מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן BrightFocus (ל- DS).

הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת פיטסבורג
1. מכינים פתרונות
<ol><li>להכין את מדיום הגידול על ידי וחדשניות Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), גלוקוז גבוהות עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מ מגלוטמין ו 1 x MEM שאינן חיוניות חומצות אמינו. לחמם את המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס החממה לפני השימוש.</li>
	<li>להכין 2% (wt/כרך) dispase II הפתרון עובד:<ol>
<li>להכין פתרון מניות של 100 מ"ג/מ"ל dispase השני על ידי המסת 30 מ"ג של dispase השני בתוך 300 µL HEPES באגירה תמיסת מלח (50 מ מ HEPES/קו pH 7.4, 150 מ מ NaCl). אמצעי אחסון זה עבור 3-4 עכברים, שניתן יהיה גודלו או למטה בהתבסס על מספר עכברים לניסוי). מלאי זה ניתן לאחסן לפחות שבוע 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להכין הפתרון עובד של 2% dispase על-ידי הוספת µL 300 של 100 מ"ג/מ"ל dispase II המניה 1.2 מ של DMEM סטרילי, גלוקוז גבוה וסינון הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.22. שלב זה יש לבצעו בזרם שכבתית ארון בתנאים סטריליים. לחמם את dispase מוכן II ב- 37 מעלות צלזיוס החממה לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קבלת בעיניים העכבר
<ol><li>המתת חסד העכבר באמצעות כל שיטה שאושרו ומניחים אותו על רכיב pad סופג.</li>
	<li>לבש כפפות, לשים באגודל ובאצבע סביב העין, דחף בעדינות את העור כדי proptose גלגל העין.</li>
	<li>הוסף את קצה מספריים בזווית שבין העור של גלגל העין, בזהירות לחתוך את העין. כדי למנוע זיהום, בקצרה לטבול את העין ב-70% אתנול.</li>
	<li>מיד במקום העין ב באגירה פוספט מלוחים (מגניב) בצלחת פטרי.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.2-2.4 כדי להסיר את העין השנייה.</li>
</ol>3. עין לנתיחה
<ol><li>בזהירות הסר רקמת העין תחת המיקרוסקופ ויבתר. זה יכול להיעשות PBS או על הפטרי יבש.<ol>
<li>להשתמש מלקחיים הפתולוגיים כדי להרים את רקמות החיבור של גלגל העין, לגזור אותם באמצעות מספריים Vannas. Not גזור את sclera כי זה כמעט בלתי אפשרי להשיג את eyecups האחורי שלם אם חותכים את sclera.</li>
		<li>לאחר ניקוי רקמת חיבור, לשמור את העיניים וכתוצאה מכך ב- PBS לשלב הכביסה הבא. הערה: כל השלבים הבאים יש לבצעו בזרם שכבתית ארון בתנאים סטריליים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את העיניים פעמיים ב מראש ומחוממת 37 ° C DMEM (גלוקוז גבוהה). להעביר בזהירות את העיניים לתוך ומחוממת מראש 37 ° C DMEM (גלוקוז גבוהה) באמצעות מלקחיים. מחוק לגמרי את העיניים בינוני והעברת לבינונית טריים בקערה חדשה.</li>
	<li>האחות DMEM (גלוקוז גבוהה) בינוני, דגירה העיניים שבה הפתרון עובד II ומחוממת מראש dispase 2% (wt/כרך) למשך 45 דקות בחממה 37 º C. הערה: בתוך כל השלבים הבאים, במקום ולטפל עיניים או eyecups במצע הגידול, אשר להגן על הרקמות, לספק מדיום טוב הקרע.</li>
	<li>הסר את הפתרון השני dispase, לשטוף את העיניים פעמיים בתוך מדיום הגידול על-ידי כ רפה בעברית המדיום הישן והוספת מדיום הגידול מראש ומחוממת-37 ° C החדשה (איור 1 א'). הערה: לאחר דיסוציאציה מאת dispase II, העיניים הופכים רכים.</li>
	<li>. תחזיק את העין עם מלקחיים, בחתך סביב serrata אורה של כל עין בעזרת מספריים Vannas תחת המיקרוסקופ ויבתר להציב את זרימה שכבתית בארון.<ol>
<li>שמירה על גלגל העין בפתרון, הסר בזהירות הקרנית הקדמי על ידי הרחבת החתך סביב המעגל serrata אורה ומושך הקרנית הקדמי משם אחרי החתך כבר מלאה.</li>
		<li>הסר עדשה כמוסה של איריס המשויך פיגמנט האפיתל על ידי בעדינות משיכתן אל מחוץ עיינית עם מלקחיים teethed (איור 1b, 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה של eyecups אחורי שנוצר במצע הגידול למשך 20 דקות ב 37 ° C כדי להקל על הפרידה של הרשתית עצבית RPE.</li>
	<li>חותכים את eyecups אחורי 4 עלי כותרת מתחת למיקרוסקופ ויבתר להציב את זרימה שכבתית בארון. החתכים צריך להיות מספיק זמן לשטח את עיינית, אבל קצר מספיק כדי לשמור על הכותרת מחוברים (איור 1 d).<ol>
