אנו מודים ד ר רוב Sladek עבור השימוש המאתר הזרקת דיו. אנו להכיר הסופי התמיכה של קנדי מכוני הבריאות מחקר (CIHR), את מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC), מכון המחקר הקנדי של החברה סרטן, קרן קנדה עבור חדשנות (CFI). די. ג'יי תודה תמיכה של כיסא מחקר קנדה.

1. ייצור ואחסון של הצמד שבבי בשיטת העברה יחיד <ol><li>( איור 1 א') <ol><li>ספוט פתרונות cAb המכיל נוגדנים µg/mL 400 ו- 20% גליצרול בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על גבי ניטרוצלולוזה (או כוס functionalized) assay שקופית עם הזרקת דיו microarray שהמשגיח 13 ב לחות יחסית של 60% (1.2 nL בכל מקום) עם 800 ריווח מרכז למרכז מיקרומטר. ודא השקופית קבוע על סיפון צפייה על פי בפינה אחת (כאן, בפינה השמאלית התחתונה שימשה).</li>
		<li>דגירה השקופית assay הבחין בטמפרטורת החדר במשך 1 h עם לחות יחסית של 60%.</li>
		<li>תהדק את אטם מודול שקופיות עם 16 תאים בשקופית assay לחלק זה 16 בארות. לשטוף את השקופית שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 80 ל- PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST) לתוך כל טוב, ומטלטל ב rpm 450 על מטרף, 5 דקות בכל פעם.</li>
		<li>80 להוסיף µL של חסימת פתרונות אחד טוב וללחוץ על 1 h 450 סל ד.</li>
		<li>להסיר את האטם ויבשה השקופית assay עם זרם של חנקן.</li>
		<li>לתקן את שקופית העברה על סיפון שהמשגיח ודחף הפינה השמאלית התחתונה של השקופית נגד בפינה השמאלית התחתונה של סיפון צפייה. הזרקת דיו ספוט מערך של סימני יישור (פתרון של מיקרו-חרוזי פוליסטירן) באותה פריסה עד כדי כך על המוניות.</li>
		<li>לתת את סימני יישור יבש. הפוך את השקופית העברה ותחזיר אותו בחזרה לתוך הסיפון שהמשגיח, תיקון נגד בפינה השמאלית התחתונה.</li>
		<li>להכין את dAb איתור פתרונות המכיל נוגדנים µg/mL 20, 20% גליצרול ו 1% BSA.</li>
		<li>באמצעות את המאתר &#39; מצלמה s, תצלם תמונה סימן יישור. ליישם את התמונה לתוך התוכנית spotting כמו fiducial, את מערכת זיהוי תמונה של המאתר הזרקת דיו כדי לזהות את הסימן השמאלי העליון ביותר. להשתמש את הקואורדינטות הנקודה הראשונה של המערך dAb. מקום 8 nL לכל droplet עם מרווח מרכז למרכז של מיקרומטר 800-</li>
	</ol></li> <li>בשיטת העברה כפול ( איור 1b) <ol><li>מקום העברה שקופית 1 על סיפון שהמשגיח הזרקת דיו נגד בפינה השמאלית התחתונה. לזהות פתרונות מוניות המכיל 400 נוגדנים µg/mL גליצרול 20%, 1% BSA ב- PBS אותן לשקופית עם וחברתה microarray הזרקת דיו הלחות היחסית של 60% (0.4 nL בכל מקום ו ~ 200 מיקרומטר בקוטר). המרווח מרכז למרכז הוא 400 מיקרומטר.</li>
		<li>הצמד העברת שקופיות ניטרוצלולוזה מצופה (או כוס functionalized) assay השקופית באמצעות מנגנון הצמדה ( איור 2) להעביר את טיפות המונית על גבי השקופית וזמינותו.
