מחקר זה היא נתמכת על ידי מחקר למנוע עיוורון, ניו יורק, www.rpbusa.org של מרכז ניו יורק רבתי עבור רשתית ניווניות מחלות למלחמה בעיוורון, www.blindness.org. המחברים רוצה להודות Luanna ברתולומיאו, Ph.d., שלה סקירה ביקורתית של כתב היד הזה.

להלן כללי התנהגות מבוצעת המותרים של העקרונות את הצהרת הלסינקי והנחיות ועדת האתיקה במחקר האנושי אוניברסיטת ייל.
1. לחיזוי התורם האנושי עיניים
<ol><li>לקבל כדורי אדם תורם נבחרת מחלות מחקר מחלף (NDRI, פילדלפיה, PA). בהתאם הפרויקט, להכין לא פחות משלושה זוגות עיניים התורם לכל קבוצה ניסיונית.</li>
	<li>Enucleate תורם עיניים בתוך 10שע, הספינה בתוך 48 שעות לאחר המוות. תחבורה ואז העיניים למעבדה של Dulbecco סטרילי ששונה נשר בינוני (DMEM) תרבות בינוני על קרח. בעבר דווח על מחקרים הראו כי העיניים התורם שנקטפו, מועבר בשמורת האופנה הזאת של תכונות ביולוגיות ופעילויות של26,25,ממברנה של ברוך29.</li>
</ol>2. קציר של הממברנה של אדם ברוך Explants
<ol><li>המקום כל עין על 1.5 x 1.5 אינטש גזה ספוגה פחמן דו-חמצני תלויית מדיה DMEM מאכל תרבות 100 מ מ, ולאחר שימוש במספריים להב בסדר לעשות חתך דרך sclera 3 מ מ אחורי לימבוס והארכת circumferentially בשני הכיוונים.</li>
	<li>להפוך את ישבנה 1 מ מ מלא-עובי החתך במבניו (חדירה על הזגוגיות) אורה serrata. להסיר ולמחוק את המקטע הקדמי (קרנית, עדשה, איריס), הזגוגיות רשתית.</li>
	<li>השתמש בסדר מספריים כירורגיים לעשות ארבעה חתכים רדיאליים sclera ועד דמית העין, ולקלף את sclera מן הפריפריה אל עצב הראייה, תוך דאגה להימנע קריעת הקרום של דמית העין/ברוך מורכבים.</li>
	<li>בשלב הבא, עושים חתך במבניו בחלל suprachoroidal לאורך אורה serrata ולהתקלף מתחם של ברוך-RPE ממברנה-שכבה דמית posteriorly מ sclera.</li>
	<li>להסיר תאי RPE מקורי על ידי רחצה את explant עם מ' 0.02 נקודות אמוניה מימית בתוך של Dulbecco באגירה פוספט תמיסת מלח (DPBS) בפוליסטירן 60 x 15 מ מ צלחת פטרי במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחריה שטיפה 3 - פעמים ב- DPBS (איור 1).</li>
	<li>לרחף ממברנה explant של ברוך מורכבות בתקשורת ללא פחמן דו-חמצני מעל קרום טפלון 65 מיקרומטר בעובי unlaminated, הידרופוביות עם 0.2 µm נקבוביות, עם השכבה פרופריה הבזליים של כל explant מול הקרום.</li>
	<li>במקום קרום טפלון עם explant ממברנה של ברוך על זכוכית fritted תמיכה במערכת מסנן ואקום-מחזיק microanalysis זכוכית.</li>
	<li>לשטח את הקצוות מסולסל בצד חיבור עם מלקחיים בסדר מצופה טפלון, מטפל לא לגעת בצד laminin הבזליים ממברנה של ברוך.</li>
	<li>מחממים 15 מ"ל של agarose (4% ב- DPBS), ואז את תירגע עד 37 מעלות צלזיוס. ואז שופכים 15 מ"ל של הג'ל liquidized אל מתחם ממברנה-דמית העין של ברוך מן הצד-חיבור תוך יישום יניקה עדינה כדי להבטיח כי explant יישאר שטוח. שמור את הרקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות לחזק את agarose, ולקלף קרום טפלון משם.</li>