<li>לרדד את עיינית ולהסיר את הרשתית עצבית על ידי בעדינות משיכתו עם מלקחיים תוך החזקת הנותרים RPE-שכבה דמית-בסקלרה מתחם עם מלקחיים אחר (איור 1e). התחילו למשוך מהקצוות, ולא מן המרכז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העברת שכל רקמות חתוכות לרבעים לתוך תבשיל תרבות סטרילי חדש מלא מראש חימם מדיום הגידול 37 º C.</li>
</ol>4. בידוד תאי RPE ראשי
<ol><li>מחזיקים עלה כותרת אחד של המתחם RPE-שכבה דמית-בסקלרה חתוכות לרבעים עם בסדר סופר מלקחיים, לקלף בעדינות בין יריעות RPE. ללא פגע מן קרום המרתף המשמש כבסיס (הממברנה של ברוך) באמצעות סכין סהרון המיקרוכירורגית תחת המיקרוסקופ ויבתר להציב אותם זרימה שכבתית cabinet (איור 1f).<ol>
<li>להעביר את הסדינים RPE לתוך המנה סטרילי תרבות חדשה המכילה מדיום הגידול על-ידי שימוש micropipette P200. בעת העברת גליונות RPE, להרטיב את הטיפים פיפטה עם מדיום הגידול על-ידי pipetting מספר פעמים כדי למנוע רקמת נשאר בפנים הטיפ. RPE יהיה ניתן להבחנה ברורה מן דמית העין: RPE נראה יותר חום, בעוד שכבה דמית כהה יותר, נראה דביק ורך.</li>
		<li>לחלופין, השתמש עיכול אנזימטי דיסוציאציה עדין ללא מלקחיים כדי לנתק את RPE מן דמית העין14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכבס את המצעים RPE 2 - 3 פעמים באמצעות מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס מדיום הגידול בצלחת תרבות סטרילי. לאחר כל שלב כביסה, בזהירות לאסוף את הסדינים RPE תוך הימנעות לרקמות אחרות כגון פסולת הרשתית או דמית העין. בסוף בכביסה האחרונה לאסוף את הסדינים RPE עם micropipette P200 ולמקם אותם בצינור microcentrifuge של 1.5 mL החדש. הערה: יש צורך centrifuge את הסדינים RPE: הם יהיו משקעים על ידי הכבידה בתוך 1 דקות.</li>
	<li>הסר את מדיום הגידול הנוסף באמצעות micropipette P200. Resuspend התאים מדיום הגידול מראש ומחוממת טריים, בעדינות triturate אותם באמצעות micropipette P200. למנוע היווצרות בועות. השעיה תא בודד הוא אידיאלי, אך גם להימנע trituration מדי, אחרת תאי RPE אינם מסוגלים לשרוד. אנו ממליצים מאוד בעדינות trituration 40 - 50 פעמים.</li>
</ol>5. culturing תאי RPE
<ol><li>צלחת את התאים על צלחת תרבות.<ol>
<li>אם יישומים במורד הזרם של תאי RPE דרוש לשמירת הקוטביות שלהן, צלחת RPE תאים של עכברים 2 ב 12 מ מ אחד ממברנה פוליאסטר הוספה טעון מראש ב 12-ובכן תרבות צלחות. ציפוי התאים-צפיפות גבוהה רצוי כי במקרה זה תאי RPE מסוגלים לשמור את המאפיינים המקוריים, כגון צורת משושה פיגמנטציה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אין להעביר את הצלחת או לשנות את מדיום הגידול עבור ה 72 הראשון של culturing. לאחר 3 ימים, החלף את המדיום הישן עם מדיום הגידול מראש ומחוממת טריים. לאחר מכן לשנות את המדיום תרבות בכל יום אחר. ברגע תאי RPE confluency, להפחית את FBS במדיום גידול ל- 2%. הערה: התאים ניתן לפצל באמצעות טריפסין 0.25%. עם זאת, לאחר פיצול התאים עלול לאבד שלהם צורת משושה, פיגמנטציה, הקטעים הבאים. אנו לא ממליצים פיצול התאים, אך אם הדבר נדרש על-ידי היישומים במורד הזרם של התרבות, עליך לזכור כי התאים ראשי לא יכול להיות passaged ללא הגבלת זמן: הם ידועים דה-להבדיל לאחר 5-7 קטעים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mart&#237;nez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development:+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium.">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li><li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells:+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations.">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li><li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium.">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li><li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells.">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li><li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models.">