		<ol><li>להפוך כל שישה כפתורים בצד של מנגנון הצמדה ב- 90 מעלות כדי למשוך. ותנעלי את כל בוכנות במצב פתוח. הכנס את השקופית העברה מחזיק שקופיות בהקיבול עם הפינה החתוכים מול ה-pin פוגו קבוע. להפוך את הסט הראשון של שלושה לחצנים כדי לשחרר את בוכנות עם הפין פוגו הזהב ולוודא השקופיות יידחפו נגד הפינים יישור.</li>
			<li>להוסיף שקופית בציפוי ניטרוצלולוזה snap המנגנון יושבת הפוך על הפינים פוגו 4. להפוך את הסט השני של שלושה לחצנים לשחרר בוכנות עם הפין כסף. ולוודא השקופיות יידחפו נגד הפינים יישור.</li>
			<li>לסגור את המנגנון snap על-ידי הצבת את הקליפה העליונה את המחזיק שקופיות באמצעות יישור עמודי חורים לצורך מיקום מדויק.</li>
			<li>להכניס את המנגנון snap סגור בכלוב, לדחוף את הכרטיסיה הסגר לגמרי למטה להביא את פנים אל פנים תוך יישום הלחץ המתאים מיקרו-מערכים. לשמור סגור עבור מינימלית 1</li>
		</ol></li> <li>להפריד את השקופיות. דגירה השקופית assay בטמפרטורת החדר במשך 1 h עם לחות יחסית של 60%. רוחצים, לחסום, ומייבשים את השקופית assay כמתואר בצעדים 1.1.3 - 1.1.5.</li>
		<li>במקום אחר העברת שקופיות על הזרקת דיו שהמשגיח ותתרחק לדחוף בפינה השמאלית התחתונה. פתרונות dAb ספוט המכיל µg 50 או 100/mL של נוגדנים (ראה טבלה 1), 20% גליצרול BSA 1% ב- PBS. להבטיח כי כל נקודה היא 0.8 nL מרכז למרכז המרווח בין נקודות הוא 400 מיקרומטר.</li>
		<li>לאחסן וזמינותו של השקופית העברה. חותם השקופיות assay וגם העברת תיק אטום המכיל סופג לחות ושם במקפיא-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. מרובב immunoassays עם צ'יפס הצמד <ol><li>אחזר השקופית assay מהמקפיא. תשאיר את התיק סגור במשך 30 דקות עד השקופית מגיע לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להכין 7 נקודות סדרתי מדולל פתרונות לדוגמה על ידי spiking חלבונים ב- PBS המכילה 0.05% Tween-20- 
	הערה: כאן, גורם לדילול 5-fold משמש. הריכוזים ההתחלה עבור כל חלבון המפורטים בטבלה 1-</li>
	<li>הכן פתרונות לדוגמה לפי הצורך. לדוגמה, לדלל בנסיוב אדם 4 פעמים במאגר PBST.</li>
	<li>תהדק את אטם 16-תא בשקופית assay.</li>
	<li>למלא טור אחד של בארות 8 עם הפתרונות דילול 7 חלבונים ופתרון ללא חלבון מאגר PBST על ידי pipetting. Pipette הפתרונות מדגם בבארות 8 אחרות בשקופית אותו. 
	הערה: פתרונות µL 80 יכול להתאים בכל טוב. עוד שקופיות יכול לשמש כדי למדוד דוגמאות נוספות בעת הצורך.</li>
	<li>דגירה בדגימות על מטרף-סל ד 450 לשעה בטמפרטורת החדר או נלון בשטיפת מעלות צלזיוס 4 השקופית שלוש פעמים עם PBST על ניעור ב 450 סל ד, 5 דקות בכל פעם. הסר את האטם ויבשה השקופית תחת זרם של גז חנקן.</li>
	<li>לאחזר את השקופית העברה עם ודבס מהמקפיא. לשמור על התיק סגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגירה השקופית בתוך תא סגור (למשל תיבת טיפים ריק) המכיל 60% לחות מייצב חרוזים במשך 20 דקות על התייבשות.</li>
	<li>להצמיד את השקופית ההעברה הכוללת השקופית assay באמצעות מנגנון הצמדה ( איור 2) להעביר את טיפות dAb. עיין בסעיף 1.2.2 עבור הפעולה של המנגנון snap-</li>
	<li>נפרדים בשקופיות. דגירה השקופית assay בתוך תא סגור המכיל 60% לחות מייצב חרוזי ח' 1 קלאמפ השקופית assay עם אטם 16-תא ולשטוף את השקופית 4 פעמים באמצעות PBST על מטרף-450 סל ד, 5 דקות בכל פעם.</li>
	<li>פיפטה 80 µL של פתרונות המכילה 2.5 µg/mL streptavidin fluorophore ב- PBS כל טוב. תקופת דגירה של 20 דקות על מטרף-450 סל ד.</li>
	<li>יש לשטוף את השקופית 3 פעמים עם PBST ופעם אחת עם מים מזוקקים על ניעור ב 450 סל ד. הסר את האטם, לייבש את השקופית באמצעות גז חנקן.</li>
</ol> 3. שקופית סריקה וניתוח נתונים <ol><li>סרוק השקופית assay עם סורק microarray פלורסצנטיות באמצעות הלייזר 635 nm.</li>
	<li>לחלץ את עוצמת נטו בכל מקום באמצעות תוכנה (למשל מנתח מערך-pro) ניתוח 16.</li>
	<li>לחשב את הגבול של זיהוי (לוד) של כל חלבון באמצעות תוכנת סטטיסטיקה ולקבוע את ריכוז חלבון הדגימות. 
