Agradecemos al Dr. Rob Sladek el uso del telescopio de inyección de tinta. Reconocemos el apoyo final de los institutos canadienses de investigación de la salud (CIHR), la Ciencia Natural e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC), el Instituto canadiense de investigación de sociedad de cánceres y la Fundación Canadá para la innovación (CFI). D.J. gracias apoyo de una Cátedra de investigación de Canadá.

1. fabricación y almacenamiento de snap chips <ol><li>método de transferencia simple ( Figura 1a) <ol><li>punto cAb soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos y 20% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre una nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) diapositiva de ensayo con una de inyección de tinta microarray observador 13 en una humedad relativa de 60% (1.2 nL para cada punto) con espaciamiento de centro a centro de 800 μm. Asegúrese de que la diapositiva es fijada sobre la cubierta del observador según un ángulo (aquí, la esquina inferior izquierda fue utilizada).</li>
		<li>Incubar el portaobjetos manchada ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%.</li>
		<li>Abrazadera Junta módulo diapositivas con 16 compartimentos en la diapositiva de análisis para dividir en 16 pozos. Enjuagar el portaobjetos tres veces mediante la adición de 80 μl de PBS con un 0.1% Tween-20 (SAFT) en cada pozo y sacudiendo a 450 rpm en un agitador, 5 minutos cada vez.</li>
		<li>Añadir 80 μl de bloqueo para cada bien y agitar por 1 h a 450 rpm.</li>
		<li>Quite la Junta y secar el portaobjetos de ensayo con una corriente de nitrógeno.</li>
		<li>Fijar una diapositiva de transferencia en la cubierta del observador de tiro y empuje la parte inferior izquierda de la diapositiva contra la esquina inferior izquierda de la cubierta del observador. Tinta punto una amplia gama de marcas de alineación (una solución de micro-granos del poliestireno) con el mismo diseño que las cabinas de.</li>
		<li>Deje las marcas de alineación en seco. Tapa de la diapositiva de la transferencia y lo vuelva a colocar la cubierta de spotter, fijación contra la esquina inferior izquierda.</li>
		<li>Preparar el lenguado manchado las soluciones que contienen 20 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA.</li>
		<li>Usando el telescopio de &#39; s cámara, toma una foto de una marca de alineación. Implementar esta imagen en el programa de localización como una referencia y obtener el sistema de reconocimiento de imagen del telescopio de inyección de tinta para identificar la boya izquierda. Utilice sus coordenadas en el primer lugar de la matriz de dAb. Punto 8 nL por gota con un espaciamiento de centro a centro de 800 μm.</li>
	</ol></li> <li>Método de doble transferencia ( Figura 1b) <ol><li>colocar una diapositiva de transferencia 1 en la cubierta de quitamanchas de tinta contra la esquina inferior izquierda. Punto taxis soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS sobre la diapositiva con un spotter de microarray de inyección de tinta en una humedad relativa de 60% (0.4 nL para cada punto y ~ 200 μm de diámetro). El espaciamiento de centro a centro es 400 μm.</li>
		<li>Ajustar la transferencia con un recubrimiento de nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) ensayo diapositiva usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de la cabina en la diapositiva de ensayo.
		<ol><li>a su vez los seis botones laterales el aparato de presión por 90 grados y bloquear todos los elementos en la posición abierta. Insertar la diapositiva de transferencia en el soporte de diapositivas en su receptáculo con la esquina recortada hacia el perno del pogo fijo. La primera puesta de tres botones para liberar los émbolos con el perno del pogo oro y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.</li>
			<li>Insertar un portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa en el snap aparato boca abajo sentado en los 4 pines pogo. Gire el segundo conjunto de tres botones para liberar émbolos con el pin plata y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.</li>
			<li>Cerrar el aparato de presión mediante la colocación de la carcasa superior del soporte de diapositivas utilizando la alineación pilares y huecos para un posicionamiento preciso.</li>
			<li>Inserte el aparato cerrado snap en su jaula y presione la pestaña de cierre completamente para los microarrays cara a cara mientras se aplica la presión adecuada. Mantener cerrada durante 1 minuto</li>
		</ol></li> <li>Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%. Lavar, bloquear y secar el portaobjetos de ensayo como se describe en pasos 1.1.3 - 1.1.5.</li>