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li><li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+(RPESC).">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li><li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+culture;a+potential+source+of+retinal+stem+cells.">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li><li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes.">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li><li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling.">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li><li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin,+complex+1+signaling.">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li><li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation.">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique.">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li><li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers.">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li><li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa,+the+Usher+syndrome+1B+protein.">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li><li>Pitk&#228;nen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+retinal+pigment+epithelium:+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity.">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li><li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture.">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li></ol>

DS קיבל מחקר מימון Bayer HealthCare, גרמניה ו פ הופמן-La Roche, שוויץ. המחברים הנותרים להכריז אין אינטרסים כלכליים מתחרים. עבודה זו נתמכת על ידי מחקר כדי למנוע עיוורון (מוגבל מענקים וילמר העין המכון, אוניברסיטת פיטסבורג).  עבודה זו נתמכת גם כספים סטארט-אפ ל DS עיניים, אוניברסיטת פיטסבורג.

פרוטוקול מפורט הציג מאפשרת הקמת אמין של העכבר הראשי תרבויות RPE להגיע confluency לאחר שבוע 1, להציג את מאפייני RPE העיקריים כגון צורת משושה פיגמנטציה לאחר 2 שבועות. תאי RPE שהושג יכול לשמש עבור מספר יישומים במורד הזרם כגון חילוף החומרים ויטמין A9, phagocytosis של מקטעי החיצוני קולט אור10 ו- תחבורה יון11, תאים אפיתל קוטביות2, lysosomal הומאוסטזיס, autophagy12,13. בהתאם ליישום במורד הזרם, המורפולוגיה של התרבויות נגזר הניתנים לאימות על ידי שידור, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כפי שמתואר פירוט במקום14. מבחני נוספים כדי להדגים ההבשלה של התרבויות עשויים לכלול את ההתנגדות החשמלית transepithelial (TEER) assay להפגין קוטביות של תאי RPE, מבחני חדירות4,22, בדיקות פונקציונליות (phagocytosis 23), כיפה היווצרות.
. מניסיוננו, התאים יותר הם מצופים היטב, טוב יותר confluency את, את גן # מושגים בסיסיים ב פרוטוקול זה, אנחנו נזרע תאי RPE מ שני עברים על אחד מוסיף 12 מ מ. עם זאת, זה גם אפשרי להכניס תאי RPE של עכברים 2 הוספה 6.5 מ מ אחד כדי לקבל יותר confluency ו- TEER. במחקרים רבים, הצלחות על תרביות תאים RPE הם מצופים Matrigel או laminin. לא ראינו הבדל משמעותי ב RPE תא הקובץ המצורף אלו כלי עם או בלי ציפוי. בנוסף, אחוז FBS במדיום תרבות עשוי להיות שונה כדי להשיג תוצאות טובות יותר. 10% FBS בדרך כלל טוב להגעה confluency, אבל יורד. ל פחות FBS נראה להיות מועיל עבור RPE בידול/התבגרות14,17.
המגבלה העיקרית של שיטה זו הוא הצורך בהכשרה מדויק של האדם לבצע את ניתוח העין על מנת להבטיח יעילות מרבית ההתאוששות תא RPE ללא זיהום צולב עם תאים שמקורם לרקמות אחרות עינית. למניעת זיהום צולב, החוקר צריך להתמחות השלב הקריטי של הליך זה: זהירות מתקלפת הרשתית ואחריה הפרדה מדויקת RPE דמית. הניתנים לאימות הטוהר של התרבויות שהושג באמצעות immunostaining RPE ספציפיים. מספר סמנים RPE זמינים עבור אפיון של התרבויות RPE, כולל גנים המעורבים ב מחזור חזותיים, מכשול, התחבורה פונקציה, חילוף החומרים, phagocytosis, ו melanogenesis15.
