עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסאקי של בריאות ורווחה.

1. גידול תאים, תוספת של אנטיגנים אקסוגני <ol><li>הכן בווה באמצעות תיוג של ביוטין-חלבון קיט בעקבות היצרן &#39; פרוטוקול s. 
	הערה: בדרך כלל, בווה מכיל 2 מ' ביוטין לכל ביצית 1 מ' בממוצע-</li>
	<li>DC2.4 לגדל תאים RPMI-1640 בתוספת 2 מ מגלוטמין 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ, פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, 55 מ"מ מרקפטואתנול, 10 מ מ HEPES (pH 7.5), סרום עגל עוברית 10% (להלן RPMI) ב 37 ° C 5 % CO 2 ב חממה humidified (להלן ללא אזכור, תאים מודגרת ב מצב זה). אפשרי גם להשתמש בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 3.7 g/L NaHCO 3 (להלן DMEM) במקום RPMI DMEM.</li>
	<li>ביום אחד לפני טיהור, פצל את התאים RPMI עונה 1 פרק 10 5 תאים/מ בצלחת תרביות רקמה. הימנע להשאיר את התאים במצב confluent. תאים DC2.4 יכול מאוד לשלב אנטיגנים אקסוגני עד מדינה confluent למחצה, אבל במהירות מאבדים את היכולת כשמגיעים למצב של יתר confluent.</li>
	תאים <li>לפני DC2.4 הם confluent למחצה, להוסיף µg/mL 250 של בווה עבור 1 x 10 6 תאים למ"ל, תקופת דגירה של 2-4 ה 
	הערה: במהלך הניסויים במורד הזרם, כל מאגרי, ריאגנטים נשמרים ב 4 ° C אלא אם צוין אחרת.</li>
</ol> 2. הכנת Microsomes <ol><li>לקצור את התאים DC2.4 על ידי pipetting עדין מהצלחת רקמה לתוך צינור חרוטי 50 מ ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C בזהירות להסיר את המדיום עם בווה על-ידי שאיפה.</li>
	<li>לרחוץ את התאים DC2.4 פעמיים עם 40 מ של מאגר PBS (1.37 מ מ NaCl, 8.1 מ מ נה 2 HPO 4, 2.68 מ מ אשלגן כלורי, 2 PO 1.47 אינץ מ מ ח' 4) על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות, 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.</li>
	<li>Resuspend בגדר בשלב 2.3 ב- 1 - 2 מ ל (כרך 1/20-1/10 של תרבות בינוני) המגון בינוני (0.25 M סוכרוז, 1 מ"מ EDTA, 10 מ מ HEPES-NaOH [pH 7.4]) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז והעברה DC2.4 resuspended תאים לתוך מהמגן דאונס קר כקרח.</li>
	<li>לשבש את התאים DC2.4 resuspended בעדינות על ידי 10-20 משיחות עם מהמגן דאונס קר כקרח. 
	הערה: במהלך השלב שיבושים, מהמגן דאונס הוא מקורר על קרח</li>
	<li>להעביר את המתלים שיבשו תא צינור חרוטי 15 mL-</li>
	<li>להוסיף 8-9 מ ל המגון בינוני הכולל 10 מ"ל, centrifuge את הצינור חרוט 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי 15-mL החדש כדי להסיר תאים רצופה, גרעינים, centrifuge את צינור חרוטי שוב 10 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור ultracentrifugation חדש צנטריפוגה למשך 45 דקות ב 100,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בקפידה תוך 1-2 מ של המגון בינוני עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז מאת pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים כדי להפוך שבר microsome לניסויים במורד הזרם.</li>
	<li>להעביר את השבר microsome לתוך צינור התחתון עגול 5-mL- 
	הערה: לאחר שלב זה, זה אפשרי להעשיר microsomes אובייקטיבי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות iodixanol על פי היצרן &#39; פרוטוקול s, כדי להסיר את microsomes שאינם ספציפיים. שברים שיא אנטיגנים אקסוגני של נאספים וכוח נתון אז השלב הבא של טיהור (שלב 3).</li>
</ol> 3. טיהור של Microsomes עם בווה עירד שעברו <ol><li>נפח הוסף 1/100 מערכו של טרי חרוזים SA-מגנטי כדי השבר microsome של צעד 2.11 ב 5 mL סיבוב התחתית התחתונה. 
	הערה: לפני שלב זה, זה אפשרי לנקות את השבר microsome מראש על ידי חרוזים שליטה-מגנטי כדי להפחית את contaminations של microsomes שאינם ספציפיים.</li>
	<li>מערבבים היטב ובעדינות לסובב את הצינור התחתון עגול לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להוסיף 2-3 מ"ל של מדיום המגון הכולל 4 מ"ל לתוך הצינור התחתון עגול ומערבבים בעדינות היטב.</li>
	<li>למקם את הצינור התחתון עגול על דוכן מגנטי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. מאז החרוזים קשורה השלפוחיות המוגלתיות נמשכים למגנט, חום מיקרו-חרוזים יצטברו בהדרגה אל הקיר הצינור הקרוב למגנט.</li>
	<li>עם הצינור שנותרו הדוכן מגנטי, בזהירות למחוק את supernatants על ידי השאיפה להסיר את השלפוחיות המוגלתיות לא מאוגד.</li>
	<li>לשטוף החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות פעמיים עם 5 מיליליטר המגון בינוני על ידי המגנטי לעמוד 10 דקות ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי השאיפה בזהירות. 