	<li>המקום explant של ברוך ממברנה (1.5 סנטימטרים בקוטר בתוך ג'ל agarose הקרושה) 60 x 15 מ מ תא פוליסטירן תרבות בכלי (עם הממברנה של ברוך פונה כלפי מעלה) מצופה agarose נוזלים חמים בתחתית הצלחת לתקן את הממברנה של ברוך explant בתחתית הבאר עם השכבה laminin הבזליים explant פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>Agarose יחזק בתוך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לייצב explants של ברוך ממברנה בצלחת תרבות. כיסוי הקרום של ברוך explants בתרבות צלחת עם DPBS ולאחסן את המנה ב 4 ° C לשימוש עתידי. איור 2A מדגים שהממברנה של ברוך מבודד explants בצלחת תרבות 60 x 15 מ מ.</li>
	<li>אם מערכת התרבות הרצויה בצלחת 96-ובכן, במקום explant של ברוך ממברנה (1.5 סנטימטרים בקוטר עם ג'ל agarose הקרושה) על גיליון טפלון שטוחה עם הצד laminin למעלה.</li>
	<li>שימוש של trephine, לחתוך, חמש או שש הכפתורים 6 מ ממעגלי הממברנה של ברוך מורכבת explant, במקום אחד על agarose 4% בגיל 37 מעלות צלזיוס פוליסטירן שאינם מטופלים היטב של צלחת 96-ובכן. Agarose יחזק בתוך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לתקן את הממברנה explants של ברוך (לחצנים) על החלק התחתון של כל טוב. הערה: איור 2B מדגים לחצנים של ברוך trephined ממברנה בצלחת 96-ובכן. בדרך כלל, 9-11 כפתורים או explants ניתן לקצור מכל עין.</li>
</ol>3. culturing של הפיגמנט ברשתית תאי אפיתל (RPE) על הממברנה של אדם ברוך Explants
<ol><li>עם קבלת בעיניים תורם, לנקות את הרקמה extraocular עם DPBS. עושים חתך במבניו 5 מ מ מתחת איריס-בסקלרה לגעת בנקודה (pars plana) לחלל subretinal. למחוק את מקטע קדמי נוזל זגוגי, רשתית העין.</li>
	<li>לשטוף את עיינית, אשר מכיל ממברנה של ברוך RPE גיליון, עם DPBS קר. מביצועם תאי RPE עם 5 מ של טריפסין 0.25% לא יותר מ- 10 דקות עבור כל דגימה העין. להרוות את תגובת טריפסין 25 מ ל DMEM בינוני מלא עם 15% עוברית שור סרום (FBS) להתחמם ב- 37 מעלות צלזיוס ב שפופרת 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב- 200 גרם × 10 דקות ב 24 ° C, ו- resuspend בגדר ב 5 מ של בינוני מלא DMEM (עם 15% FBS).</li>
	<li>לספור את התאים ואת הזרעים 15,000 תאי RPE קיימא על הנדן הבזליים של קרום explants של כל שונים בני ברוך (לחצנים) לתוך צלחת 96-ובכן ב- µL 200 אמצעי חיוני ללא סרום מינימלי (מאמ) המכיל אנטיביוטיקה (100 IU/mL פניצילין G, 100 מ ג / mL סטרפטומיצין, גנטמיצין 5 מ"ג/מ"ל ו- 2.5 מ"ג/מ"ל המפוטריצין). בהנחה תא בקוטר של 20 מיקרומטר, ציפוי על צפיפות זו תאפשר תאי RPE לכסות כ- 15% של שטח ציפוי.</li>
	<li>צלחת את התאים על גבי הלחצן, לפיה צפיפות התאים ואז ניתן להגדיל stepwise כדי 100% הנהרות בהתאם להשפעה של כל פרמטר בהתנהגות התא.</li>
	<li>לאפשר את התאים לצרף explant במשך 24 שעות ביממה באווירה humidified של 95% air/5% CO2 ב 37 º C. בעדינות לשנות בינוני עם חמים DMEM מלאה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

יש אף אחד המחברים כל גילויים מסחרי להכריז.