מגבלה נוספת הוא המספר של עיניים ניתן לעבד בו זמנית כדי להשיג את התרבויות. באופן כללי, לא מומלץ לעבוד עם יותר מ-2 עכברים בכל פעם. כדי להבטיח יכולת הקיום של תאי RPE, העיניים צריך להיות גזור מהר ככל האפשר. לאחר שהמשתמש להפוך למיומן יותר, זה אפשרי להתמודד עם עכברים יותר, לסירוגין הדגירה פעמים.
בסך הכל, פורסמו מספר שיטות לבסס העכבר הראשי RPE תרבויות3,14,15, עם זאת, בפעם הראשונה, אנו מציגים גירסה וידאו של הפרוטוקול המלא. פרוטוקול זה יכול לשמש הדרכה על טכניקות ניתוח עיניים. עם זאת, האיזון האופטימלי בין מהירות גבוהה דיוק נדרש רוברט יכולה להיות מושגת רק עם תרגול.

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) היא שכבה אחת של תאי אפיתל מקוטב הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. הפונקציונליות של תאי RPE ויושר טפט RPE הם קריטיים עבור חזון כי RPE ממלא תפקיד חשוב בתהליכים מרובים כגון שמירה על המחסום דם-רשתית החיצוני, הובלת מים, יונים בין הרשתית ו מקלעת דמית העין, אור הקליטה, הגנה מפני סטרס חמצוני, שליטה על חילוף החומרים retinoid, phagocytosis המקטעים החיצוני של1,photoreceptors2. המיקום של RPE מאחורי העין, וכן תפקידה מחסום מניעת סמים מנוהל מערכתית עובר מהדם אל נוזל, להקשות ללמוד את המורכבות של ה RPE פונקציה ויוו. לפיכך, יש צורך גדול להקמתה של תרביות תאים RPE ללמוד תאי RPE גמיש, בסביבה מבוקרת3,4.
מספר קווי תאי RPE הוקמה קיימות, מתן דרך קלה ונוחה של קבלת ואחסון של התאים; עם זאת, תאים passaged יש כמה חסרונות לעומת תאים ראשי-2,-3,-4. ראשית, הם לעיתים קרובות מאופיינים על ידי שינויים מורפולוגיה תאים. לדוגמה, אף אחד ממחקרי התא הקיימים נמצאו בהכשרת מחקר אמין של המאפיינים מכשול RPE בשל האובדן של פנוטיפ קוטביות תא והעלמות חלקית של צמתי צר4. בנוסף אובדן קוטביות והתקשרויות לתא המתאים, הקווים תאי RPE לאבד במהירות שלהם פיגמנטציה בשל היעדרם של אנזימים melanogenesis מפתח ב RPE למבוגרים5. ניתן לשחזר את הפיגמנטציה, אבל ניתוח מקיף של המנגנון של פיגמנטציה מחדש אשר כוללים שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, ג'ין ביטוי מבחני ניתוח וכימיקלים לאשר הנוכחות של מלנין מעולם כבר בביצוע6. מגבלה אחת יותר הוא הקווים תאי RPE חיי תאים המורחבת (לפעמים - אלמוות), בתנאים מסוימים יכול להפוך עצמי המתחדש תאי גזע multipotent כי ניתוק מן המצע טופס צף מושבות7, 8. מגבלה זו עושה את זה בלתי אפשרי להשתמש הקווים תא עבור השתלת ניסויים3.
בהתחשב החסרונות של הקווים תאי RPE הוקמה העיקרי תרביות תאים RPE המתקבל רקמות טרי עשוי לשמש מודל יותר ביולוגית רלוונטית ללמוד את RPE. ראשי תאי RPE שימשו לא רק ללמוד פונקציות ייחודיות RPE כגון ויטמין A חילוף החומרים9, phagocytosis של קולט אור מקטעי החיצוני10 ויון תחבורה11, אלא גם ללמוד ביולוגיה של התא בסיסיים כגון אפיתל התא קוטביות2 , הומאוסטזיס lysosomal autophagy12,13.