	הערה: ללא העמדה מגנטי, טיהור על ידי centrifugations ב g x 2,000 למשך 10 דקות, 4 ° C זמין גם.</li>
	<li>Resuspend החרוזים מגנטי קשורה השלפוחיות המוגלתיות היטב במדיום 100 µL המגון על-ידי pipetting הפתרון לאורך מספר פעמים.</li>
	<li>להעביר השלפוחיות המוגלתיות resuspended microtube חדשים כמו microsome מטוהרים לניסויים במורד הזרם. 
	הערה: בדרך כלל, 50 שבר microsome של µL, המכיל 5-20 חלבונים µg מתאי 7 עונה 1 פרק 10 ניתן לבודד.</li>
</ol> 4. ניתוח של Microsomes לטהר <ol><li>Resuspend המגנטי חרוזים מאוגדים השלפוחיות המוגלתיות מ 3.8 צעד 100-200 µL TNE מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז במקום המדיום המגון.</li>
	<li>להעביר את lysate שלב 4.1 microtube החדש 1.5-mL-</li>
	<li>לקבוע ריכוז חלבון שלב 4.2 באמצעות ערכת assay BCA לכל היצרן &#39; פרוטוקול s. 
	הערה: בדרך כלל, 5-10 µL lysate מהשלב 4.2 מספיקה כדי לקבוע ריכוז חלבון.</li>
	<li>להעביר את lysate מהשלב 4.2 (2 µg של חלבון עבור צביעת כסף ו 10 µg של חלבון עבור סופג המערבי) לתוך חדש microtubes.</li>
	<li>לשים את microtubes על גוש חום-95 ° C ומרתיחים חלבונים 1 x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר (100 מ מ טריס-HCl pH 6.8, 200 מ"מ dithiothreitol, 4% מרחביות, 0.2% bromophenol כחול, 20% גליצרול) עבור 5 דק</li>
	<li>Centrifuge את microtubes 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtubes חדש כדי להסיר את השברים לא מסיסים.</li>
	<li>לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (2 µg) מאת SD רגיל-דף.</li>
	<li>Visualize הלהקות חלבונים על ידי כסף מכתים באמצעות צביעת כסף קיט בעקבות היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
	<li>לנתח את החלבונים נפתרה בשלב 4.6 (10 µg) על ידי SD-דף רגיל סופג-מערבי. השתמש הכימית (SA-HRP) לכל היצרן &#39; s פרוטוקול והמחש מאת fluorography.</li>
</ol> 5. במבחנה בנייתו מחדש של עירד Ubiquitination של בווה באמצעות מטוהר Microsomes microsomes <ol><li>העברה מטוהרים (5-10 µg של חלבון) משלב 3.8 עם נפח 50% של רטיקולוציט lysate (RL), 1 x תגובת מאגר (50 מ מ טריס pH 7.4, 3 מ מ ATP, 0.5 מ מ MgCl 2), ו- 0-שתיים pM מתויג דגל אוביקוויטין ב microtube החדש. הנפח הסופי של הניסוי הזה הוא 20-40 µL.</li>
	<li>Incubate microtube עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: אם כמות ubiquitinated בווה בשלב 5.12 הוא קטן מדי כדי לזהות סופג המערבי, להוסיף 10 מיקרומטר של MG132 או 2 מיקרומטר של lactacystin כדי לעכב את העיבוד של בווה ubiquitinated מאת proteasomes.</li>
	<li>לעצור את התגובה על ידי הצבת את microtube על קרח</li>
	<li>לפתור את microsomes על-ידי הוספת 500 מאגר TNE µL עם נפח 1/1000 של קוקטיילים מעכב פרוטאז.</li>
	<li>צנטריפוגה microtube 10 דקות ב- 21,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים, אשר מכילים בווה ubiquitinated ב DC2.4 לפני וזמינותו ubiquitination במבחנה.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע microtube חדש ולהוסיף 1/100 בכמויות החרוזים SA-מגנטי חדש (בדרך כלל 5 µL עבור 500 µL של supernatants).</li>
	<li>מערבבים היטב ובעדינות לסובב את microtube לאט לאט במשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע על ידי השאיפה לשחזר את בווה ואת ubiquitinated בווה מאוגד עם החרוזים SA-מגנטית.</li>
	<li>לשטוף פעמיים את החרוזים SA-מגנטית שנאספו עם 1 מ"ל של מאגר TNE על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 ° C. להשליך תגובת שיקוע בכל פעם על ידי שאיפה.</li>
	<li>להרתיח את החרוזים SA-מגנטית 1 x ג'ל מרחביות טעינת מאגר עבור 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס על חום-בלוק לפתור את החלבונים מטוהרת על-ידי החרוזים SA-מגנטית.</li>
	<li>Centrifuge את microtube 10 דקות ב 21, 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך microtube חדשים להסיר את השברים לא מסיסים.</li>
	<li>לנתח את החרוזים SA-מגנטית חייבים את החלבונים על ידי עמודים SD סטנדרטי, לא סופג-מערבי. השימוש של נוגדנים (אנטי-דגל נגד-multi-Ub, העכבר אנטי איג-HRP) ו הכימית (SA-HRP) הוא לפי היצרן &#39; פרוטוקול s ודמיינו ידי fluorography.</li>
</ol>

<ol><li>van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+ligands+for+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Providing ligands for MHC class I molecules.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).</li>
<li>Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+C+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).</li>
<li>McDevitt, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+the+role+of+the+major+histocompatibility+complex+in+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response.</a> Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Bedoui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+viral+and+self+antigens+by+skin-derived+CD103%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells.</a> Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).</li>