הממברנה בן ברוך האנושי של (מטריצה חוץ-תאית) תורמת התקדמות המחלה של AMD, ולכן יש צורך להבין כיצד שינו מטריצה זו תורמת בתפקוד תאי RPE. לאור העדר מספיק חייתיים ללמוד שינויי גיל ב- AMD, שמחוץ מערכות מודל המחקים את ההשפעות של המחלה יכול לשמש כלי חשוב להבין הפתופיזיולוגיה. המתודולוגיה המתוארת בכתב היד ניתן לבודד האנושי explants הממברנה של ברוך ואת התרבות RPE תאים, כולל ראשי מונצחים, קווים, או נגזר תאי RPE תא באופן עקבי.
כפי שהוזכר קודם לכן, explants ממברנה של אדם ברוך הטרייה של NDRI. פרוטוקול נוסדה עם NDRI אשר מציינת על הקריטריונים שהוגדרו עבור התורם עיניים להיות מקובל. לדוגמה, תורמים כנראה אין מחלות עיניים ברשתית מוכר, העיניים/גלובס מאוחזרות בתוך 10 h לאחר המוות, גלובס מגיעים במעבדה בתוך 48 שעות לאחר המוות (באמצעות משלוח החבילה לילי על קרח). ציין את טווח הגילאים המתאים ואת מספר העיניים הדרושים לניתוח סטטיסטי של המחקר, למשל., חמישה זוגות של גלובס מתורמים בין הגילאים 20-49 שנים עד חמישה זוגות גלוב מתורמים בין הגילאים 50-89 שנים.
הזמינות של גלובס העין משתנה, בדרך כלל ממוצע של עשרה זוגות של גלובס זמין בכל חודש. החבילה העין מגיע עם מידע בסיסי, שזוהה מבטל את התורם: גיל, גזע, שעת המוות, סיבת המוות, ותתדרך העבר הרפואי (פירוט מחלה או מחלות רקע).
והכי חשוב, קציר ממברנה explants של אדם ברוך דורש את ההסרה של המקטע הקדמי של העין, הזגוגיות, המאפשר הבידוד של קומפלקס ממברנה-דמית העין של RPE-ברוך. ברגע קרום של ברוך מבודד, תאי RPE יכול להיות נזרע על גבי explants acellular בריכוזים שונים, תרבותי לניסויים במורד הזרם. הכנה וטיפול פרוצדורלי כמתואר להלן הוא קריטי, תשומת לב הכיוון של הממברנה של ברוך מבודד כדי לוודא כי המשטח laminal הוא שפונה למעלה תוך כדי לא לגעת במשטח מכנית כדי למנוע נזק מטריצה חוץ-תאית מבנה פני השטח.
יש גם לציין כי בעת שימוש ממברנה explant מערכות של ברוך, ישנם משתנים מסוימים אשר עשויים להשפיע על תוצאות ניסויים במורד הזרם כגון רקע גנומית התורמים, לגיל קרום של ברוך, או שעה לאחר המוות של ברוך ממברנה, ואת המיקום של הממברנה של ברוך, כלומר., מרכזי או היקפי חלק explants ממברנה של ברוך. כמו עם כל המחקר רקמות אנושיות אחרות, אחד לגייס את המספר דוגמת עין התורם המתאים יש את הכוח סטטיסטית הצורך ולהתאים גיל עין התורם במידת הצורך. קביעת קריטריונים מחמירים על קבלת העיניים מבנקים העין הוא פרמטר קריטי. לקבל רק העיניים זה הם enucleated לאחר המוות פחות מ 10 h ואשר ניתן לקצור הכנה ממברנה של ברוך בתוך 24-48 שעות לאחר המוות. האתר עצב הראייה יכול לשמש כסמן לאוריינטציה, ולהשתמש באותם המיקומים עבור ניסיוני ולשלוט קבוצות לימוד. על-ידי נקיטת אמצעים אלה, אחד יכול למזער את השתנות ניסיוני.
לסיכום, ההבנה של ברוך-RPE את מתחם דירות ממברנה-דמית העין, איך זה מושפע הגיל ומחלות חיוני להבנת תרומתה הפתופיזיולוגיה של AMD. דגם מערכות שמעסיקים שמחוץ טכניקות הן כלי חשוב לחקור תופעות אלה באמצעות רקמה אנושית. במסמך זה, אנו מתארים מתודולוגיה מעסיקה explants התורם האנושית כמודל הרלוונטיים vivo לשעבר של הממברנה של ברוך בן. טכניקה זו מאפשרת להשתמש ממברנה בגילאי ו/או חולה אנוש ברוך של כלי מחקר כדי לחקור כיצד מבנה משתנה בתוך המטריצה יכול להשפיע על-ידי כיסוי RPE בהתנהגות התא כולל ביטוי של קובץ מצורף, התפשטות, ג'ין-25 , 27. פיתוח מוצלח של ex-vivo דגם מערכות דומות לקדם את ההבנה שלנו של AMD וכדי להקל על הפיתוח של הרומן אפשרויות טיפוליות.