	הערה: לוד מוגדר החיתוך-Y של תקן cuשיחרר גז שמונה לפי שלוש פעמים סטיית תקן של שלושה מבחני עצמאי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li><li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers:+CEA,+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases.">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li><li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA.">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li><li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility.">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li><li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-analyte+immunoassay.">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li><li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes.">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li><li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera:+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers.">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li><li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis.">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li><li>Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+in+antibody+microarrays+and+multiplexed+sandwich+assays:+shedding+light+on+the+dark+side+of+multiplexing.">Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).</li><li>Blank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-chip+protein+arrays:+force-based+multiplex+sandwich+immunoassays+with+increased+specificity.">Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA:+A+Programmable+Force+Sensor.">DNA: A Programmable Force Sensor.</a> Science. 301 (5631), 367-370 (2003).</li><li>Pla-Roca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Colocalization+Microarray:+A+Scalable+Technology+for+Multiplex+Protein+Analysis+in+Complex+Samples.">Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples.</a> Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).</li><li>Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-to-Microarray+Transfer+of+Reagents+by+Snapping+of+Two+Chips+for+Cross-Reactivity-Free+Multiplex+Immunoassays.">Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).</li><li>Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+snap+chip+for+high-density+sub-nanoliter+chip-to-chip+reagent+transfer.">A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11688 (2015).</li><li>Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray.">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li><li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance.">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry.">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays.">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li><li>Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+(MetaChip)+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses.">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li><li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate.">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li><li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis.">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li><li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis.">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28 (2016).</li><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray.">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening.">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li></ol>

אוניברסיטת מקגיל הגישה בקשה לרישום פטנט על היבטים מסוימים של עבודה זו עם Huiyan Li, Juncker דוד כמו ממציאים.

בעבודה זאת, הובאו טכנולוגיה שבב הצמד שעושה את immunoassays cross-reactivity ללא מולטיפלקס הנפוצה של החוקרים עם הגדרת הניסוי הבסיסי. שונה קיים נוגדן מיקרו-מערכים, שהמשגיח microarray אין צורך עבור משתמשי קצה. יחיד והן בשיטות העברת כפול מודגמות, ומאפשרת העברה כפולה דיוק מעולה יישור למטה כדי ~ μm 40 נקודות 98%, עם אי-התאמות הגדול של מיקרומטר 6314. מנגנון הצמדה הרומן פותחה לצלם בנוחות שתי שקופיות עם לחץ עקבי, לנגישים לחוקרים טכנולוגיה זו. העברת ריאגנט אמין ממומש בשקופיות בציפוי ניטרוצלולוזה אלא גם בשקופיות זכוכית רגילה, הרחבה משמעותית של היישום של טכנולוגיה זו ללא הצורך של הכשרה נרחבת. כדי להדגים את השימושיות של השבב snap, מתכלה 50-ה-plex נערך באמצעות שקופיות קדם הבחינו ומאוחסן, 70% של החלבונים בתאריך LODs טווח של pg/mL14. בהשוואה immunoassays מולטיפלקס הקיימים החלים ודבס תערובת, יתרון חשוב של ACM ואת הטכנולוגיה שבב snap הוא כי מבחני על שבב אינם תלויים אחד לשני, ובכך מאפשר הוספה או הסרה של כל הנוגדן זוגות ללא מפריעה כל זוגות אחרים. עשרות עד מאות חלבונים ניתן למדוד בו זמנית עם שבב snap, ובכך קיצור זמן assay לעומת שיטות אחרות כגון טורי המדידה אוטומטית על ידי דגירה רציפים אשר דורש יישום טורי של כל נוגדן 17. רק sub-nanoliter של כל נוגדן נדרש עבור ייצור השבב snap, שהופך אותו כלכלית יותר מאשר immunoassays קונבנציונלי.