<li>Segura, E., Villadangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by dendritic cells in vivo.</a> Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).</li>
<li>Cheong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+stimulation+fully+differentiates+monocytes+to+DC-SIGN%2FCD209%28%2B%29+dendritic+cells+for+immune+T+cell+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas.</a> Cell. 143 (3), 416-429 (2010).</li>
<li>Henri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).</li>
<li>Shortman, K., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8%2B+dendritic+cell+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The CD8+ dendritic cell subset.</a> Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Nair-Gupta, P., Blander, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+view+of+the+intracellular+mechanisms+regulating+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation.</a> Front Immunol. , (2013).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Kurts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).</li>
<li>Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cross-presentation+of+exogenous+self-antigens+leads+to+deletion+of+autoreactive+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells.</a> J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).</li>
<li>Bonifaz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+protein+antigen+to+the+dendritic+cell+receptor+DEC-205+in+the+steady+state+leads+to+antigen+presentation+on+major+histocompatibility+complex+class+I+products+and+peripheral+CD8%2B+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance.</a> J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).</li>
<li>Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+in+viral+immunity+and+self-tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance.</a> Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).</li>
<li>Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+antigens+are+processed+through+the+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+%28ERAD%29+in+cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells.</a> Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).</li>
<li>Houde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+are+competent+organelles+for+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation.</a> Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).</li>
<li>Guermonprez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-phagosome+fusion+defines+an+MHC+class+I+cross-presentation+compartment+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells.</a> Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).</li>
<li>Lizée, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+cell+cross-presentation+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain.</a> Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).</li>
<li>Basha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD74-dependent+MHC+class+I+endolysosomal+cross-presentation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway.</a> Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).</li>
<li>Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity%2C+contradictions%2C+and+conundrums%3A+studying+post-proteasomal+proteolysis+in+HLA+class+I+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation.</a> Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).</li>
<li>Wiertz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec61-mediated+transfer+of+a+membrane+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+proteasome+for+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction.</a> Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).</li>
<li>Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+degradation+in+protein+quality+control+and+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).</li>
<li>Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-translocation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum+into+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).</li>
<li>Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+targeting+and+translocation+of+proteins+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).</li>
<li>Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein homeostasis.</a> IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+subcellular+compartment+in+which+exogenous+antigens+undergo+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells.</a> Heliyon. , (2016).</li>
