, המערכת הופך מורכב יותר, מספר הפרמטרים שצריכים להיות מוסדרים גם עליות, אשר כוללת את הצורך פלטפורמה התומכת חיצוניים (כגון מערכת זלוף פעיל כדי למנוע בעיות תופעות הקשורות בהעברת המוני ). תאים בתרבית three-dimensionally לבצע טוב יותר מבחינת וויסות פעולות חיוניות, כגון העברה, התפשטות, בידול. הם יכולים יוצרים רשתות מורכבות ומאפשר crosstalk הסלולר משופרת, וזה עד כה חיוניים תולדה של וגדל המבדילים ב- 3D. העובדה כי הורס יכול ליצור תנאים במבחנה דומה מייצג חלבונים אלה מטריצה חוץ-תאית יתרון שכן מחקר רציונלי של האפקט הפיק עבור כל רכיב המתווסף לגרדום (פקטורי גדילה, רב-סוכר או איתות פפטיד) יכולים להיות מועברים בקלות.
היתרונות ברורים של השימוש של אידיוטים בהשוואה פיגומים טבעיים אחרים, כגון קולגן מסוג I ו- Matrigel, הם הבאים: 1) לטמבלים הוא biomaterial סינתטי עם וריאציה מינימלי של אצוות ייצור אצווה; 2) לטמבלים יש את היכולת להיות functionalized עם מוטיבים פפטיד ספציפי; ו 3) מתנות לטמבלים נמוך biodegradability במבחנה, דבר המאפשר שמירה על הבונה 3D עם אותם מאפיינים biophysical, ביו-מכני, מבניים לאורך זמן. עם זאת, המגבלה של שימוש הורס לעומת אחרים פיגומים נמצאו במהלך השלב כימוס, שבו התאים נמצאים סביבה עוינת בשל ה-pH נמוך. לכן, זה צעד קריטי המתודולוגיה המתוארת. יתר על כן, חשוב לקבוע ריכוז לטמבלים עבור כל סוג תאים מסוים לפני התחלת כל ניסוי. זה חיוני, למעשה, כאשר תאים מתורבתים או לתוך אלה biomaterials, מאז כל סוג לתא מסוים יציגו תנאי הגידול biomechanical אופטימלית.
לבסוף, אנו מאמינים פבריקציה נוספת לסוג זה של biomaterial לגרדום ועיצוב לשפר את פיתוח מודלים 3D רקמות פיזיולוגיים ואמין יותר כדי לעזור תעשיית התרופות לפתח גישות טיפוליות טוב יותר עבור רפואה רגנרטיבית, סרטן או כל טיפול רפואי.

במשך עשורים רבים, תרבית תאים בתרבית של בוצעה בתנאים ניסיוני באמצעות מערכות התרבות הקלאסית דו-ממדית (2D) עקב בעיות מעשיות וכלכליים בין ההיבטים הלא-פיזיולוגיים. למרות מערכת תרבות זו מסייעת ללמוד ולהבין מנגנונים מולקולריים וסלולריות ביותר, אנו יודעים היום פרדיגמות חדשות של התרבות תאים נדרשים ללמוד מערכות סלולריות מורכבים יותר. לכן, מערכות תלת מימד (3D) התרבות הן במקרה הצורך, כדי לשחזר את microenvironment biophysically, biomechanically וביולוגית דומה יותר לזה של רקמות טבעי. בשנים האחרונות, מערכות התרבות תלת-ממד, באופן כללי, הפכו להיות נפוץ יותר בקרב חוקרים והתעשייה מאז שהם מייצגים, מודל חדש של מחקר או הקרנה אילו תאים יכולים לגדול בחלל, ליצור לתא או תא-כדי-מטריקס אינטראקציות, העברה, בסופו של דבר להבדיל לתוך שושלות תאים מסוים.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לשחזר במבחנה הסלולר microenvironment כי הוא קרוב יותר microenvironment ויוו . בפרט, לגרדום פפטיד עצמית וההספק סינתטי (לטמבלים) הוא סוג של biomaterial עם מאפיינים ייחודיים; היא יוצרת רשת של נקבוביות בגודל ננומטר עשוי חלש אינטראקציות בין פפטידים בעלי תכונות מכניות ומבניים דומים לאלה של מטריצה חוץ-תאית טבעיים. במילים אחרות, הרציונליות מאחורי השימוש בחומר זה הוא שיוצר באמת 3D-סביבה זה הינו אידיאלי עבור קבלת מדומה 3D הרקמות או האיברים יחידות. עם זאת, והכי חשוב, ההקשר 3D מאפשר את מבנה תלת-ממד להשיג תפקודים ביולוגיים חדשים שאינם בדרך כלל נוכח התרבות 2D פלטפורמות, כגון מאפיינים הקשורים רקמות אדריכלות, תופעות העברה המונית, תא המתבנת ובסופו של דבר מורפוגנזה רקמות, אשר הם גורמי מפתח להמשך המחקר ופיתוח של רקמות פונקציונלי ואת האיברים1,2. יתר על כן, היתרון לטמבלים מעל עמיתיהם טבעי (קולגן, Matrigel) הוא שהם יציבים מאד בטמפרטורת החדר ו אינם דורשים תנאים מיוחדים עבור פוסט-פרודקשן, הפצה או אחסון3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. לטמבלים קל לטפל, בעת הצורך; ג'לים 3D ניתן להשיג בפשטות על ידי הגדלת כוח יונית, או על-ידי התאמת רמת ה-pH נייטרליות1,2. לבסוף, המתודולוגיה המתוארת כאן כבר בשימוש נרחב במבחנה לקידום וצמיחה, תחזוקה, של בידול של מספר סוגי תאים, כולל chondrocytes, hepatocytes, תאי אנדותל, תאי העצם, כמו גם תאים עצביים תאי גזע עובריים וגופניות3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מתארים את השימוש של מערכת תלת-ממד-תרבות להבדיל בין האדם chondrocytes במפרק המורחב (הע ח) לתוך רקמות הסחוס דמוי כפי שתואר לעיל11.
כאן, מתוארת שיטה התרבות תאים במערכת תלת-ממד באמצעות אידיוטים. ב הזה biomaterial סינתטי, התאים מעורבבים קודם עם פתרון פפטיד, אשר כתוצאה מכך מושרה להרכיב עצמית, יצירת רשת של מידות nanometric מסביב לתאים, ולכן יצירת סביבת 3D באמת (איור 1). חשוב לקחת בחשבון כי התנהגות הסלולר מושפע ערכים נוקשות מטריקס (קרי, הפצה, העברה ובידול). לכן, פקד מתודולוגי נפוצה היא התרבות תאים מעל לגרדום פפטיד עם אותם ערכי נוקשות (תרבות על שני ממדים).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

טכניקה שימושית עבור culturing תאים עצמית וההספק nanofiber תלת מימד (3D) לפיגום מתואר. מערכת זו תרבות משחזר סביבה מקרוב מחקה את התכונות מבנית של הרקמה הלא מקוטב. יתר על כן, מבנה מסוים nanofiber מהותי לגרדום הופך שקוף לאור ויזואלי, המאפשר ויזואליזציה קל של הדגימה תחת מיקרוסקופ. יתרון זה שימש בעיקר ללמוד נדידת תאים, הארגון, התפשטות, ואת בידול ולכן כל התפתחות תפקוד התאים מסוים שלהם על ידי צביעת עם צבע מסוים או הגששים. יתר על כן, בעבודה זו, אנו מתארים את ביצועים טובים של מערכת זו ללמוד בקלות את redifferentiation של chondrocytes במפרק האנושי המורחב לתוך רקמות הסחוס. התאים היו מקופל לתוך עצמי בהרכבת פיגומים פפטיד, תרבותי בתנאים מסוימים כדי לקדם את chondrogenesis. תרבויות תלת מימדי הראו הכדאיות טוב במהלך 4 השבועות של הניסוי. כצפוי, דגימות תרבותי עם inducers chondrogenic (לעומת פקדים שאינם-induced) צבעונית מאוד חיובית טולדין כחול (אשר כתמים glycosaminoglycans (GAGs) כי הם מאוד נוכח מטריצה חוץ-תאית סחוס) והביע סמנים מולקולריים ספציפיים, לרבות קולגן סוג אני, II ו- X, על פי ניתוח המערבי כתם. פרוטוקול זה קל לבצע והוא יכול לשמש במעבדות מחקר, תעשיות, למטרות חינוכיות בקורסים מעבדה.