		<li>Ponga otra diapositiva de la transferencia en la cubierta de quitamanchas de tinta y empuje contra la esquina inferior izquierda. DAb punto soluciones que contienen 50 o 100 μg/mL de anticuerpos (ver tabla 1), glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS. Asegurarse de que cada punto es 0.8 nL y el espaciamiento de centro a centro entre puntos es de 400 μm.</li>
		<li>Tienda el ensayo y la diapositiva de la transferencia. Análisis y transferencia de diapositivas en una bolsa hermética que contenga desecante del sello y puso en un congelador de-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Multiplexado de inmunoensayos con snap chips <ol><li>recuperar la diapositiva de prueba del congelador. Deja la bolsa sellada durante 30 minutos hasta que el carro llega a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare 7 puntos serie diluida soluciones muestra por clavar las proteínas en PBS que contenga 0.05% Tween-20. 
	Nota: Aquí, se utiliza un factor de 5-fold dilución. Las concentraciones de partida para cada proteína se enumeran en la tabla 1.</li>
	<li>Preparar soluciones de muestra según el caso. Por ejemplo, diluir el suero humano 4 veces en buffer de SAFT.</li>
	<li>Abrazadera de una Junta de compartimiento 16 en la diapositiva ensayo.</li>
	<li>Llenar una columna de 8 pocillos con las soluciones de dilución de 7 proteína y una solución de tampón de SAFT proteínas mediante pipeteo. Pipetear las soluciones muestra en los otros pozos de 8 en la diapositiva misma. 
	Nota: se pueden caber 80 soluciones μL en cada pozo. Más diapositivas pueden utilizarse para medir muestras adicionales cuando sea necesario.</li>
	<li>Incubar las muestras en un agitador a 450 rpm por 1 h a temperatura ambiente o para pasar la noche a 4 ° C. lavado el carro tres veces con SAFT en el agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez. Retire la Junta y secar el portaobjetos bajo una corriente de gas nitrógeno.</li>
	<li>Recuperar el carro de transferencia con toques del congelador. Mantener la bolsa sellada durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, incubar el portaobjetos en una cámara cerrada (por ejemplo caja de consejos vacíos) que contiene granos de estabilización de humedad de 60% por 20 min para la rehidratación.</li>
	<li>Ajustar el carro de transferencia con la diapositiva de ensayo usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de dAb. Ver sección 1.2.2 para el funcionamiento de los aparatos de presión.</li>
	<li>Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo en una cámara cerrada que contiene granos de estabilización de humedad de 60% para h. 1 abrazadera de la diapositiva de ensayo con un empaque de 16 compartimentos y enjuagar el portaobjetos 4 veces con SAFT en un agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez.</li>
	<li>Pipeta 80 μl de las soluciones que contienen 2,5 fluoróforo estreptavidina μg/mL en PBS a cada pocillo. Incubar por 20 min en un agitador a 450 rpm.</li>
	<li>Enjuague la diapositiva 3 veces con Saft y una vez con agua destilada en el agitador a 450 rpm. Retire la Junta y secar el portaobjetos usando nitrógeno gas.</li>
</ol> 3. Deslice la exploración y análisis de datos <ol><li>analizar la diapositiva de prueba con un scanner de microarrays de fluorescencia usando el láser de 635 nm.</li>
	<li>Extraer la intensidad neta de cada punto mediante un análisis software (e.g. matriz pro analyzer) 16.</li>
	<li>Calcular el límite de detección (LOD) de cada proteína utilizando un software estadístico y determinar las concentraciones de proteína en las muestras de. 
	Nota: El LOD se define como la intersección de la norma cuincrementado en tres veces la desviación estándar de tres ensayos independientes RVE.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li><li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers:+CEA,+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases.">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li><li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera:+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers.">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li><li>Li, H., Leulmi, R. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray.">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening.">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li></ol>

La Universidad de McGill ha presentado una solicitud de patente en algunos aspectos de este trabajo con Li Huiyan y David Juncker como inventores.