הקשורות לגיל שינויים מבניים הקרום של אדם ברוך, אשר נגרמת על ידי גורמים רבים, כולל nitrosative סטרס חמצוני, מפעילה מספר השפעות מזיקות על הפונקציה של הפיגמנט ברשתית אפיתל (RPE) תאים ותורמת פתולוגיה של הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . כאשר שוקלים טיפול בתחליפי תא המתקדם AMD מנוונת או אטרופיה גיאוגרפית, טיפול סביר ידרוש את השתלת תאים על גבי מצע ניוון תאי RPE. שינויי גיל בתוך הממברנה של אדם ברוך עלולה להשפיע לרעה על ההצלחה של המושתלים שתלי תאי RPE, שגבה את הנזק10,11 9,6,מטריצה חוץ-תאית , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. האדם חקירת קרום ביולוגיה של ברוך ו כיצד מבנה משתנה בתוך המטריצה לתרום ההתקדמות ל AMD היא חיונית להבנת המחלה פתולוגיה. לפיכך, יש צורך החוקרים בשדה הקשורות לגיל העין לפתח פרוטוקולים המתארים vivo לשעבר קציר של הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך.
מבחינה היסטורית, מתקשים להפרעות הקשורות לגיל מודל כגון אטרופיה גיאוגרפית קרום של בני אדם ברוך חיות23. הקושי נובע גורמים רבים כולל את תוחלת החיים של בני אדם לעומת מכרסמים ו מינים אחרים בשימוש תכוף עבור מידול המחלה, כמו גם חוסר macula רוב החולייתנים24. היתרון של השיטה המתוארת במסמך זה הוא כי תאים יכול להיבדק ישירות על הממברנה של ברוך מופק פוסט מורטם עיניים של אנשים בגילאי ו/או חולה. המטרה הכוללת של מאמר זה היא לספק מתודולוגיה מפורט עבור מודל לשעבר vivo של גיל ו/או חולה אנוש ברוך של הממברנה, כולל ניתוקה של אדם ברוך של קרום explants מתורמים אנושי, זריעה של RPE תאים עבור ניסויים במורד הזרם. מודל זה יכול לשמש כמודל הרלוונטיים כדי לחקור את התרומה של מטריצה חוץ-תאית נזק ב RPE תא פתולוגיה ותפקוד20,25,26,27,28.