ריכוז נוגדן בשימוש והשלבים הדגירה אנטיגן הם קריטיים כדי להשיג רגישות גבוהה וזמינותו. בייצור של snap chips, ריכוז נוגדן ניתן למטב בהתאם זיקתו של זוגות נוגדן ואת סוג של השקופיות assay (ניטרוצלולוזה או שאינם ניטרוצלולוזה). הכרכים של כל נקודה נוגדן ניתן להתאים בהתאם קיבולת שהמשגיח והדיוק יישור, מרכז למרכז המרווח בין המקומות יכול להשתנות בהתאם. לאחר העברת תאי אל השקופית assay, אנחנו מודגרות השקופית assay בטמפרטורת החדר הדגירה לילה ח' 1-4 ° C יכול לתת יותר קיבולת איגוד נוגדן. BSA חינם מייצב פתרונות (ראה את הטבלה של חומרים) שימשו כאן כדי לחסום את השקופית assay לאחר המקננת מוניות. ריאגנטים חסימה אחרים כגון סרום בעל חיים או חלב יפעלו גם עבור יישום זה.
Immunoassays מרובבת, פרוטוקולים עבור שקופיות שאינן ניטרוצלולוזה בכימיה משטח שונים יכול להיות שפותחה, אופטימיזציה. גורם לדילול שונות ניתן לבצע עיקולים סטנדרטית בהתאם החלבונים היעד. Fluorophores שונים יכול לשמש כדי לתייג דבס, השקופית ניתן לסרוק באמצעות לייזר-אורך גל שונה לאוסף אות.
כיום, צפיפות של כתמים/cm 6252 הושגה עם שיטת העברה כפולה14. כדי לשפר את היכולת multiplexing של השבב snap, מספר אסטרטגיות הינם זמינים. ראשית, אמצעי אחסון קטן יותר יכול לשמש כדי להקטין את הגודל של המקומות, ובכך מאפשר למרחק ממרכז למרכז קצר בין כתמים לצפיפות של מערך מוגברת. שנית, ניתן לבחור שקופית העברה עם משטח יותר הידרופובי כדי להקטין את גודל המקום. שלישית, יישור טוב יותר בין מיקרו-מערכים שני אולי להיות מושגת על ידי ביצוע התאמת משובח של המאתר הזרקת דיו, נוספים מיטוב הפרמטרים spotting כמו המרחק בין חרירי על פני שקופיות.
לגבי כל נוגדן מבוססי immunoassays, הביצועים של ראגנטים שבב הצמד כפוף זמינות ואיכות נוגדנים. השבב snap פועלת באמצעות תבנית assay כריך, שהיא תבנית assay הנפוצה ביותר ב- ELISA בשל רגישות גבוהה וספציפיות המוענקת על ידי האיגוד כפול, רציפים של זוג נוגדנים מיקוד epitopes שונים, אבל זה תלוי הזמינות של זוג תואם נוגדנים הדרושים עבור לכידת וזיהוי של החלבון היעד.
הערך של טכנולוגיית השבבים הצמד הוא הקים immunoassays, וזה צפוי כי זה עשוי לשמש עבור כל התגובות כימי וביוכימי הדורשות יישום ריאגנטים שונים ללא קרוס-contaminations18,19 , 20 , 21 , 22. למעשה, השבב snap מספקת פתרון כללי אספקת שונים ריאגנטים קדם הבחינו מפני microarray-כדי-microarray, ובכך ביטול השיוך הזיוף שבב עם ההליך assay, ואין לכן מסייע מיעון " מאקרו-כדי-micro"מגשרים אתגר23. לדוגמה, השבב snap שימש במשך assay עיכוב אנזים הומוגנית 4-פלקס לנתח בתנאים 128 עם תזמון מדויק, תוצאות דומות נפח גדול ניסויים14. זה גם הוחל על רקמות מרובבת מכתים. בנוסף, זה יכול לתרום סמים הקרנת יישומים כדי לבדוק את אלפי חומרים כימיים על חיידקים שונים או תאים, תא בודד ניתוח21,24, או כדי לבדוק תנאים שונים ביחיד או צעד מרובת כימי תגובות.