<li>Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phagosome-to-cytosol+pathway+for+exogenous+antigens+presented+on+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules.</a> Science. 267 (5195), 243-246 (1995).</li>
<li>Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="https://www-sciencedirect-com.remotexs.ntu.edu.sg/science/article/pii/S1074761306004262">A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells.</a> Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).</li>
<li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li>
<li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li>
<li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקרים קודמים של CP, אנטיגנים אקסוגני incorporated שהצטברו באזור הסגור של אנדוזום מאוחר או מיון על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent16,30,31,32. ההערכה היא כי עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באזורים מיוחדים אלה של מיון או אנדוזום מאוחר, כמו תא הסלולר זוהה על ידי סוכרוז או iodixanol צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע באמצעות בווה ubiquitinated כמו סמן עיבוד עירד דמוי. לאחר גירוי שלהם מולדת חסינות, יעילות CP גדל באופן משמעותי, השבר שיא עבור בווה יחד עם ubiquitinated בווה היגרו לשבר צפיפות גבוהה יותר (שלנו שלא פורסמו תוצאות). המטרות של ניסויים אלה היו לזהות סמנים מולקולריים ספציפי עבור מיון או אנדוזום המנוח, אשר הועברו יחד עם בווה או ubiquitinated בווה. אבל בתוצאות, הן מולקולות תושב ER ומולקולות מאוחר אנדוזום תושב הועבר יחד עם בווה, ubiquitinated בווה, המציין כי ניסויים אלה היו כושלים ברור תא הסלולר להעברה כמו עירד ועיבוד ER קלאסית או אנדוזום מאוחר. בניסויים אלה, היו מולקולות ספציפיות לא התאים endocytotic למעט בווה או ubiquitinated בווה. עם זאת, בעוד אקסוגניים אנטיגן עברה עירד כמו תחבורה, מולקולות אלה חדרו קרום bilayer השומנים של חדר המיון דרך translocons, כגון Sec61 מורכבים (איור 1, דמות 2A). קרום דבק בווה נבחר כסמן של התאים endocytic, microsomes היו מטוהרת על-ידי beads מגנטי-SA (איור 2 א, 2 ב). באלה microsomes מטוהרים, בווה שהצטברו נתקלתי עירד דמוי ubiquitination ועיבוד תחת הנוכחות של RL ו- ATP במבחנה (איור 3A, 3B). כיוון RL מכיל את כל apparati cytosolic מולקולרית, כגון מולקולות הקשורות ubiquitination ו- proteasomes בנוסף מולקולות תרגום, תמלול, התוספת של RL מאפשר ubiquitination של בווה ב microsome מטוהרים. תוצאות אלה מציינים כי מטוהרים microsomes היו תאים סלולריים אובייקטיבית עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני, שניהם המכילה מולקולות ספציפיות אנדוזום ומולקולות שוכנת בחדר המיון באותו הזמן; Lamp1 הראה קודמן וטפסים בוגר microsome מטוהרים.
פרוטוקול זה הוא תלוי כמות חודר ממברנה אנטיגנים אקסוגני; חשוב לשלב מספיק של אנטיגנים אקסוגני לתאים DC2.4, שמציג יכולת גבוהה לשלב אנטיגנים אקסוגני במדינה confluent למחצה. מתארך זמן הדגירה 6-12 h עבור DC2.4 עם בווה מגדילה את כמות בווה incorporated. התוספת של מעכבי proteasomes, MG132 או lactacystin, במתינות מגדילה את כמויות microsomes מטוהרים. הכנת microsome הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר עבור פרוטוקול זה. בווה חינם, אשר היא אינה מעוגנת לתוך תאים DC2.4, יש להסיר על ידי שטיפת התאים עם PBS, כדי למנוע שאינם ספציפיים עקידת בווה חינם השבר microsome. כדי לצמצם את הנזקים על קרום התאים, התאים הם מובסים בקפידה מהמגן דאונס במי קרח. ואז תאים רצופה, גרעינים הוסרו על ידי צנטריפוגה כפי microsomes הוכנו מן השבר כור גרעיני. לאחר הכנת microsomes, מתבצע טיהור בשלב אחד על ידי חרוזים SA-מגנטית. בשלב זה, רחיצת בזהירות microsome מגנט מאוגד יש צורך להסיר את הכריכה לא ספציפית של תאים סלולריים אחרים, ולא לאבד את microsome מאוגדים באופן ספציפי.
בשיטה זו טיהור צעד אחד, נדרש אחוז משמעותי של microsome המטרה. אם היחס בין microsome אובייקטיבית הוא קטן מדי, כמות היעד מטוהרים microsome מקטין על ידי תחרות עם איגוד שאינם ספציפיים של תאים סלולריים אחרים. כתוצאה מכך, בתנאים האלה, את enrichments של microsome המטרה, את הסיווג של microsome שאינם ספציפיים יהיה צורך. אפשרי גם להציג צעדים נוספים לפני טיהור מאת החרוזים SA-מגנטית. צעד כזה הוא סוכרוז או iodixanol צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה של microsome. מאז microsomes מוכן להכיל כל המוצרים ממברנה, זה יכול להיות אפשרי להעשיר את microsome היעד לפני SA-מגנטית טיהור חרוזים על-ידי בחירת אנטיגן שברים עשיר לטיהור צעד אפשרי נוסף הוא סיווג מראש של microsome על ידי שליטה-מגנטית חרוזים בלי SA, כדי להפחית את אגודות שאינם ספציפיים רקע microsomes נגד beads מגנטי-SA. בניסויים אלה, שני צעדים משופרת על טוהר microsome היעד ביעילות, אך פחתה הסכום הכולל של מוצרים מטוהרים, המציין שאלה צעדים נוספים נבחרו כאמצעי לניסויים נוספים.
ידוע שצנטריפוגה במהירות גבוהה זה הוכח לגרום היתוך או קרישה של שלפוחית תאיים. אלה fusions או clottings תפיק microsomes מלאכותי, אשר נגזרות שאינם ספציפיים האינטראקציה בין סוגים שונים של אברון-derived שלפוחית. Microsomes מלאכותיים אלה מכילים סטטיסטית בכל מולקולה ממברנה כגון מולקולה תושב מיטוכונדריאלי, מולקולה תושב גולג'י, ועוד. Microsomes מטוהרים הללו לא כללו caveosome תושב חלבונים, חלבונים תושב גולג'י, או חלבונים תושב אנדוזום מוקדם, כגון caveolin1, GM130, EEA1, המציין כי microsomes SA-לטהר אינם מוצרים מלאכותיים נגזר המיזוג בין סוגים שונים של שלפוחית. ללא צנטריפוגה במהירות גבוהה, שלפוחית. לאונרד-בווה היו מבודדים, אבל הניסויים שליטה של שלפוחית ללא בווה הראתה כמויות גבוהות יותר של מולקולות שאינם ספציפיים. אפשרות זו מציינת כי שיטה ראשונית זו היא די לניסויים רצופים, כי הצעד צנטריפוגה מהירה הכרחי עבור פרוטוקול זה טיהור.
פרוטוקול זה חל על סוגי תאים אחרים, כגון קבוצות משנה DC שונה או אחרים נגמ שים. . זה גם ניתן להשתמש סוגים שונים של אנטיגנים אקסוגני במצבים שונים, כגון חלבונים פלורסנט, קומפלקס אנטיגן-נוגדן, חרוזים מאוגד אנטיגנים, וכו '. יתר על כן, אנו יכולים לטהר microsomes היעד באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד אנטיגנים אקסוגני. למרות מספר פעולות נוספות או שינויים, ייתכן שיהיה צורך להחיל לפרוטוקול זה על תאים ו אנטיגנים אחרים, זה יכול להבהיר את המנגנונים המולקולריים של המוצב פרוטאוזום תלוית על-ידי השוואת מולקולות מטוהרים בין ניסויים שונים. כך, הפרוטוקול המתואר יש חדר שינוי ושיפור.

MHC אני מולקולות באים לידי ביטוי על פני השטח של כל התאים nucleated, עם פפטידים קצרים antigenic נגזר אנטיגנים אנדוגני, אשר מעובדות על-ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום ציטוזול1. לאחר עיבוד, פפטידים antigenic מועברים לתוך לומן (ER) רשתית תוך-פלזמית על ידי פפטיד לגבי המעלית מהברז. ב- ER לומן, סדרה של משגיחים ספציפית לסייע ההעמסה פפטיד, הנכון קיפול של MHC אני מורכבים. סדרה זו של מולקולות נקרא המתחם פפטיד העמסה (PLC), המציינת כי המיון תא מרכזי בשביל פפטיד מעמיסים על MHC אני2. לאחר טעינה, פפטיד MHC אני מולקולות מועברים אל פני השטח של התא, לשחק את תפקיד מרכזי במערכת החיסונית מסתגלת כמו סמני עצמית, ומאפשר CD8+ לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (Ctl) כדי לזהות תאים סרטניים או מדבקים לפי antigenic פפטידים-עצמי חלבונים3.
פפטידים antigenic מ אקסוגני אנטיגנים אנטיגן הצגת תאים (APC), הם גם מוצג בעת MHC אני4,5,6,7,8 דרך CP, אשר מתבצע בעיקר ליד DCs9,10,11. CP חיוני הן עבור הפעלת תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים לתוך אנטי-זיהומית, anti-tumoral Ctl12,13, של קיום רגישות המערכת החיסונית על-ידי inactivating של בפועל עצמית תמים T תאים14,15. החפ ק ממלא תפקידים חשובים רבים במערכת החיסון מסתגלת, אולם טרם ניתן לתאר בפירוט המנגנונים המולקולריים של CP. מחקרים קודמים של CP חשף כי אנטיגנים אקסוגני נרשמו נקודתית הן המיון והן את אנדוזום, שעובדו על-ידי עירד, רומז כי אנטיגנים אקסוגני מועברים מ אנדוזום לחדר המיון עבור עירד כמו עיבוד ופפטיד טעינת16 . עם זאת, ראיות המצטבר עולה הטעינה פפטיד של CP מתבצעת לא בחדר המיון, אלא דווקא בקלאסי מדורים endocytic, יש גם את התכונות המיוחדות של ה ER (איור 1)17,18 ,19,20,21. כדי למנוע השפלה של סימנים מקדימים פפטיד antigenic על ידי פעילות גבוהה של aminopeptidase22 ציטוזול, עיבוד, פפטיד טעינה ב CP מתרחשת באזור הפרוקסימלית של אלה תאים endocytic-קלאסי (איור 1). למרות אפיוני של תאים endocytic אלה שנויים במחלוקת, יש אין מולקולות ספציפיות קיים מלבד אנטיגנים אקסוגני במחלקה הזו.
עירד הוא מסלול סלולרי, אשר במיוחד מסיר חלבונים misfolded מחדר המיון. ב מסלול עירד, חלבונים misfolded retrogradely מועבר דרך קרום אר אל הציטופלסמה, שעובדו על-ידי24,2523,מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כאשר מולקולות גדולות, כגון חלבונים, מועברים דרך ליפידית, מולקולות אלה עוברים דרך מנגנון מולקולרי הנקרא translocon, כגון Sec61 מתחם, מתחם מיון26, ו טום מורכבים Derlin וטים מתחם המיטוכונדריה27. כאשר exogenously-נוסף אנטיגנים מועברים דרך קרום בחדר המיון, הם חייבים לחדור ליפידית במתחם עם translocons, כגון המתחם Sec61. השיטה המתוארת כאן לטהר את שלפוחית ממוקד על ידי ניצול מולקולות אלה חודר ממברנה כסמני עבור התאים endocytic.
השיטה המתוארת כאן הוא פרוטוקול טיהור שלפוחית חדשה באמצעות את התא DC דמוי קו DC2.428 , biotinylated אובלבומין (בווה) כמו אנטיגן אקסוגני. התאים endocytic היו מטוהרת על-ידי streptavidin (SA)-beads מגנטי באמצעות את בווה חודר קרום כמו מכונת. זה מטוהרים microsome, כמה exogenously נוספו בווה השתמר עדיין בחלקים ממברנה אבל היו מועברים אל מחוץ microsome ולאחר מכן ubiquitinated ומעובדים במבחנה29. זה microsome מטוהרים הכיל לא רק חלבונים ספציפיים תא endocytic, אלא גם חלבוני ER-תושב עירד, את פפטיד טעינת מורכבים; רומז תא הסלולר הוא תא endocytic פוטנציאליים עבור CP29. פרוטוקול זה אינו תלוי הסוג של אנטיגנים אקסוגני, והוא גם ישימים עבור קבוצות משנה אחרים DC וסוגי תאים אחרים, כגון מקרופאגים, תאי B ותאי אנדותל, כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי מדויק של בקרי קבוצת מחשבים CP שגורה.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>gibco by life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids</td><td>gibco by life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>gibco by life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>gibco by life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penisicillin-Sreptomycin</td><td>gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco by life technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-protein labelling kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>lactacystin</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor cocktails</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>iodixanol</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-magnetic beads</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>control magnetic beads</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>silver staining kits</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Reticulocyte Lysate</td><td>Promega</td><td>1730714</td><td></td></tr><tr><td>Flag-tagged ubiquitin</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>anti-ovalbumin (OVA,mouse)</td><td>Antibody Shop</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>ant-multi-ubiquitin (mouse)</td><td>MBL</td><td>D058&amp;minus;3</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag (mouse)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of the membrane compartment for endoplasmic reticulum-associated degradation of exogenous antigens in cross-presentation

תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים מאוד עיבוד והצגת אנטיגנים אקסוגני למביטה על מחלקה histocompatibility הגדולות (MHC) אני מולקולות הידוע גם בשם צלב-מצגת (CP). CP ממלא תפקיד חשוב לא רק על הגירוי של תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים עבור זיהומיות וחסינות הגידול אלא גם ב איון של self-acting תמים T תאים על-ידי anergy תא T או מחיקה תא T. למרות המנגנון המולקולרי קריטי של CP נשאר כדי להיות הובהר, ראיות המצטבר מעיד כי אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באמצעות רשתית תוך-פלזמית-הקשורים השפלה (עירד) לאחר הייצוא מקלאסי endocytic תאים. עד לאחרונה, אפיוני של תאים endocytic אלה היו מוגבלים כי היו אין סמנים מולקולריים ספציפי חוץ אנטיגנים אקסוגני. השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, אשר מאפשר ולטיהור אלה תאים endocytic. משתמש זה מטוהרים microsome, אנחנו מחדש את עירד כמו תחבורה, ubiquitination, עיבוד של ה אנטיגן אקסוגני במבחנה, רומז כי המערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום מעובד אנטיגן אקסוגני לאחר ייצוא מזה תא הסלולר. פרוטוקול זה יכול להחיל עוד יותר על סוגי תאים אחרים כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי של CP.