<table><tbody><tr><td>Human donor globes</td><td>National Disease Research Interchange, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Carbon-dioxide independent media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>60-mm polystyrene petri dish</td><td>Corning Inc.</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic 65 &amp;micro;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &amp;micro;m pores</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10mm culture dish</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential media (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

ויטמינים ונוגדי חמצון המומלץ על ידי המחקר מחלת עיניים ז, אין אין טיפול יעיל עבור "יבש", או מנוונת הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD) המייצגת 90% מהמקרים. טיפולים נדרשים כדי להאט או מפגר הפיתוח של אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי), להבנת הפתולוגיה ממברנה של ברוך הוא חלק מהתהליך הזה. שינויים בקרום של אדם ברוך להקדים את ההתקדמות של AMD בתרומה לחברה הנזק של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תאים. לאור העדר מספיק חייתיים ללמוד AMD, לשעבר vivo מודלים של בני ברוך האנושי של הממברנה לשמש כלי שימושי כדי ללמוד על אופן הפעולה של תאי RPE מ מונצחים, קווים התא הראשי, כמו גם קווי RPE נגזר גזע pluripotent המושרה תאים (iPSCs). כאן, אנו מציגים שיטה מפורט המאפשר אחד כדי לקבוע את ההשפעות של התנהגות התא RPE נזרע על explants ממברנה של ברוך האנושי שנקטפו מתורמים האנושי, כולל קובץ מצורף, אפופטוזיס, התפשטות, היכולת phagocytize קולט אור חיצוני מקטעים, הקמת קוטביות, ביטוי גנים. זה וזמינותו מספק מודל ex-vivo של הממברנה של ברוך בן כדי להעריך את המאפיינים פונקציונלי של תאי RPE כאשר נזרע על נחשף/יישון מטריצה חוץ-תאית.