בחודשיים האחרונים של שנים היו מספר פרסומים על ביסוס ראשוני RPE תרבויות, המציין עניין הולך וגובר באזור זה של מחקר3,14,15. פרוטוקולים רבים עבור תאי RPE אדם ותאים RPE אנושיות כגון תאי RPE שור וחזירי היו שפורסמו16,17,18,19. עם זאת, קשה יותר להתמודד עם תאי RPE העכבר בשל גודלם קטן בהרבה. אף-על-פי מספר פרסומים תיארו פרוטוקולים בידוד תאי RPE העכבר14,20,21, עדיין ישנם חוקרים רבים נאבקים לבודד תאי RPE ללא זיהום של תאים דמית העין או תאים מפני פסולת עצבי הרשתית. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול להקמת העכבר הראשי RPE תרבית תאים, לרבות קבלת העיניים של העכבר, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. פרוטוקול וידאו זה יהיה שימושי במיוחד עבור חוקרים שמתחילים לעבוד עם העכבר הראשי RPE תרבויות, צריכים הדרכה על הטכניקות לנתיחה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="980">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">animals</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:388px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">2~3-week old wildtype mice</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Name</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">reagents</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dispase II</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Cellgro</td>
			<td style="width:123px;">61-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">KOH</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM9759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethyl Alcohol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:38px;width:347px;">RPE65 antibody</td>
			<td style="width:123px;">A gift from Dr. Michael Redmond</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fluorescein Phalloidin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">F432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A11011&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:123px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:123px;">00380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:38px;width:347px;">ZO-1 Polyclonal Antibody</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Name</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">instruments and equipments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Laminar flow cabinet</td>
			<td style="width:123px;">Baker</td>
			<td style="width:123px;">SterilGARD SG403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">CO2 incubator with hot air sterilization</td>
			<td style="width:123px;">Binder</td>
			<td style="width:123px;">C150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td style="width:123px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:123px;">COR-3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td>
			<td style="width:123px;">STEPHENS instruments</td>
			<td style="width:123px;">S7-1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td>
			<td style="width:123px;">Stroz Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:123px;">E1796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Crescent straight knife</td>
			<td style="width:123px;">Beaver-Visitec International</td>
			<td style="width:123px;">373808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Vannas Scissors, 8 cm, 45&#176; Angle, Standard</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">500260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGL0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Syringe, 5 mL</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Inverted Laboratory Microscope&#160;Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:123px;">&#160;Leica&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipette</td>
			<td style="width:123px;">Gilson</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Barrier and non-filtered pipette tips</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי מקוטב מאוד הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. . זה גיליון אחד של תאי פיגמנט hexagonally ארוז, המחוברים באמצעות צמתי צר... הפונקציות העיקריות של RPE כוללים ספיגת אור, phagocytosis מקטעי החיצוני של קולט אור המחסן, אגירה המרחבי של יונים, הובלה של חומרים מזינים, יונים, מים, כמו גם מעורבות פעילה במחזור חזותי. עם כזה פונקציות חשובות ומגוונות, חשוב באורח קשה ללמוד את הביולוגיה של תאי RPE. מספר קווי תאי RPE הוקמו; עם זאת, תאים passaged מונצחים ידועים במהירות לאבד חלק מאפיינים פיזיולוגיים מורפולוגיים של תאי RPE טבעי. לפיכך, ראשי תאים מתאימים יותר ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של התא RPE ותפקוד. תרבית תאים RPE העיקרי של העכבר הוא שימושי מאוד עבור חוקרים מאז מודלים העכבר נמצאים בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים, אולם איסוף RPE תאים מן העכבר גם מאתגר מאוד בשל גודלם הקטן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת תרביות תאים RPE העכבר הראשי הכוללת העקירה, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. שיטה זו מאפשרת שחזור היעילה תא. תאי RPE המתקבל שני עכברים יכולים להגיע confluency על אחד הוספה ממברנה פוליאסטר של 12 מ מ, טעון מראש בצלחת תרבות לאחר שבוע של תרבות להציג חלק מהמאפיינים המקוריים של RPE בתום תאים כגון צורת משושה, פיגמנטציה לאחר שני שבועות של תרבות.