התירי את המנגנון המולקולרי של CP, יש צורך לזהות את התאים הסלולר, איפה אנטיגנים אקסוגני עוברים עירד כמו תחבורה, עיבוד. בעוד תצפיות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescent או באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מזוהה תא הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני שנצבר16,17,18,19, 30,31,32,33, התאים הסלולר עירד כמו עיבוד של אנטיגנים אקסוגני אינם מוגדרים בבירור. לאחרונה זה הראו כי endosomes-קלאסי עם מולקולות תושב בחדר המיון היו אחראים על CP34, אבל אלה תאים סלולריים היו ולזרימה. הקושי לבודד וטיהור התאים הסלולר ניתן לייחס לעובדה אנטיגנים אקסוגני מותאמים הן אנדוזום, כמו מיון תאי וכי אין מולקולה מזהים עבור אלה תאים endocytic אחרים מאשר אנטיגנים אקסוגני. עם זאת, התנאי של אנטיגנים אקסוגני שעברו עירד כמו תחבורה שונה ממצב למצב יציב; במעבר על פני הממברנה ריאקציה דו-מולקולרית השומנים, אנטיגנים אקסוגני לחדור את הקרום ויה translocons, כגון Sec61 (איור 2 א). לפיכך, בעת שימוש בווה כמו אנטיגן אקסוגני, בווה אמור להיות משויך Sec61. מאז בווה ממברנה-הקשורים מאוגדים באופן ספציפי עם SA, microsome המוכן DC2.4, אשר היה pretreated עם בווה, יכול להיות מבודדת לגמרי על ידי beads מגנטי-SA (איור 2 א). ואז כמויות שוות ערך של חלבונים מן מטוהרים microsomes עם או בלי קדם דגירה של בווה שנפתרו על ידי מרחביות-דף ואחריו צביעת כסף, סופג המערבי עם SA-HRP (איור 2B, ג 2). כפי שמוצג באיור 2B , איור 2C, microsomes מבודדים הכיל מספר חלבונים ייחודיים היו מטוהרים תלויה בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. בנוסף חלבונים ייחודיים אלה, microsomes מבודדים הכיל גם חלבונים ספציפי, אשר קשורה beads מגנטי-SA עם או בלי בווה. טיפול microsome עם טריפסין לפני טיהור על-ידי המגנט מנעה הטיהור של microsomes (איור דו-ממדי), המציין את שיטות טיהור תלויים הנוכחות של קרום חודר בווה.
Microsomes מטוהרים הראה היכולת ubiquitinate ה בווה incorporated במבחנה, תחת הנוכחות של RLs (איור 3 א). כמויות בווה, בווה פולי-ubiquitinated היו augmented בנוכחות MG132 (איור 3B), המציין בווה incorporated היה מעובד על ידי מערכת עירד שלנו microsomes מטוהרים הכיל עירד מכונות חלבונים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55949/55949fig1.jpg"> 
איור 1: מסלולים תאיים על CP in DCs- ב- Dc, אנטיגנים אקסוגני מועברים לתוך מדורים endocytic-קלאסי, גם מכילים מולקולות אר-תושב בנוסף מולקולות של אנדוזום מאוחר קלאסית. במחלקה הזו, אנטיגנים אקסוגני מיוצאים לתוך ציטוזול דרך translocons כגון Sec61. ב ציטוזול, מעובדים אנטיגנים אקסוגני על ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום לתוך פפטידים antigenic בשם דיאלקטריים עירד. פפטידים antigenic מובלים אל תוך תאי endocytic-קלאסי זהה או סמוכים, או ER סמוכים דרך המעלית מהברז והעמיסו מכן על MHC אני מולקולות על ידי בקר לוגי מיתכנת. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55949/55949fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55949/55949fig2.jpg"> 
איור 2: טיהור של Microsomes עם בווה עירד שעברו. (א) א דגם סכימטי של טיהור של microsomes עם בווה שעברו עירד. בווה מזוהה עם הקרום דרך translocon Sec61, ממוקד עם חרוזים SA-מגנטית. Microsomes (B) עם (+) או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה היו מטוהרים (+) עם או בלי חרוזים SA-מגנטית (-). חלבונים (2 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים שנפתרו בדף-7.5-15% מרחביות, צביעת כסף שימש כדי להמחיש להקות חלבון. משולשים בצד ימין מציינים חלבונים ספציפי מחייב את החרוזים SA-מגנטית. משולשים עם כוכביות מציינים חלבונים ייחודיים נמצאו רק בנוכחות בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. החץ מראה בווה. (ג) Microsomes (+) עם או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה היו מטוהרים (+) עם או בלי חרוזים SA-מגנטית (-). חלבונים (10 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים היו נפתרה בדף-7.5-15% מרחביות, שעבר Western סופג עם SA-HRP. P.N.: שבר כור גרעיני. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. (ד) Microsomes עם תוספת מוקדמת של בווה היו טהור עם חרוזים SA-מגנטית. Microsomes שטופלו (+) או בלי טריפסין (-) ו- TX-100 לפני טיהור (שמאל שני נתיבים) או לאחר טיהור (נכון בשני נתיבים). חלבונים (2 µg) או אמצעי אחסון המתאים של חלבונים מטוהרים שנפתרו בדף-7.5-15% מרחביות, צביעת כסף שימש כדי להמחיש להקות חלבון. משולשים בצד ימין מציינים חלבונים ספציפי מחייב את החרוזים SA-מגנטית. משולשים עם כוכביות מציינים חלבונים ייחודיים נמצאו רק בנוכחות בווה הוסיף exogenously וחרוזים SA-מגנטית. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. הודפס מחדש באישור מ הפניה28. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55949/55949fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55949/55949fig3.jpg"> 
איור 3: במבחנה הכינון של עיבוד, Ubiquitination באמצעות ביצית Microsomes טהור. Microsomes (א) Purified עם (+) או בלי (-) תוספת מוקדמת של בווה שטופלו (+) או בלי (-) RL, דגל-Ub עבור 1 h, היו solubilized באמצעות TNE. בווה היה טהור עם חרוזים SA-מגנטית, שעבר Western סופג עם נוגדנים המצוין. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. (B) Purified microsomes שטופלו (+) או בלי (-) RL הדגל-Ub, MG132 עבור 1 h, היו אז solubilized באמצעות TNE. בווה היה טהור עם חרוזים SA-מגנטית, נתון סופג המערבי עם SA-דגל. כוכביות הנכון מצביעים לא ספציפית להקות עם SA-HRP. תוצאות שוות ערך פיקחו על ידי לפחות שלושה מבחני עצמאית. הודפס מחדש עם permission מ הפניה28. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55949/55949fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation at JoVE.com

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Views.  Takasaki University of Health and Welfare. השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.