כאשר פרוטוקול זה מבוצע כהלכה, ניתן לקבוע את ההשפעות של הקרום של גיל ו/או חולה אנוש ברוך על תפקוד תאי RPE בהקמת קוטביות מחסום הדם החיצוניים ברשתית, מקוטב הפרשת ציטוקינים, וגורמי צמיחה phagocytosis קולט אור רוד מקטעי החיצוני.
יש לנו שנוצר נתונים הממחישים הפנוטיפ המחלה על הממברנה של ברוך בן אדם. לדוגמה, culturing תאי RPE בן ממברנה explants ירידות RPE תא reattachment של אדם ברוך (איור 3). תאי RPE תרבותי על הממברנה של ברוך בן אדם מקטין את היכולת של תאים אלה phagocytize רוד מקטעי החיצוני (ROS), פונקציה קריטית RPE (איור 4). יתר על כן, מוות התאים יכול להיות מזוהה, נערכת השוואה בין אלה explants לחצן באמצעות מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז dUTP ניק תיוג-סוף (TUNEL) כתם כפי שמתואר עבודה קודמות26. השפעת הקרום של גיל ו/או חולה אנוש ברוך על פרופיל ביטוי גנים תא RPE יכול להיקבע microarray בטכנולוגיה. הראו כי ביטוי גנים תאי RPE משתנה כאשר תרבותי על הממברנה של אדם ברוך מאנשים מבוגרים לעומת explants של יחידים (איור 5) הצעיר27. לשם ניתוח סטטיסטי, explants מתורמים האדם לפחות 3-5 משמשים לכל קבוצה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> איור 1. ייצוג סכמטי של הבידוד של הממברנה של ברוך האנושי מעיניה התורם. הממברנות של אדם ברוך נקצרים על-ידי הסרת את sclera מקטע קדמי, רשתית, הזגוגיות, יליד רשתית פיגמנט אפיתל (RPE) תאים. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> באיור 2. מבודד ממברנה של אדם ברוך (מוניטור) בקערה תרבות. (א) סכמטית ממברנה explants של אדם ברוך (כל 1.5 אינץ ' קוטר, עם ג'ל agarose הקרושה) להציב אותם × 60 15 מ מ תא פוליסטירן תרבות מאכל (מוניטור פנים למעלה) מלא חמים agarose נוזלי על החלק התחתון של המנה. (B) הממברנה explant של ברוך האנושי זה יש כבר trephined לתוך על כמה כפתורים עגולים 6 מ מ (explants), כל אוו אשר היה ואז להניח אותה על 4% agarose-37 מעלות צלזיוס פוליסטירן שאינם מטופלים היטב של צלחת 96-ובכן. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> איור 3. אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תא reattachment שיעור על הממברנה של צעירים ומעלה אנושי ברוך (מוניטור). תאי RPE העיקרי היו נזרע על האדם הממברנה של ברוך explants הצעירים (< בת 50, n = 3) ומעלה (> בת 70, n = 5) התורם העיניים במשך שלושה שבועות. קצב התאים מצורף נמדדה על ידי MTT תא הכדאיות וזמינותו. הממברנות של ברוך אדם מבוגר מופחת הקצב המצורף תאי RPE בשיעור של 24% (100 צעירים מוניטור + /-8.54 S.E. לעומת מבוגר 76.65 מוניטור + /-1.44 S.E.). p < S.E. 0.05, = שגיאה סטנדרטית.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> באיור 4. Phagocytosis תא (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית מושפע לגיל הממברנה של ברוך האנושי (מוניטור). ראשי תאי RPE תרבותי על אדם מבוגר הממברנה של ברוך explants היה בעל יכולת מופחתת כדי phagocytize רוד מקטעי החיצוני (ROS) (873 צעיר מוניטור + /-9.3 S.E., n = 5 לעומת 608 בוגרים מוניטור + /-25.4 S.E., n = 5). p < S.E. 0.01, = שגיאה סטנדרטית.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> איור 5. מספר רשתית פיגמנט אפיתל (RPE) תא גנים ביטוי בכל מדגם תרבותי על צעירים או הקרום בוגרים ברוך האנושי של explants. היה פיזור נוסף במספר גנים ביטוי ראשי תאי RPE נזרע על בוגרים לעומת הממברנה הצעיר ברוך האנושי של (± 6201 388 לעומת 6439 ± 80, בהתאמה); explants חמש נבדקו עבור כל קבוצת גיל. הציג באישורו המלא של כל המחברים של קאי, H ואח. 27. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

10.1K Views.  Yale School of Medicine. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.

Video: Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neuroscience

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of the center&#160;of the retina, called the macula, resulting in the loss of central vision. Early AMD is characterised by the presence of small, yellowish lesions called soft drusen that can progress onto late AMD such as geographic atrophy (dry AMD) or neovascularisation (wet AMD). Although the clinical changes are well described, and the understanding of genetic influences on conferring AMD risk are getting ever more detailed, one area lacking major progress is an understanding of the biochemical consequences of genetic risk. This is partly due to difficulties in understanding the biochemistry of Bruch&#8217;s membrane, a very thin extracellular matrix that acts as a biological filter of material from the blood supply and a scaffold on which the retinal pigment epithelial (RPE) cell monolayer resides. Drusen form within Bruch&#8217;s membrane and their presence disrupts nutrient flow to the RPE cells. Only by investigating the protein composition of Bruch&#8217;s membrane, and indeed how other proteins interact with it, can researchers hope to unravel the biochemical mechanisms underpinning drusen formation, development of AMD and subsequent vision loss. This paper details methodologies for enriching either whole Bruch&#8217;s membrane, or just from the macula region, so that it can be used for downstream biochemical analysis, and provide examples of how this is already changing the understanding of Bruch&#8217;s membrane biochemistry.

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

העשרה של ממברנה של ברוך מעיני אדם תורמות

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Medicine

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

אפיון ודינמיקה מורפולוגית של RPE מורין ראשוני מתורבת

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

מחבר זרקור: בידוד יעיל של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים מעכברים בוגרים לחקר רטינופתיה

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Biology

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

העשרה של ממברנה של ברוך מעיני אדם תורמות

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי