البحوث التي يقوم بها أصحاب تدعمها جزئيا منح من "الاتحاد الأوروبي البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) ضمن اتفاق المنحة رقم 229239، ومن "مؤسسة AO الاستكشافية البحوث التعاونية أبحاث البرنامج الحادة" غضروف الإصابة/الآفة/عيب (المجلس الدولي للمطارات CRP) في إطار مشروع بيواكتيفي والسقالات المحاكاة البيولوجية لتجديد الغضاريف (بيوكارت).

1-ذاتية تجميع إعداد السقالة (برامج التكيف الهيكلي) الببتيد
<ol><li>تعد حلاً 0.5% من الببتيد RAD16--أنا في السكروز 20% (w/v)، في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي. Sonicate الحل الببتيد لمدة 20 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية في الحد الأقصى من الطاقة وفي درجة حرارة الغرفة (RT) لضمان خلط متجانسة. ملاحظة: حجم الحل أن تكون مستعدة سيتوقف على عدد انكابسوليشنز المطلوب. RAD16--أنا الببتيدات لا تعاني من التدهور في ظل هذه الظروف sonication.</li>
	<li>تمييع الحل الببتيد الذي أعد في الخطوة 1، 1 مع حجم السكروز 10% (w/v) اللازمة للحصول على التركيز النهائي المطلوب. ملاحظة: هو عامل هام تأخذ في الاعتبار تعديل تركيز الببتيد الأولية صلابة المصفوفة النهائي يتوقف على هذه المعلمة. RAD16--أنا ينبغي أن يكون الحل الببتيد 2 x أكثر مركزة من تركيزات النهائية المرجوة من بنية ثلاثية الأبعاد. عادة، RAD16 النهائي--أنا الببتيد التركيزات المستخدمة بين 0.15-0.5% (w/v).</li>
	<li>ضع الأنبوب الصغير-الطرد يحتوي على الحل الببتيد في حمام الموجات فوق الصوتية على RT لمدة 20 دقيقة لضمان خلط متجانسة. ملاحظة: حل الببتيد، إذا لم تستخدم على الفور، يمكن تخزينها لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية.</li>
</ol>2. إعداد تعليق الخلية
<ol><li>الطرد المركزي بتعليق الخلية (التي تم الحصول عليها بعد العلاج التربسين) في 60 × ز و RT لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إزالة المادة طافية باستخدام ماصة باستور متصل بخط فراغ وتعليق بيليه الخلية في 3-5 مل سكروز 10% (w/v) باستخدام ميكروبيبيتي. المضي قدما لعد الخلايا باستخدام عداد خلية يدوي أو تلقائي. ملاحظة: محلول السكروز 10% (w/v) هي وسيلة متساوي التوتر وغير الأيونية التي تسمح بصيانة الخلية ويتجنب الببتيد جيليشن خلال عملية خلط.</li>
	<li>الطرد المركزي من تعليق خلية في 60 × ز و RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وتعليق بيليه الخلية مرة أخرى في حجم اللازمة من السكروز 10% (w/v) للحصول على ضعف تركيز الخلية النهائية المرجوة (المستحب حوالي 4 × 106 خلايا/ مل).</li>
	<li>ضع عدد المرجوة من إدراج زراعة الأنسجة في كل بئر من لوحة 6-جيدا (إدراج واحد في التغليف).</li>
	<li>Sonicate الحل الببتيد الذي أعد في الخطوة 1 في الحد الأقصى من الطاقة و RT لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>"الماصة؛" ومكان ميليلتر 40 تعليق الخلية (التي تم الحصول عليها في 2، 3) لتغليف كل المطلوب بالإضافة إلى حوالي 10-15% حجم إضافي في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي قياسية.</li>
</ol>3. تغليف الخلية 3D في برامج التكيف الهيكلي
<ol><li>مزيج بحجم متساو RAD16--أنا الحل في السكروز 10% (w/v) (40 ميليلتر لتغليف) مع حجم متساوية من تعليق خلية (40 ميليلتر لتغليف) أعد في الخطوة 2 للحصول على تعليق خلايا في تركيز المطلوب الببتيد (في السكروز 10%). مزيج من بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً حوالي 10 مرات. تجنب تشكيل فقاعة خلال خلط. ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية ويجب أن يتم بعناية فائقة نظراً للخلايا تحت ظروف معادية بسبب الببتيد pH منخفضة (حوالي 3.5 – 4.0).</li>
	<li>بعناية باستخدام ميكروبيبيتي، تحميل ميليلتر 80 تعليق في كل إدراج.</li>
	<li>إضافة 0.5 مل وسائط الثقافة إلى أسفل البئر الرطب في غشاء إدراج، والسماح لوسائل الإعلام نشرها لتعزيز الببتيد التجميع الذاتي وتكوين المائية. واسمحوا الببتيد هلام لمدة 20 دقيقة تقريبا في مجلس الوزراء تدفق. ملاحظة: يمكن أن ينتهي التلاعب بالعينات أثناء إعداد الوقت في كسر هلام.</li>
	<li>إضافة 40 ميليلتر من المتوسطة إلى الإدراج ببطء شديد والسماح لها بالانزلاق إلى أسفل الجدار الداخلي إلى الهلام. ملاحظة: ينبغي تحميل وحدة التخزين هذه عادة، بين 20-30 ثانية.</li>
	<li>ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) لمدة 20 دقيقة. سوف يؤيدون هذه الخطوة وإضافات متوسطة المتعاقبة النض السكروز والموازنة للخلايا مع الثقافة المتوسطة.</li>
	<li>إضافة 60 ميليلتر من المتوسطة إلى الجدار الداخلي للإدراج، مما يسمح لها بالتدفق أسفل الجدار. نضح المتوسطة للبئر، وغنية في السكروز، وإضافة 0.5 مل متوسطة جديدة.</li>
	<li>إضافة 60 ميليلتر من المتوسطة ببطء إلى الإدراج ووضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>نضح متوسطة البئر وإضافة 2.5 مل متوسطة جديدة في البئر. إضافة 200 ميليلتر من المتوسطة إلى الإدراج. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) للحفاظ على الخلايا الظروف المناسبة.</li>
	<li>تغيير في المتوسط كل يوم. إزالة المتوسطة القديمة من أسفل البئر. إضافة 2.5 مل متوسطة جديدة إلى ميليلتر جيدا و 200 للإدراج. ملاحظة: إذا استمر التمايز الخلية، وسائط الإعلام حمل محددة ستضاف إلى الثقافات، أسفر عن التزام نوع الخلايا المطلوب (انظر أدناه، الخلية التمايز).</li>
</ol>4-خلية البقاء في 3D-برامج التكيف الهيكلي
<ol> <li>ملاحظة: فحص صلاحية خلية يعرف لايف/الميت – مقايسة البقاء/سيتوتوكسيسيتي كذلك.</li>
	<li>في أنبوب 15 مل، إعداد وحدة التخزين اللازمة حل جديدة كالسين 2 ميكرومتر صباحا و 2 ميكرومتر اثيديوم هوموديمير-1 (اتهد-1) في برنامج تلفزيوني فورتيكسينج لإبقاء س. 10 في الظلام. ملاحظة: وحدة التخزين لاستخدامها لكل عينة سوف تعتمد على حجم جيدا وفقا لما يلي: 2 مل لكل بئر من لوحة 6-مولتيويل؛ 1 مل لكل جيد من لوحة 12-مولتيويل ومل 0.5 لكل بئر من صفيحة 24-مولتيويل.</li>
	<li>استخدام ميكروبيبيتي، شطف 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني عينات 3D-برامج التكيف الهيكلي، وثم تغطية ذلك مع الحل الذي أعد في الخطوة 4، 1. تبني على RT لمدة 40 دقيقة في الظلام.</li>
	<li>استخدام ميكروبيبيتي، الشطف بنيات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 5 مرات.</li>
	<li>تصور هذه العينات تحت مجهر فلورية استخدام 10 X أو 20 X التكبير.</li>
</ol>5-الخلية التمايز
<ol><li>ويكمل ثقافة الخلايا (37 درجة مئوية، 5% CO2، جو هوميديفيد) في تشوندروسيتي القاعدية المتوسطة (CBM) مع النمو. ملاحظة: هو وصف إعداد المتوسطة في تعليمات الشركات المصنعة (انظر الجدول المواد).</li>
	<li>الحث على تمايز خلية في اليوم 2 مع تشوندروجينيك المتوسطة الإنسان المؤتلف الذي يتضمن تحويل عامل النمو-b1 [TGFb1] (10 نانوغرام/مل)، "حمض" الأسكوربيك L 2-الفوسفات [AA2P] (25 ميكروغرام/مل) والديكساميتازون (100 nM).</li>
	<li>الحفاظ على الثقافة لمدة 4 أسابيع في حاضنة مع جو هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2. تغيير المتوسطة تشوندروجينيك كل يوم.</li>
</ol>6-تولويدين الأزرق تلطيخ (السل)
<ol><li>أغسل ثقافات 3D-برامج التكيف الهيكلي مرتين عن طريق إضافة وإزالة ثم 2 مل من برنامج تلفزيوني مع ميكروبيبيتي. إصلاح لهم عن طريق إضافة 2 مل من 2% (w/v) ففورمالدهايد في برنامج تلفزيوني عن ح 2 في الرايت</li>
	<li>تغسل مرتين مع 2 مل من 0.1% Triton X-100 في "برنامج تلفزيوني" (ببست).</li>
	<li>احتضان مع 2 مل السل 0.05% في الماء لمدة 20 دقيقة في الرايت</li>
	<li>تغسل عدة مرات (3 مرات على الأقل) مع 2 مل من برنامج تلفزيوني حتى يتم حل برنامج تلفزيوني إزالة واضحة.</li>
	<li>تحليل عينات من خلال الفحص البصري تحت مجهر مجسم11،،من1314. ملاحظة: السل يشكل المجمعات مع أنيونى جليكوكونجوجاتيس في المصفوفة خارج الخلية، مثل بروتيوجليكانس (PG) والجليكوزامينوجليكان (هفوة)، التي هي أساسا التي يفرزها تشوندروسيتي-مثل الخلايا. عينات إيجابية ملطخة الأزرق.</li>
</ol>7-الغربية وصمة عار
ملاحظة: سبق وصف الإجراءات المستخدمة في هذا البروتوكول في مرجع11.
<ol><li>3D-ثوابت في المعهد الملكي العازلة التي تحتوي على مبطلات المانع كوكتيل من بيبيتينج.</li>
	<li>تحضير هلام الاكريلاميد وفقا لمتطلبات الحجم هلام (من معدات تشغيل جل محددة) وتشغيل ليساتيس خلية لمدة 90 دقيقة في 150 الخامس16. ملاحظة: عادة ما تكون على استعداد هلام الاكريلاميد بتركيز 7.5-10% (w/v)، اعتماداً على الوزن الجزيئي للبروتين.</li>
	<li>نقل البروتينات الواردة في الجل في غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن عن طريق تطبيق 40 الخامس ح 2 في الرايت</li>
	<li>احتضان الغشاء PVDF في RT ح 2 في المخزن المؤقت لحظر (4% (w/v) الحليب المجفف الخالي في ببست) في حاوية منفصلة مع حجم ما يكفي لتغطية الغشاء.</li>
	<li>احتضان الغشاء في RT ح 1 مع الأجسام المضادة الأولية بتركيز 1 ملغ/مل في ببست نهائية. انظر الجدول المواد.</li>
	<li>إضافة الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 1 ملغ/مل. انظر الجدول المواد.</li>
	<li>إعداد الغشاء للكشف عن hP مع الركيزة تشيميلومينيسسينت16. انظر الجدول المواد.</li>
	<li>تأخذ الصور تشيميلومينيسسينت16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

سابقا، وصف مجموعتنا، والبعض الآخر استخدام منصات الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد مع الخلية متنوعة النظم3،4،5،،من67،8 ،9،10،11،،من1213،،من1415. في هذا العمل، ونحن تصف طريقة سهلة ويمكن الاعتماد عليها للحصول على الثقافة 3D الخلايا الجذعية النظم التي يمكن تطبيقها على أي نوع من خلايا الثدييات بما في ذلك أي نوع من الخلايا الوظيفية، الجنينية أو الكبار، أو في نهاية المطاف، عزل خلايا مختلة من الخزعات أو الأورام، وهلم جرا. وبالإضافة إلى ذلك، بشكل مستقل، إذا كانت الخلايا الجذعية المنشأ الجنينية أو الكبار أن لديهم قدرة التزام نسب أفضل في بيئة ثلاثية الأبعاد من الثقافة 2D الكلاسيكية الأطباق10،،من1112، 13،،من1415. ولذلك، ثقافة الخلية في هذا النظام سيؤدي إلى التمايز في هياكل مثل الأنسجة الوظيفية التي يمكن أن تستخدم في تطبيقات مختلفة، من الطب الترميمي أو التجدد الحيوي لمنصات السمية والدوائية.
وقد أظهرنا مكسب واضح في وظيفة الخلية لأنه يشبه المكروية الخلوية للأنسجة الطبيعية من حيث هيكل المصفوفة ومعلمات النشاط الحيوي والفيزيائية والبيولوجية. ومع ذلك، كما يصبح النظام أكثر تعقيداً، عدد المعلمات التي يجب أن تكون ينظم أيضا الزيادات، التي تشمل الحاجة إلى منصة دعم خارجي (مثل نظام التروية نشطة لتجنب النقل الجماعي للقضايا المرتبطة بالظواهر ). الخلايا المزروعة ثريديمينسيونالي أداء أفضل فيما يتعلق بتنظيم الأنشطة الأساسية، مثل الهجرة والانتشار والتفرقة. أنها يمكن أن تشكل الشبكات المعقدة مما يتيح تعزيز الحديث المتبادل الخلوية، الذي إلى حد بعيد كنتيجة أساسية لتنمو والتفريق في 3D. حقيقة أن يستنزف يمكن أن تخلق الظروف في المختبر مشابهة لتلك تمثل البروتينات المصفوفة خارج الخلية تنتج ميزة منذ دراسة عقلانية للتأثير لكل مكون من مكونات إضافة إلى السقالة (عامل النمو أو السكاريد أو إشارات يمكن أن يقوم الببتيد) بسهولة.
المزايا الواضحة لاستخدام برامج التكيف الهيكلي بالمقارنة إلى السقالات الطبيعية الأخرى، مثل الكولاجين النوع الأول وماتريجيل، هي ما يلي: 1) برامج التكيف الهيكلي مادة بيولوجية اصطناعية مع اختلاف الحد الأدنى من دفعة إلى دفعة الإنتاج؛ 2) برامج التكيف الهيكلي لديها القدرة على أن تكون فونكتيوناليزيد بزخارف الببتيد محددة؛ و 3) يعرض برامج التكيف الهيكلي انخفاض تحلل الأحيائي في المختبر، مما يسمح بالحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد مع نفس الخصائص الفيزيائية-الحيوية والنشاط الحيوي والهيكلية على مر الزمن. ومع ذلك، الحد من استخدام يستنزف مقابل أخرى يتم العثور على السقالات أثناء الخطوة التغليف، حيث تكون الخلايا في بيئة عدائية بسبب انخفاض درجة الحموضة. ولذلك، هذا خطوة حاسمة في وصف المنهجية. وعلاوة على ذلك، من المهم تعيين تركيز برامج التكيف الهيكلي لكل نوع خلية معينة قبل البدء في أي تجربة. وهذا ضروري، في الواقع، عندما تستزرع خلايا على أو إلى هذه الحيوية، حيث سيقدم كل نوع خلية معينة ظروف نمو النشاط الحيوي الأمثل.
وأخيراً، نعتقد أن تصميم وتصنيع هذا النوع من مادة بيولوجية سقالة سيعزز تطوير نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد الفسيولوجية وأكثر اعتمادية لمساعدة صناعة المستحضرات الصيدلانية لتطوير أفضل النهج العلاجي الطب التجديدي أو السرطان أو أي علاج طبي.

وقد أجريت لعقود عديدة، ثقافة خلية الثدييات تحت ظروف تجريبية باستخدام أنظمة الثقافة (2D) ثنائية الأبعاد الكلاسيكية بسبب المسائل العملية والاقتصادية بغض النظر عن الجوانب غير الفسيولوجية. على الرغم من أن هذا النظام الثقافي يساعد على دراسة وفهم أكثر الآليات الجزيئية والخلوية، ونحن نعلم اليوم أن نماذج الثقافة خلية جديدة ضرورية لدراسة النظم الخلوية أكثر تعقيداً. ولذلك، نظم الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد تحتاج إلى إعادة إنشاء المكروية التي بيوفيسيكالي، بيوميتشانيكالي، وبيولوجيا أكثر مماثلة للأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، نظم الثقافة 3D، بشكل عام، أصبحت أكثر انتشارا بين الباحثين والصناعة نظراً لأنها تمثل نموذجا جديداً لدراسة أو فحص في الخلايا التي يمكن أن تنمو في الفضاء، وإنشاء خلية إلى خلية أو خلية لمصفوفة التفاعلات، تهاجر و في نهاية المطاف تفرق في الأنساب الخلية المحددة.
والهدف العام لهذه المنهجية هو إعادة في المختبر خلوية المكروية التي أقرب إلى المكروية في فيفو . على وجه الخصوص، سقالة الببتيد تجميع ذاتي الاصطناعية (برامج التكيف الهيكلي) نوع من مادة بيولوجية مع خصائص فريدة من نوعها؛ وهي تشكل شبكة مسام نانومتر الحجم مصنوعة من التفاعلات الضعيفة بين الببتيدات مع الخصائص الميكانيكية والهيكلية مماثلة تلك المصفوفات خارج الخلية الطبيعية. وبعبارة أخرى، العقلانية وراء استخدام هذه المواد فإنه ينشئ حقاً 3D-بيئة التي مثالية للحصول على أنسجة الزائفة-3D أو وحدات الجهاز. ولكن الأهم من ذلك، يسمح سياق 3D هيكل ثلاثي الأبعاد للحصول على الوظائف البيولوجية الجديدة التي عادة ليست موجودة في 2D ثقافة المنابر، مثل خصائص تتعلق بهندسة الأنسجة، ظواهر النقل الجماعي، خلية الزخرفة، وفي نهاية المطاف morphogenesis الأنسجة، وعوامل رئيسية في المستقبل للبحث وتطوير وظيفي أنسجة وأجهزة1،2. وعلاوة على ذلك، ميزة لبرامج التكيف الهيكلي على نظيراتها الطبيعية (الكولاجين، ماتريجيل) هو أنها مستقرة جداً في درجة حرارة الغرفة ولا تتطلب شروطا خاصة لمرحلة ما بعد الإنتاج أو التوزيع أو مخزن3،4، 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15-برامج التكيف الهيكلي من السهل التعامل معها، عندما رغبت؛ المواد الهلامية 3D يمكن الحصول عليها ببساطة بزيادة قوام القوة الأيونية أو بتعديل درجة الحموضة إلى الحياد1،2. أخيرا، كانت المنهجية الموصوفة هنا المستخدمة على نطاق واسع في المختبر لتعزيز الصيانة والنمو والتمايز على عدد من أنواع الخلايا، بما في ذلك تشوندروسيتيس، خلايا الكبد، وخلايا بطانية، وخلايا الاوستيوبلاستس، الخلايا العصبية، وكذلك كالخلايا الجذعية الجنينية وجسدية3،4،5،،من67،،من89،10، 11 , 12 , 13 , 14 , 15-في العمل الحالي، يمكننا وصف استخدام نظام 3D-الثقافة للتفرقة بين البشر chondrocytes مفصلي الموسعة (هاتش) في الأنسجة مثل الغضاريف كما هو موضح سابقا11.
هنا، يتم وصف طريقة لخلايا الثقافة في نظام ثلاثي الأبعاد باستخدام برامج التكيف الهيكلي. في هذا مادة بيولوجية الاصطناعية، خلايا تختلط أولاً بحل ببتيد، الذي فعل في وقت لاحق لتجميع ذاتي، إنشاء شبكة أبعاد النانومترية حول الخلايا وذلك خلق بيئة 3D حقاً (الشكل 1). من المهم أن تنظر في أن السلوك الخلوي يتأثر بصلابة مصفوفة القيم (أي انتشار، والهجرة والتمييز). ولذلك، عنصر تحكم منهجية مشتركة لخلايا الثقافة فوق سقالة الببتيد بنفس صلابة قيم (الثقافة في بعدين).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

ويرد وصف تقنية مفيدة لاستزراع الخلايا في سقالة نانوفيبير ثلاثية الأبعاد (3D) تجميع ذاتي. يجسد هذا النظام ثقافة بيئة الذي يحاكي عن كثب السمات الهيكلية للأنسجة غير الاستقطاب. وعلاوة على ذلك، هيكل السقالة nanofiber المضمنة معين يجعل من شفافة للضوء المرئي، مما يسمح للتصور سهلة للعينة تحت المجهر. واستخدمت هذه الميزة إلى حد كبير لدراسة الهجرة الخلية والمنظمة، والانتشار، والتمايز وهكذا أي تطوير وظيفتها الخلوية خاصة بالتلوين بالأصباغ محددة أو تحقيقات. وعلاوة على ذلك، يصف لنا في هذا العمل، والأداء الجيد لهذا النظام لدراسة ريديفيرينتييشن لتوسيع chondrocytes مفصلي البشرية بسهولة في الأنسجة عنقية. الخلايا مغلفة في تجميع ذاتي الببتيد السقالات ومثقف تحت شروط معينة لتعزيز تشوندروجينيسيس. الثقافات ثلاثي الأبعاد وأظهرت جدوى جيدة خلال 4 أسابيع التجربة. كما هو متوقع، عينات مثقف مع الحمام تشوندروجينيك (بالمقارنة مع المستحثة بغير ضوابط) الملون بقوة إيجابية لازرق تولويدين (الذي البقع الجليكوزامينوجليكان (الكمامات) العالية الموجودة في المصفوفة خارج الخلية الغضاريف)، وأعرب عن اكتب علامات جزيئية محددة، بما في ذلك الكولاجين الأول والثاني والعاشر، وفقا لتحليل "لطخة الغربية". هذا البروتوكول سهلة لأداء، ويمكن استخدامها في المختبرات البحثية والصناعات والأغراض التعليمية في الدورات المختبرية.

في هذا العمل، هو وصف بروتوكول بسيط وأسرع إلى خلايا الثقافة في 3D باستخدام برامج التكيف الهيكلي للحصول على البيانات الكمية والنوعية الموثوقة. ينشئ برامج التكيف الهيكلي المكروية 3D مع الخصائص الفريدة التي تسمح للخلايا المزروعة تحت الشروط المطلوب الشروع في صيانة الخلية، انتشار و/أو التمايز3،4،،من56 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12-في مجموعتنا، عدة دراسات قد أجريت باستخدام خلايا الأنسجة الدهنية البشرية المستمدة السلف (حابك)، chondrocytes مفصلي البشرية الموسعة (هاتش) والبشرية عن طريق الجلد العادي الليفية (هندف) للثقافة، وتوسيع والتفريق بينهم في الأنسجة مثل الغضاريف10،،من1112. هنا، نحن وصف الثقافة 3D والتفريق بين إعادة هاتش الموسعة في الأنسجة مثل الغضاريف، كما هو موضح سابقا11. ومن ثم فإننا تغليف الخلايا في 3D-برامج التكيف الهيكلي والثقافة منهم في المتوسط التعريفي تشوندروجينيك، كما هو موضح في الشكل 1 (وفي البروتوكول). بعد 24 ساعة، تم تقييم عينات للبقاء مع "فحص" صلاحية/سيتوتوكسيسيتي لايف/قتيلا. أن النتائج تشير إلى أن % عدد قليل من الخلايا قد لقوا حتفهم (أحمر) بعد 5 أيام من التغليف وتقريبا لم يلاحظ أي خلايا ميتة بعد 4 أسابيع ثقافة (الشكل 2). المقبل، ونحن الملون لهم لترسب glycosaminoglycan (هفوة) في المصفوفة خارج الخلية استخدام تولويدين الأزرق تلطيخ الأسلوب. كما هو متوقع، الفريق التوجيهي استجابت بشكل صحيح للعلاج، وتبين قوية تلطيخ (الشكل 2).
وأخيراً، الواسمات الجزيئية لعلامات تشوندروجينيسيس وتضخم، بما في ذلك الكولاجين اكتب الأول والثاني والعاشر، وتم تحليلها بواسطة لطخة غربية (الشكل 3). ولوحظ نوع الكولاجين أنا (COL1) وقد لوحظ في نظم 2D و 3D ولكن عصابة أقل من كاتشين ~ 130 (تمثل البروتين COL1 الناضجة المجهزة يتم تجميعها في المصفوفة خارج الخلية) فقط في 3D. يشير بوضوح إلى هذه النتيجة أن الخلايا تمر بالتمايز في الأبعاد الثلاثة المضي قدما بطريقة أكثر فسيولوجية. بشكل ملحوظ، تم اكتشاف نوع الكولاجين الثاني (COL2)-كعصابة واحدة من الوزن الجزيئي المتوقعة الحالية في المصفوفة خارج الخلية--فقط في ثوابت 3D مثقف تحت ظروف تشوندروجينيك. وأخيراً، الكولاجين النوع X (COL10) واكتشفت في 2D و 3D سواء بنيات مثقف تحت ظروف تشوندروجينيك، مما يشير إلى درجة ما من تضخم بعد 4 أسابيع ثقافة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> رقم 1: التمثيل التخطيطي لتغليف الخلايا في 3D-برامج التكيف الهيكلي- ويرد وصف التمثيل التخطيطي لتغليف هاتش للحصول على خلايا موزعة عشوائياً داخل 3D-برامج التكيف الهيكلي. 1-تجميع ذاتي الببتيد إعداد السقالة (برامج التكيف الهيكلي)؛ 2-خلية إعداد تعليق؛ و 3- تغليف 3D-خلية في برامج التكيف الهيكلي. لاحظ أن التخطيطي يظهر فقط الخطوات 3.1 إلى 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> رقم 2: الخلية تمايز الأداء وتشوندروجينيك في الثقافات 3D-برامج التكيف الهيكلي- خلية تلطيخ صلاحية إجراء أيام 5 و 4 أسابيع للثقافة التي اكتشفت تحت مجهر فلوري (الخلايا الحية في الخلايا الخضراء والميت باللون الأحمر). تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. تشوندروجينيسيس العامة التزاما يقيمها تولويدين الزرقاء المصبوغة (مسلفت الجليكوزامينوجليكان باللون الأزرق) من بنيات 3D-برامج التكيف الهيكلي مثقف في وسائل الإعلام الرقابة وتشوندروجينيك. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من ل. رشا-سانشو et al. 11- <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> الشكل 3: الكولاجين الأول، التعبير الثاني والعاشر من هاتش تمر تشوندروجينيسيس. هاتش مثقف في 2D-أحادي الطبقة وفي 3D-برامج التكيف الهيكلي بعد 4 أسابيع في تشوندروجينيك تم تقييم وسائل الإعلام وضوابط للتعبير عن الكولاجين النوع الأول (COL1)، الكولاجين من النوع الثاني (COL2) ونوع الكولاجين X (COL10). واستخدم التعبير أكتين كرقابة داخلية. وقد تم تعديل هذا الرقم من ل. رشا-سانشو et al. 11- <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على نظم 3D-الثقافة في تجميع السقالات الببتيد لتعزيز التفريق بين ديديفيرينتياتيد chondrocytes مفصلي البشرية في الأنسجة مثل الغضاريف الذاتية.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  Ramon Llull University. نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على نظم 3D-الثقافة في تجميع السقالات الببتيد لتعزيز التفريق بين ديديفيرينتياتيد chondrocytes مفصلي البشرية في الأنسجة مثل الغضاريف الذاتية.

Video: Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

مستو وثلاثي الابعاد من أحبار الطباعة موصل

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

إعداد وتحليل<em&gt; في المختبر</em&gt; ثلاثة الثدي الأبعاد سرطان البدائل

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

تصنيع أجهزة ميكروفلويديك ثلاثي الأبعاد على الورق ليمونواسايس

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.