בשנת העבודה הנוכחית, פרוטוקול פשוט ומהיר לתאים תרבות תלת-ממד באמצעות לטמבלים מתואר כדי לקבל נתונים כמותיים אמינים. לטמבלים יוצר microenvironment תלת-ממד עם מאפיינים ייחודיים המאפשרים תאים בתרבית בתנאים הרצויים כדי להמשיך תחזוקה התא, הפצה ו/או בידול3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. בקבוצה שלנו, מספר מחקרים בוצעו באמצעות רקמת שומן אנושי הנגזר ובתאים (hAPC), chondrocytes במפרק האנושי המורחב (הע ח) ואנושי נורמלי עורי fibroblasts (hNDF) לתרבות, להרחיב, להבדיל אותם לתוך רקמת הסחוס כמו10,11,12. כאן, אנו מתארים את תרבות תלת-ממד, הבידול מחדש של האץ המורחב לתוך רקמות כמו סחוס, כפי שתואר לעיל11. לפיכך, אנו לתמצת התאים ב- 3D-לטמבלים, תרבות אותם במדיום אינדוקציה chondrogenic, כמתואר באיור 1 (ו בפרוטוקול). לאחר 24 שעות, הדגימות היו שקובעת הכדאיות עם וזמינותו הכדאיות/Cytotoxicity חי/מת. התוצאות מצביעות על אחוזים בודדים של תאים מתים (אדום) לאחר 5 ימים של כימוס, כמעט אין תאים מתים נצפו לאחר 4 שבועות של תרבות (איור 2). בשלב הבא, אנחנו מוכתם אותם גליקוזאמינוגליקן (איסור פרסום) להפקדה ב מטריצה חוץ-תאית באמצעות את טולדין כחול מכתימה את השיטה. כצפוי, הקבוצה אינדוקציה הגיב כראוי לטיפול, מראה חזק מכתים (איור 2).
לבסוף, סמנים מולקולריים של סמנים chondrogenesis ואת יתר, כולל קולגן מסוג I, II ו- X, נותחו על ידי תספיג חלבון (איור 3). סוג הקולגן שאני (COL1) נצפתה ב המערכות 2D and 3D אבל להקה התחתון של kDa ~ 130 (ייצוג החלבון COL1 בוגרת מעובד הניתנים להרכבה על מטריצות) נצפתה רק ב- 3D. תוצאה זו עולה בבירור כי תאים שעברו התמיינות בשלושה ממדים להמשיך בדרך יותר פיזיולוגית. למרבה הפלא, קולגן מסוג II (COL2) זוהה - כלהקה יחיד של מולקולרית המשקל הצפוי הנוכחי-מטריצה חוץ-תאית - רק ב מבנים תלת-ממד תרבותי בתנאים chondrogenic. לבסוף, קולגן מסוג X (COL10) התגלה ב- 2D ו- 3D בונה תרבותי בתנאים chondrogenic, המציינת מידה מסוימת של היפרטרופיה לאחר 4 שבועות של תרבות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של כימוס תא לתוך 3D-לטמבלים. ייצוג סכמטי העטיפה הע ח מתואר להשיג התאים התפזרו באופן אקראי בתוך 3D-הטיפשים. 1. הרכבה עצמית פפטיד לגרדום (לטמבלים) הכנה; 2. התא הכנה ההשעיה; 3- 3D-תא כימוס לתוך אידיוטים. שימו לב כי התרשים מראה רק צעדים 3.1 ל 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> איור 2: תא chondrogenic וביצועים בידול בתרבויות 3D-לטמבלים. תא מכתים הכדאיות בנטילת 5 ימים ו- 4 שבועות של תרבות זוהה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (תאים חיים תאים מתים וירוק באדום). גודל ברים = 200 מיקרומטר. גנרל chondrogenesis מחויבות לאומדן טולדין כחולים מוכתמים (sulfated glycosaminoglycans בכחול) של מבנים תלת-ממד-לטמבלים בתרבית בתקשורת ובקרה chondrogenic. גודל ברים = 500 מיקרומטר. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> איור 3: קולגן, ביטוי II ו- X של האץ שעברו chondrogenesis. הע ח תרבותי של טפט-2D, 3D-לטמבלים לאחר 4 שבועות ב chondrogenic מדיה ופקדים היו שקובעת את הביטוי של קולגן מסוג I (COL1), קולגן מסוג II (COL2) ו קולגן מסוג X (COL10). הביטוי אקטין שימש של בקרה פנימית. איור זה שונה מ- Recha ל'-סנצ'ו. et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  Ramon Llull University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Video: Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.