העכבר הראשי RPE התרבות נוצרו מ- 2 עכברים ב 12 מ מ ממברנה פוליאסטר הוספה מגיע ל 90-95% confluency לאחר שבוע 1 בתרבות. לאחר 2 שבועות של תרבות, התאים הגיעו 100% confluency והתחלתי ליצור פסיפס של תאים משושה, פיגמנט ו- bi-nucleated. על ידי 3 שבועות של תרבות, התאים המשיך כדי ליצור את הצורה והסגנון של פיגמנטציה, עם זאת, לאחר 4 שבועות חלק התאים יש hyperpigmented (איור 2).
טוהר התרבות תאי RPE ראשי יכול להיות מוערך על ידי immunostaining באמצעות נוגדן RPE65 (retinoid isomerohydrolase, אנזים חיוני במחזור חזותי חוליות המאפשרת את ההמרה של כל-טרנס-retinyl אסטרים 11-cis-רטינול במהלך phototransduction) (איור 3, אדום). ניתן להדגים את תקינות צמתי לתא ואת נוכחותם של צורת משושה באמצעות phalloinin מכתים (איור 3, ירוק). בנוסף, ביטוי של זואי-1 חלבון, מרכיב חשוב של צמתי צר, הניתנים לאימות באמצעות המערבי סופג (איור 4) או immunostaining.
התוצאות שלנו להפגין כי התרבויות RPE העיקרי שהושג העכבר מסוגלים להתרבות, שומרים על פיגמנטציה, צורת משושה, צמתי צר, ולבטא את סמני פונקציונליים כגון RPE65.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig1.jpg"> איור 1 . שלבים שונים של העין ביתור להשיג RPE ראשי תא תרבויות. () לאחר דיסוציאציה ב 2% dispase, רוחץ את העין מדיום הגידול. (b) עיינית האחורי מתקבל על ידי הסרת את הקרנית ואת העדשה. (ג) עיינית וכתוצאה מכך מנוקה עוד יותר על-ידי הסרת הקשתית המשויך פיגמנט האפיתל. (ד) לאחר נוסף הדגירה במדיום הגידול, עיינית נחתך בצורה רדיאלית ליצירת הגזרות. (ה) הרשתית עצבית קולפה מהמתחם RPE-שכבה דמית-בסקלרה הנותרים. (נ) RPE הסדינים מופרדים בעדינות הממברנה של ברוך. שים לב כי RPE נראה יותר חום (חיצים), בעוד דמית העין הוא כהה יותר ודביק מאוד. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56997/56997fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig2.jpg"> איור 2 . תאי RPE העיקרי של עכבר 3 - בן שבועיים תרבותי על הוספה ממברנה פוליאסטר 12 מ מ טעון מראש ב 12-ובכן תרבות צלחות. העכבר הראשי RPE התרבות נוצרו מ- 2 עכברים ב 12 מ מ ממברנה פוליאסטר הוספה מגיע ל 90-95% confluency לאחר שבוע 1 בתרבות (א). לאחר 2 שבועות של תרבות, התאים הגיעו confluency 100% והחל ליצור פסיפס של תאים משושה, פיגמנט, דו-nucleated (b). על ידי 3 שבועות של התרבות התאים המשיך כדי ליצור את הצורה והסגנון של פיגמנטציה (c), עם זאת, לאחר 4 שבועות חלק של תאים יש hyperpigmented (d). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56997/56997fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig3.jpg"> איור 3 . סמן תאי RPE, RPE65, הוא לזיהוי תאי RPE העכבר הראשי. תאי RPE העכבר הראשי לאחר 4 שבועות של תרבות קבוע ב- 4% paraformaldehyde (PFA), מודגרות עם נוגדנים RPE65 או מאגר חסימה של הפקד שלילי (NC). Phalloidin (ירוק) ודאפי (כחול) נוספו גם מכתים את קרום התא ואת הגרעינים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56997/56997fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig4.jpg"> איור 4 . דה מרקר של צמתי צר, זואי-1 מתבטאת תאי RPE העיקרית. תאי RPE העכבר הראשי (mRPE) נבצרו לאחר 3 שבועות של התרבות, µg 8 של התא lysate היה לרוץ על אבן חשופה המערבי. הסכום המקביל של תאי ARPE-19 (זמינים מסחרית יציב RPE תא קו) שימשו כפקד שלילי. זואי-1 היה ביטוי מאוד תאי RPE העיקרי בזמן שנעדרתי, מתאי ARPE-19. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56997/56997fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

Video: Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...