פאנל של סמנים ביולוגיים הכוללת חלבונים מרובים עשויים לספק רגישות וספציפיות גבוהה יותר מאשר סמן בודד באבחון של מחלות מורכבות כגון סרטן1,2. וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) כבר הטכנולוגיה תקן זהב בשימוש במעבדות קליניות בהשגת גבול של זיהוי-pg/mL נמוכה בפלסמה, אבל לתחום יעד אחד לכל assay3,4,5. מיקרו-מערכים נוגדן פותחו עבור אדיב אלפי מבחני ולמחקר שנערך במקביל7,86,שקופיות מיקרוסקופ יחיד. עם זאת, היכולת multiplexing של שיטה זו הוא מוגבל על ידי מונחה ריאגנט אשיג, הנובע היישום של תערובת של דבס, הוא הופך להיות יותר בעייתי עם מספר גדל והולך של מטרות9,10 , 11. פלה ואח. הצהירו כי פגיעות וכתוצאה מכך assay כריך מולטיפלקס מושפעת 4N(N-1) כאשר N הוא מספר מטרות12.
כדי להמתיק אשיג ב נוגדן מיקרו-מערכים, נוגדן colocalization microarray (ACM) פותחה במעבדה שלנו כריך מולטיפלקס assay12. לכידת נוגדנים (מוניות) הם הבחינו על מצע עם תצפיתן microarray. לאחר חסימת דגימות מוחלים על פני השטח, ואז ודבס בודדים הם הבחינו על המקומות זהה עם קומפלקס אנטיגן המונית. אפשרות לפתור כל התרחישים אשיג בין נוגדנים אנטיגנים עם ACM, מגבלות של זיהוי-pg/mL הושגו. עם זאת, פרוטוקול assay דורש הכנה של הבחינה של דבס במהלך הניסויים באמצעות שהמשגיח microarray באתר עם דיוק גבוהה לצורך היישור, וזה זמן רב ויקר, הגבלת יישום נרחב של טכנולוגיה זו ב- מעבדות אחרות. ACM כף-יד, בשם צ'יפ snap פותחה עבור cross-reactivity חינם, ללא שהמשגיח מגה-פלקס כריך immunoassays13,14,15. מוניות, דבס נצפה מראש על גבי של assay ושקופית העברה בהתאמה בתבנית microarray, מאוחסנים. במהלך וזמינותו, השקופיות מאוחזרות, microarray של דבס מועברים באופן קולקטיבי על גבי השקופית assay מאת פשוט מצלם את האסימונים שני ביחד. מנגנון הצמדה משמש להעברת ריאגנט אמין. ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות עם קיבולת איגוד נוגדן גדולה יחסית שימשו כמו assay השקופיות כדי לספוג את טיפות נוזל, ובכך להקל על העברת ריאגנט, עם זאת, השקופיות יקרים יותר שקופיות זכוכית רגילה, microarray סורקים תואם עם מגלשות שאינם שקופים נדרשים עבור רכישת אות.
בעבודה זאת, נדגים את הפרוטוקול של ביצוע של ראגנטים מולטיפלקס כריך עם שבב snap. מנגנון הצמדה הרומן פותחה עבור העברת ריאגנט יותר נוח ואמין microarray-כדי-microarray. חשוב לציין, כאן הקמנו שיטת ההעברה מגיב על גבי זכוכית רגילה שקופיות עם השבב snap. 1024 כתמים בהצלחה להעביר, מיושרים על זכוכית, הרחבה משמעותית את השימוש בטכנולוגיה זו במעבדות רוב.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5246501EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated Cy5</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>s000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer</td>
			<td>SurModics, Inc</td>
			<td>SG02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose coated slides</td>
			<td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td>
			<td>305116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane coated slides</td>
			<td>Schott North America</td>
			<td>1064875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Device</td>
			<td>Parallex BioAssays Inc.</td>
			<td>PBA-SD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkjet microarray spotter</td>
			<td>GeSiM</td>
			<td>Nanoplotter 2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide module gasket</td>
			<td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td>
			<td>204862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Stabilization Beads</td>
			<td>Parallex BioAssays Inc.</td>
			<td>PBA-HU60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Array-Pro Analyzer software</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td>Version 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SureScan Microarray Scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biostatistics software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1097-EN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF1097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6a (see Table 1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6b (see Table 1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays

אנליזת חלבונים מרובבת הראו סופריור אבחון רגישות ודיוק לעומת חלבונים יחיד. מיקרו-מערכים נוגדן לאפשר לאלפי immunoassays מיקרו-סולם מבוצעים בו-זמנית על שבב יחיד. כריך assay תבנית משפר assay ירידה לפרטים על ידי גילוי לכל מטרה עם שני נוגדנים, אבל סובל אשיג בין ריאגנטים ובכך יגביל את יכולות multiplexing שלהם. נוגדן colocalization microarray (ACM) פותחה לגילוי חלבון מרובבת cross-reactivity חינם, אך דורש של צופה יקר באתר עבור ייצור microarray במהלך מבחני. בעבודה זאת, נדגים טכנולוגיה שבב snap מעבירה ריאגנט מ microarray-כדי-microarray מאת פשוט ההצמדה יחד, שולכן אין שהמשגיח יש צורך בתקופת הדגירה מדגם, יישום עוקבות של זיהוי נוגדנים (דבס) על שני צ'יפס אחסון של שקופיות קדם הבחינו, בריא הכנת שקופית מהוצאה להורג וזמינותו. שתי שיטות ההעברה ליחיד מוצגים כדי להשיג יישור מדויק בין מיקרו-מערכים שני ומתוארות הזיוף שקופיות עבור שתי שיטות. התוצאות מראות כי &#60; 40 μm יישור הושגה עם העברה כפולה, להגיע עם צפיפות מערך של כתמים/cm 6252. ראגנטים 50-plexed נערכה כדי להדגים את השימושיות של השבב snap בניתוח מרובבת חלבון. הגבולות של זיהוי של חלבונים 35 נמצאות בטווח של pg/mL.

ההליך assay עבור יחיד והן בשיטות העברת כפול מוצג באיור1. העברה יחיד, המוניות הם הבחינו ישירות על השקופית assay, דבס מועברים על גבי השקופית assay על השימוש בתבנית מראה בנהגי המוניות (איור 1 א'). נדרש הליך העברה אחת בלבד, אך שיטה זו סובלת אי-התאמות בין שני מיקרו-מערכים, נגרמת בעיקר אי-התאמות זוויתי בין השקופית gantry הזרקת דיו (איור 2). גישה אחת כדי להתמודד עם האתגר הזה הוא להעביר למוניות והן ודבס ברצף על גבי השקופית assay לאחר הבחינה, ולתקן את השקופיות במנגנון snap כראוי (איור 1b). באמצעות שיטה זו, הן מיקרו-מערכים מועברים באותה התנוחה. אין תמונת זיהוי מערכת או יישור סמן נדרש עבור שיטת ההעברה כפול. אי-התאמות 98% של המקומות היה בתוך מיקרומטר 41, 6-fold שיפור לעומת שיטת העברה יחידה14.
מנגנון הצמדה תוכנן להיות קלה לשימוש ללא כל הדרכה ולצמצם את הסיכון של מערך אי-התאמות. השקופיות הם הביאו יחד עם מיקום מדויק הודות יישור סיכות המשותף assay וגם העברת שקופיות. השקופית העברה הוא קצת יותר קטן כדי להתאים מתחת לשקופית assay כאשר הושעה על ידי סיכות פוגו, עד לסגירת מנגנון הצמדה. כרווח כלולה בשקופית העברה שמירה על פער בגודל מיקרומטר, המאפשר העברת droplet אמין אל השקופית זכוכית. לבסוף, הכלוב ו- tab הסגר שלה נועדו להפעיל לחץ לצורך העברה יעילה על כל snap להעברת איכותי לשחזור. תמונה של מנגנון הצמדה מוצג באיור3.
להחליפן בתמונות הממחישות את התוצאות של ריאגנט העברה אל ניטרוצלולוזה ושקופית זכוכית מוצגים באיור4. 532 אלקסה הנקרא IgGs שימשו הכימית הראשונה, אלקסה 647 הנקרא IgGs שימשו הכימית השני. לאחר העברה, שנסרק השקופית עם 532 ננומטר, 635 ננומטר לייזר. התוצאה מראה כי 3136 (עבור השקופית ניטרוצלולוזה) או 1024 (עבור השקופית זכוכית) microspots הועברו עם אפס כשל על השקופיות assay, אין זיהום צולב נצפתה על העברת הכימית השני. בעת שימוש שקופיות זכוכית, זה אפשרי ליצור יותר הידרופובי השטח על-ידי functionalization, ובכך להקטין את הגודל של כל מקום, הקטנת המרחק ספוט-כדי-spot להעברת מספר גדול יותר של נקודות. עבודה זו מתרחב היישום של טכנולוגיית שבב snap כדי זכוכית נפוץ סובסטרטים.
עקומות סטנדרטי של ראגנטים 50-פלקס מיקוד סרטן השד קשורים חלבונים מומחשים איור 5, התואם microarray נוגדן כריך מולטיפלקס הגדול ביותר עד כה ללא אשיג. שיטת העברה כפולה היה בשימוש זה וזמינותו, השקופית שנסרק, עוצמת קרינה פלואורסצנטית הייתה לכמת להפקת העקומות סטנדרטי. 35 מתוך 50 חלבונים הגיע LODs-pg/mL (ראה טבלה 1), שיפור נוסף על-ידי מיטוב התנאים וזמינותו. Colocalization של ריאגנטים מקלה את השימוש מרובים הנוגדן זוגות בשקופית אחת ללא אשיג ומאפשר אופטימיזציה של כל זוג באופן עצמאי עם הפרעות על זוגות אחרים12. תוצאות אלה מצביעים על שהשבב הצמד הוא טכנולוגיה מדרגיים יכול לשמש עבור כימות מרובבת חלבון.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig1.jpg"> 
איור 1. סכמטי של הליך assay משווה (א) יחיד ושיטות העברה כפול (ב). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig2.jpg"> 
באיור 2. סכמטי מציג הבדלים בין יחיד, כפול-העברת. (א) שיקוף של ריאגנטים העברת מגביר את היישור הלקוי זוויתי בין השקופית השלב XY הזרקת דיו. (ב) כפול-העברת השיטה מתגבר על אי-התאמות זוויתי. חיבור מקורי אסמכתא 14 בעלי הרשאה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig3.jpg"> 
איור 3. צילום של המנגנון snap- (א) נפתח המכשיר. (b) המכשיר סגור. (ג) תצוגת פרספקטיבה של המכשיר. בקצרה, (i) העברת שקופיות הם מוצבים לתוך מחזיק שקופיות ודחף נגד סיכות יישור באמצעות את pogopin רכוב על בוכנות. (ii) השקופיות assay הממוקמת מעל pogopins, דחף את הסיכות יישור באמצעות קבוצה שנייה של בוכנות. (iii) המעטפת העליונה הממוקמים על המחזיק שקופיות, מוכנס לתוך הכלוב. לחץ מיושמת באמצעות הכרטיסיה הסגר לדחוס את pogopin ולהביא את השקופיות ביחד. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig4.jpg"> 
באיור 4. העברה קולקטיבית של כתמים באמצעות שבב snap- קרינה פלואורסצנטית סריקה באמצעות 532 ננומטר, לייזרים nm 633 להפגין העברה של נוגדנים על גבי ניטרוצלולוזה (א) שקופית (חיבור מקורי אסמכתא 14 עם הרשאה) ו (ב) זכוכית שקופית. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig5.jpg"> 
איור 5. קרינה פלואורסצנטית דימוי שקופיות assay ועיקולים סטנדרטי של חלבונים 50 נמדדו במקביל תוך שימוש בשיטת העברה כפולה. (א) זריחה דימוי שקופיות assay ליצירת עיקול רגיל. (ב) תקריב של מערך. סרגל קנה מידה = 2 מ מ. עקומות (ג) תקן 50 חלבונים. קווי שגיאה חושבו ככל סטיות תקן מן 3 ניסויים עצמאית. חיבור מקורי אסמכתא 14 בעלי הרשאה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>חלבון שם</td>
			<td>הריכוז ההתחלתי (ng/ml)</td>
			<td>לוד (pg/ml)</td>
			<td>חלבון שם</td>
			<td>הריכוז ההתחלתי (ng/ml)</td>
			<td>לוד (pg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANG2</td>
			<td>500</td>
			<td>1.3 × 104</td>
			<td>IL-6b</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr></tbody></table>	<td>BDNF</td>
			<td>500</td>
			<td>× 10 1.02</td>
			<td>IL-5</td>
			<td>50</td>
			<td>77</td>
		
		<tr>
			<td>CA 15-3 *</td>
			<td>1</td>
			<td>4.9 × 103</td>
			<td>IL-4</td>
			<td>1000</td>
			<td>1.5 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEA</td>
			<td>1000</td>
			<td>5.4 × 103</td>
			<td>IL-2</td>
			<td>50</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL10/IP-10</td>
			<td>50</td>
			<td>1.7 × 102</td>
			<td>LEP</td>
			<td>200</td>
			<td>4.0 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ה-CRP</td>
			<td>200</td>
			<td>44</td>
			<td>מיג</td>
			<td>500</td>
			<td>11 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENG</td>
			<td>1000</td>
			<td>6.2 × 102</td>
			<td>CCL3/MIP-1Α</td>
			<td>50</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>50</td>
			<td>1.8 × 102</td>
			<td>CCL4/MIP-1Β</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR</td>
			<td>200</td>
			<td>1.9 × 102</td>
			<td>MMP-3</td>
			<td>500</td>
			<td>× 10 1.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAS-L</td>
			<td>500</td>
			<td>4.5 × 102</td>
			<td>M-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>8.2 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>500</td>
			<td>× 10 1.03</td>
			<td>MMP-9</td>
			<td>200</td>
			<td>3.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>39</td>
			<td>CCL2/MCP-1</td>
			<td>50</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>50</td>
			<td>3.8</td>
			<td>NCAM-1</td>
			<td>500</td>
			<td>1.7 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRO-Α</td>
			<td>50</td>
			<td>3.0 × 102</td>
			<td>Β-גורם הגדילה העצבי</td>
			<td>200</td>
			<td>1.4 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2</td>
			<td>500</td>
			<td>3.5 × 103</td>
			<td>NT-3</td>
			<td>200</td>
			<td>5.8 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>200</td>
			<td>73</td>
			<td>OPN</td>
			<td>500</td>
			<td>1.9 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1Β</td>
			<td>500</td>
			<td>7.9 × 102</td>
			<td>RBP4</td>
			<td>200</td>
			<td>1.2 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1ra</td>
			<td>200</td>
			<td>1.1 × 103</td>
			<td>SPARC</td>
			<td>1000</td>
			<td>4.6 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>50</td>
			<td>8.2 × 102</td>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>50</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>TNF-RI</td>
			<td>50</td>
			<td>1.3 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-11</td>
			<td>500</td>
			<td>1.2 × 103</td>
			<td>TNF-RII</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>500</td>
			<td>6.1 × 102</td>
			<td>FAS/TNFRSF6</td>
			<td>200</td>
			<td>2.8 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>50</td>
			<td>6.6</td>
			<td>uPA</td>
			<td>200</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-7</td>
			<td>2.5</td>
			<td>26</td>
			<td>uPAR(CD87)</td>
			<td>200</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>1000</td>
			<td>84</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>200</td>
			<td>6.7 × 102</td>
		</tr>
	

טבלה 1- ריכוז חלבון, LODs מאגר של 50-פלקס וזמינותו. לוד עבור CA 15-3 הוא U/ml (*). חיבור מקורי אסמכתא 14 בעלי הרשאה.

Watch this Scientific Journal Video about Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays at JoVE.com

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.4K Views.  McGill University and Génome Québec Innovation Centre. נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

Video: Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...