En este trabajo, hemos presentado una tecnología de chip de complemento que hace las immunoassays multiplex Cruz-reactivity-free ampliamente disponible para los investigadores con configuración experimental básica. A diferencia de los microarrays de anticuerpos, ningún observador de microarrays es necesario para los usuarios finales. Se demuestran solo y métodos de transferencia de doble, y doble transferencia ofrece exactitud de la alineación superior a ~ 40 μm para los puntos del 98%, con el desalineamiento mayor de 63 μm14. Fue desarrollado un aparato novedoso complemento para ajustar convenientemente los dos portaobjetos con presión constante, haciendo esta tecnología accesible a los investigadores. Transferencia confiable reactivo se realiza no sólo en portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa, sino también en las diapositivas de vidrio ordinario, ampliando significativamente la aplicación de esta tecnología sin la necesidad de un entrenamiento extensivo. Para demostrar la utilidad de la viruta del cierre, un inmunoensayo de plex 50 se llevó a cabo usando las diapositivas previamente manchados y almacenados, y el 70% de las proteínas logrado LODs en la gama de pg/mL14. En comparación con los inmunoensayos multiplexores que lenguados se aplican como una mezcla, un beneficio importante de la ACM y la tecnología de chip de complemento es que los ensayos en un chip son independientes entre sí, permitiendo añadir o eliminar cualquier par de anticuerpo sin interferir con otras parejas. Decenas a cientos de proteínas pueden medirse simultáneamente con un chip rápido, acortando el tiempo de ensayo en comparación con otros métodos como la medición automatizada de serial por incubación secuencial que requiere aplicación de serie de cada anticuerpo 17. Sólo sub-nanoliter de cada anticuerpo es necesario para la fabricación de la viruta del complemento, lo que es más económico que los inmunoensayos convencionales.
Las concentraciones de anticuerpo utilizadas y los pasos de incubación de antígeno son críticos para alcanzar la sensibilidad del ensayo alta. En la fabricación de los chips del broche de presión, concentración de anticuerpo puede ser optimizado dependiendo de la afinidad de los pares de anticuerpos y los tipos de las diapositivas de ensayo (nitrocelulosa o no nitrocelulosa). Los volúmenes de cada punto del anticuerpo pueden ser ajustados en base a la capacidad del observador de tiro y la exactitud de la alineación y la separación centro a centro entre los puntos se puede cambiar por consiguiente. Después de transferir los taxis a la diapositiva de ensayo, incubamos la diapositiva de ensayo a temperatura de incubación durante la noche de 1 h. a 4 ° C podría dar mejor capacidad de unión del anticuerpo. BSA estabilizador gratis soluciones (ver la tabla de materiales) fueron utilizadas aquí para bloquear la corredera de ensayo después de la incubación de taxis. Otros reactivos bloqueo como leche o suero animal también pueden funcionar para esta aplicación.
En los inmunoensayos multiplexados, protocolos para portaobjetos de nitrocelulosa no con química de superficies diferentes pueden ser desarrollados y optimizados. Un factor de dilución diferentes puede ser utilizado para hacer curvas estándar dependiendo de las proteínas blanco. Fluoróforos diferentes pueden utilizarse para etiquetar dAbs y la diapositiva puede analizarse usando un láser a una longitud de onda diferentes para la recogida de la señal.
En la actualidad, se ha logrado una densidad de 625 puntos/cm2 con doble transferencia método14. Para mejorar aún más la capacidad de multiplexación de la viruta del cierre, varias estrategias están disponibles. En primer lugar, los volúmenes más pequeños pueden utilizarse para reducir el tamaño de las manchas, permitiendo así más corta distancia centro a centro entre puntos y aumento de la matriz densidad. En segundo lugar, se puede elegir una diapositiva de transferencia con una superficie más para reducir el tamaño del spot. En tercer lugar, mejor alineación entre los dos microarrays puede lograrse realizando ajuste fino del telescopio de inyección de tinta, y además optimizar el telescopios parámetros como la distancia entre boquillas y la superficie del portaobjetos.
En cuanto a los inmunoensayos basados en anticuerpos, el rendimiento del inmunoensayo de chip de snap es sujeto a la disponibilidad y calidad de los anticuerpos. El chip de cierre funciona mediante un formato de ensayo sándwich, que es el formato de ensayo más ampliamente utilizado en ELISA debido a la alta sensibilidad y especificidad de la Unión dual, secuencial de un par de anticuerpos dirigidos a diferentes epítopes, pero depende la disponibilidad de un par de anticuerpos compatibles necesarios para la captura y detección de la proteína diana.
Se establece el valor de la tecnología de chip de snap para inmunoensayos, y se espera que puede ser utilizado para reacciones químicas y bioquímicas que requieren aplicar diferentes reactivos sin contaminaciones cruzadas18,19 , 20 , 21 , 22. en realidad, el chip de cierre proporciona una solución general a entregar diversos reactivos de la moteada de microarrays para microarrays, desmarcando así la fabricación de la viruta con el procedimiento del ensayo y por lo tanto ayuda a hacer frente a la " entretela de macro a micro"desafío23. Por ejemplo, el chip de complemento se ha utilizado para un ensayo de inhibición enzimática homogénea 4-plex para analizar 128 condiciones con tiempos precisos y resultados comparables a los experimentos de gran volumen14. También se ha aplicado para la tinción de tejido multiplexado. Además, puede contribuir a aplicaciones para probar miles de productos químicos en diferentes bacterias o células, unicelular análisis21,24, o probar diferentes condiciones en química simple o multi-step de detección de drogas reacciones.

Puede proporcionar un panel de biomarcadores que comprende múltiples proteínas de más alta sensibilidad y especificidad que un único biomarcador en el diagnóstico de enfermedades complejas como cáncer1,2. El análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) ha sido la tecnología estándar utilizada en laboratorios clínicos alcanzar un límite de detección bajo pg/ml en plasma, sino límites a un destino por ensayo3,4,5. Microarrays de anticuerpos se han desarrollado para albergar miles de ensayos miniaturizados llevó a cabo en paralelo en un solo microscopio diapositiva6,7,8. Sin embargo, la capacidad de multiplexación de este método es limitada por reactividad cruzada basada en el reactivo, que surjan de la aplicación de una mezcla de lenguados, y llega a ser más problemático con un número creciente de objetivos9,10 , 11. Pla et al. han declarado que la vulnerabilidad resultante de un análisis multiplex emparedado escalas como 4N(N-1) donde N es el número de objetivos12.
Para mitigar la reactividad cruzada en microarrays de anticuerpos, anticuerpos colocalization microarrays (ACM) se ha desarrollado en nuestro laboratorio de ensayo sándwich multiplex12. Anticuerpos de captura (cAbs) son vistos en un substrato con un observador de microarrays. Después de bloqueo de las muestras se aplican en la superficie, y luego toques individuales son vistos en los mismos lugares con el complejo antígeno-cAb. Todos los escenarios de reactividad cruzada entre antígenos y anticuerpos pueden ser mitigados con ACM, y límites de detección en pg/mL se han logrado. Sin embargo, el protocolo de ensayo requiere preparación y manchado el dAbs durante los experimentos usando un spotter de microarray in situ con la alta precisión para propósito de la alineación, que es caro y consume tiempo, limitar la aplicación amplia de esta tecnología en otros laboratorios. Un mano ACM, llamado snap chip ha sido desarrollado para Cruz-reactivity-free y observador de tiro-libre multiplexar sandwich inmunoensayos13,14,15. Taxis y lenguados son pre-vistos en una diapositiva de ensayo y un tobogán de transferencia respectivamente en formato de microarrays y almacenados. Durante el ensayo, se recuperan las diapositivas y un microarray de lenguados son transferidos colectivamente en la diapositiva de ensayo simplemente chasquear las dos fichas juntos. Un aparato de presión se utiliza para la transferencia confiable reactivo. Portaobjetos de nitrocelulosa recubierto con una capacidad de enlace de anticuerpos relativamente grandes se han utilizado como las diapositivas ensayo para absorber las gotitas de líquido y así facilitar la transferencia de reactivo, sin embargo, las diapositivas son más caras que microarray y laminas de vidrio regular escáneres compatibles con diapositivas no transparentes son necesarios para la adquisición de señales.
En este trabajo, demostramos el protocolo de llevar a cabo un immunoensayo del emparedado multiplex con un chip de snap. Un aparato novedoso complemento ha sido desarrollado para la transferencia de reactivo más conveniente y confiable de microarray de microarrays. Aquí lo importante, hemos establecido el método de transferencia de reactivo sobre portaobjetos de vidrio ordinario con la viruta del cierre. 1024 puntos se transfirieron con éxito y alineados sobre un portaobjetos de vidrio, ampliando significativamente el uso de esta tecnología en la mayoría de los laboratorios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5246501EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated Cy5</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>s000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer</td>
			<td>SurModics, Inc</td>
			<td>SG02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose coated slides</td>
			<td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td>
			<td>305116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane coated slides</td>
			<td>Schott North America</td>
			<td>1064875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Device</td>
			<td>Parallex BioAssays Inc.</td>
			<td>PBA-SD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkjet microarray spotter</td>
			<td>GeSiM</td>
			<td>Nanoplotter 2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide module gasket</td>
			<td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td>
			<td>204862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Stabilization Beads</td>
			<td>Parallex BioAssays Inc.</td>
			<td>PBA-HU60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Array-Pro Analyzer software</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td>Version 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SureScan Microarray Scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biostatistics software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1097-EN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF1097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6a (see Table 1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6b (see Table 1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays

Análisis de la proteína multiplexada ha demostrado una sensibilidad diagnóstica superior y precisión frente a las proteínas solo. Microarrays de anticuerpos permiten miles de micro escala inmunoensayos realizados simultáneamente en un solo chip. Formato de ensayo sándwich mejora la especificidad del ensayo mediante la detección de cada destino con dos anticuerpos, pero sufre de reactividad cruzada entre reactivos lo que limita su capacidad de multiplexación. Microarray de colocalización de anticuerpo (ACM) ha sido desarrollado para la detección de proteína multiplexados Cruz-reactivity-free, pero requiere un costoso observador in situ para la fabricación de microarrays durante los ensayos. En este trabajo, demostramos una tecnología de chip de snap que transfiere reactivo de microarrays para microarrays por simplemente encaja a presión juntos, que así no observador es necesario durante la incubación de la muestra y posterior aplicación de anticuerpos de detección (dAbs) con dos fichas almacenamiento de portaobjetos previamente manchados, disociando la preparación de los portaobjetos de la ejecución del ensayo. Ambos métodos de transferencia individuales y dobles se presentan para lograr la alineación exacta entre los dos microarrays y la fabricación de la diapositiva para ambos métodos se describen. Resultados muestran que &#60; 40 μm alineación se ha conseguido con la doble transferencia, alcanzando una densidad de matriz de 625 puntos/cm2. Un inmunoanálisis de 50 plexed se ha realizado para demostrar la utilidad de la viruta del complemento en el análisis de la proteína multiplexados. Límites de detección de proteínas de 35 están en la gama de pg/mL.

El procedimiento del ensayo de single y doble métodos de transferencia se muestra en la figura 1. En una transferencia, los taxis son vistos directamente en la diapositiva de ensayo y los lenguados se transfieren en la diapositiva de ensayo al uso en forma de espejo de los taxis (Figura 1a). Procedimiento de solo transferencia se requiere, pero este método sufre de desalineación entre los dos microarrays, causada principalmente por el desalineamiento angular entre la diapositiva y del puente de la chorro de tinta (figura 2). Un enfoque para abordar este desafío es a taxis y lenguados secuencialmente en la diapositiva de ensayo después de localizar y fijar correctamente las diapositivas en el aparato de presión (Figura 1b). Usando este método, ambos microarrays son transferidos a la misma posición exacta. Ningún marcador de sistema o alineación de reconocimiento de imagen se requiere para el método de doble transferencia. El desalineamiento el 98% de los puntos fue de 41 μm, 6-fold mejora en comparación con el método de transferencia solo14.
El aparato de presión ha sido diseñado para ser fácil de usar sin ningún entrenamiento y minimizar el riesgo de desalineamiento de la matriz. Las diapositivas son llevadas junto con colocación exacta gracias a pernos de alineación común para el análisis y transferencia de diapositivas. La diapositiva de transferencia es un poco más pequeña para caber debajo de la diapositiva de ensayo cuando suspendió el pogo las clavijas, hasta que el aparato de presión está cerrado. Un espaciador es incluido en la diapositiva de transferencia manteniendo una brecha de tamaño micrométrico que permite transferencia confiable de la gotita a la diapositiva de cristal. Por último, la jaula y su lengüeta del encierro están diseñados para aplicar la presión necesaria para la transferencia de efectivo en cada complemento para transferencia reproducibles y de alta calidad. Una foto de los aparatos de presión se muestra en la figura 3.
Imágenes representativas que ilustran los resultados de la transferencia del reactivo sobre un portaobjetos de nitrocelulosa y un portaobjetos de vidrio se muestran en la figura 4. Alexa 532 etiquetado depósitos fueron utilizados como el primer reactivo, y Alexa 647 etiquetado depósitos fueron utilizados como el segundo reactivo. Después de la transferencia, la diapositiva fue analizada con 532 nm y 635 nm láseres. El resultado muestra que 3136 (para el portaobjetos de nitrocelulosa) o 1024 (para el portaobjetos de cristal) microspots fueron transferidos con cero falta en las diapositivas de ensayo y ninguna contaminación cruzada fue observada a transferir el reactivo de segunda. Cuando se utilizan laminas de vidrio, es posible crear más superficie de funcionalización, así reduciendo el tamaño de cada punto y disminuir la distancia de punto a punto para la transferencia de un mayor número de puntos. Este trabajo amplía la aplicación de la tecnología de chip de snap a substratos de vidrio utilizado.
Curvas estándar de un cáncer de mama dirigida a 50-plex inmunoensayo relacionadas con proteínas se ilustran en la figura 5, correspondiente al microarray de anticuerpo sandwich múltiplex más grande hasta la fecha sin reactividad cruzada. Método de doble transferencia fue utilizado en este ensayo, la diapositiva fue analizada y se cuantificó la intensidad de fluorescencia para generar las curvas estándar. proteínas de 35 clientes de los 50 llegó a LODs pg/ml (ver tabla 1) y puede mejorarse aún más mediante la optimización de las condiciones de ensayo. Colocalización de reactivos facilita el uso de múltiples pares de anticuerpos en una sola diapositiva sin reactividad cruzada y permite la optimización de cada par independientemente con la no interferencia de otros pares12. Estos resultados indican que chip snap es una tecnología escalable que puede utilizarse para la cuantificación de proteína multiplexados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquema de procedimiento de análisis que comparan solo (a) y (b) doble transferencia métodos. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig2.jpg"> 
Figura 2. Esquema que muestra las diferencias entre simple y doble transferencia. (a) reflejo de los reactivos de transferencia amplifica el desalineamiento angular entre la diapositiva y el XY de inyección de tinta. (b) transferencia de doble método supera la desalineación angular. Adaptado de referencia 14 con permiso. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig3.jpg"> 
Figura 3. Foto de los aparatos de presión. (a) abrir el dispositivo. (b) dispositivo cerrado. (c) perspectiva del dispositivo. Brevemente, () transfiera el portaobjetos se coloca en el soporte de diapositivas y empujado contra las clavijas de alineación con el pogopin montado en émbolos. (ii) las diapositivas de ensayo se colocan encima de la pogopins y empujadas contra las clavijas de alineación con un segundo conjunto de elementos. (iii) la carcasa superior es colocada sobre el soporte de diapositivas y se inserta en la jaula. Se aplica una presión usando la pestaña de cierre para comprimir el pogopin y unir las diapositivas. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig4.jpg"> 
Figura 4. Traslado de puntos usando un chip de un broche de presión. Análisis de fluorescencia con 532 nm y 633 lasers del nanómetro para demostrar la transferencia de anticuerpos en un (a) nitrocelulosa (b) vidrio diapositiva y diapositiva (adaptado de referencia 14 con permiso). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56230/56230fig5.jpg"> 
Figura 5. Imagen de fluorescencia de una diapositiva de prueba y curvas estándar de 50 proteínas medición en paralelo utilizando el método de doble transferencia. (a) imagen de de la fluorescencia de una guía de análisis para generar una curva estándar. (b) primer plano de una matriz. Barra de escala = 2 mm. (c) estándar curvas de 50 proteínas. Barras de error se calcularon las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. Adaptado de referencia 14 con permiso. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56230/56230fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nombre de la proteína</td>
			<td>A partir de concentración (ng/ml)</td>
			<td>LOD (pg/ml)</td>
			<td>Nombre de la proteína</td>
			<td>A partir de concentración (ng/ml)</td>
			<td>LOD (pg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANG2</td>
			<td>500</td>
			<td>1.3 × 104</td>
			<td>IL-6b</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr></tbody></table>	<td>BDNF</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 102</td>
			<td>IL-5</td>
			<td>50</td>
			<td>77</td>
		
		<tr>
			<td>CA 15-3 *</td>
			<td>1</td>
			<td>4.9 × 103</td>
			<td>IL-4</td>
			<td>1000</td>
			<td>1,5 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEA</td>
			<td>1000</td>
			<td>5.4 × 103</td>
			<td>IL-2</td>
			<td>50</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL10, IP-10</td>
			<td>50</td>
			<td>1,7 × 102</td>
			<td>LEP</td>
			<td>200</td>
			<td>4.0 x 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRP</td>
			<td>200</td>
			<td>44</td>
			<td>MIG</td>
			<td>500</td>
			<td>11 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENG</td>
			<td>1000</td>
			<td>6.2 × 102</td>
			<td>CCL3/MIP-1Α</td>
			<td>50</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>50</td>
			<td>de 1,8 × 102</td>
			<td>CCL4/MIP-1Β</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFR</td>
			<td>200</td>
			<td>1,9 × 102</td>
			<td>MMP-3</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAS-L</td>
			<td>500</td>
			<td>4,5 × 102</td>
			<td>M-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>8.2 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>500</td>
			<td>1,0 × 103</td>
			<td>MMP-9</td>
			<td>200</td>
			<td>3.1 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-CSF</td>
			<td>500</td>
			<td>39</td>
			<td>CCL2, MCP-1</td>
			<td>50</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>50</td>
			<td>3.8</td>
			<td>NCAM-1</td>
			<td>500</td>
			<td>1,7 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRO-Α</td>
			<td>50</td>
			<td>de 3.0 × 102</td>
			<td>Β-NGF</td>
			<td>200</td>
			<td>1,4 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2</td>
			<td>500</td>
			<td>3.5 x 103</td>
			<td>NT-3</td>
			<td>200</td>
			<td>5,8 x 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>200</td>
			<td>73</td>
			<td>OPN</td>
			<td>500</td>
			<td>1,9 × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1Β</td>
			<td>500</td>
			<td>7,9 x 102</td>
			<td>RBP4</td>
			<td>200</td>
			<td>1,2 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1ra</td>
			<td>200</td>
			<td>1.1 × 103</td>
			<td>SPARC</td>
			<td>1000</td>
			<td>4.6 × 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>50</td>
			<td>8.2 × 102</td>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>50</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>TNF-RI</td>
			<td>50</td>
			<td>1.3 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-11</td>
			<td>500</td>
			<td>1,2 × 103</td>
			<td>TNF-RII</td>
			<td>50</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>500</td>
			<td>6.1 × 102</td>
			<td>FAS/TNFRSF6</td>
			<td>200</td>
			<td>2,8 × 102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>50</td>
			<td>6.6</td>
			<td>uPA</td>
			<td>200</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-7</td>
			<td>2.5</td>
			<td>26</td>
			<td>uPAR(CD87)</td>
			<td>200</td>
			<td>76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6un</td>
			<td>1000</td>
			<td>84</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>200</td>
			<td>6,7 × 102</td>
		</tr>
	

Tabla 1. Las concentraciones de proteína y LODs en tampón de ensayo 50-plex. El LDD de CA 15-3 es en U/ml (*). Adaptado de referencia 14 con permiso.

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Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.4K vistas.  McGill University and Génome Québec Innovation Centre. Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Investigación

Bioingeniería

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

El chip Isotachophoresis para separación de iones y purificación de ácidos nucleicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hollow Microneedle basado en sensores para la detección electroquímica multiplexado transdérmica

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

Pruebas de susceptibilidad a antibióticos inducidas por el estrés en un chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip de microfluidos para ICPMS Introducción Muestra

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

La fabricación de dispositivos de microfluidos basados ​​en papel tridimensional para inmunoensayos

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...