Video: Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a large extracellular domain and a short cytosolic domain termed the APP intracellular domain (AICD). During maturation through the secretory pathway, APP can be cleaved by proteases termed &alpha;, &beta;, and &gamma;-secretases1. Sequential proteolytic cleavage of APP with &beta; and &gamma;-secretases leads to the production of a small proteolytic peptide, termed A&beta;, which is amyloidogenic and the core constituent of senile plaques. The AICD is also liberated from the membrane after secretase processing, and through interactions with Fe65 and Tip60, can translocate to the nucleus to participate in transcription regulation of multiple target genes2,3. Protein-protein interactions involving the AICD may affect trafficking, processing, and cellular functions of holo-APP and its C-terminal fragments. We have recently shown that AICD can aggregate in vitro, and this process is inhibited by the AD-implicated molecular chaperone ubiquilin-14. Consistent with these findings, the AICD has exposed hydrophobic domains and is intrinsically disordered in vitro5,6, however it obtains stable secondary structure when bound to Fe657. We have proposed that ubiquilin-1 prevents inappropriate inter- and intramolecular interactions of AICD, preventing aggregation in vitro and in intact cells4. While most studies focus on the role of APP in the pathogenesis of AD, the role of AICD in this process is not clear. Expression of AICD has been shown to induce apoptosis8, to modulate signaling pathways9, and to regulate calcium signaling10. Over-expression of AICD and Fe65 in a transgenic mouse model induces Alzheimer's like pathology11, and recently AICD has been detected in brain lysates by western blotting when using appropriate antigen retrieval techniques12. To facilitate structural, biochemical, and biophysical studies of the AICD, we have developed a procedure to produce recombinantly large amounts of highly pure AICD protein. We further describe a method for inducing the in vitro thermal aggregation of AICD and analysis by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical, biophysical, and structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on AICD aggregation.

A method for large-scale purification of the APP intracellular domain (AICD) is described. We also describe methodology to induce in vitro AICD aggregation and visualization by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical/structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on its aggregation.

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Medicine

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic cues. Their membranes are often juxtaposed at defined contact sites, which become hubs for the exchange of signaling molecules and membrane components1,2,3,4. The inter-organellar membrane microdomains that are formed between the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria at the opening of the IP3-sensitive Ca2+ channel are known as the mitochondria associated-ER membranes or MAMs4,5,6. The protein/lipid composition and biochemical properties of these membrane contact sites have been extensively studied particularly in relation to their role in regulating intracellular Ca2+ 4,5,6. The ER serves as the primary store of intracellular Ca2+, and in this capacity regulates a myriad of cellular processes downstream of Ca2+ signaling, including post-translational protein folding and protein maturation7. Mitochondria, on the other hand, maintain Ca2+ homeostasis, by buffering cytosolic Ca2+ concentration thereby preventing the initiation of apoptotic pathways downstream of Ca2+ unbalance4,8. The dynamic nature of the MAMs makes them ideal sites to dissect basic cellular mechanisms, including Ca2+ signaling and regulation of mitochondrial Ca2+ concentration, lipid biosynthesis and transport, energy metabolism and cell survival 4,9,10,11,12. Several protocols have been described for the purification of these microdomains from liver tissue and cultured cells13,14. 
	Taking previously published methods into account, we have adapted a protocol for the isolation of mitochondria and MAMs from the adult mouse brain. To this procedure we have added an extra purification step, namely a Triton X100 extraction, which enables the isolation of the glycosphingolipid enriched microdomain (GEM) fraction of the MAMs. These GEM preparations share several protein components with caveolae and lipid rafts, derived from the plasma membrane or other intracellular membranes, and are proposed to function as gathering points for the clustering of receptor proteins and for protein&#x2013;protein interactions4,15.

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

This procedure illustrates how to isolate from the adult mouse brain the mitochondria-associated ER membranes or MAMs and the glycosphingolipid-enriched microdomain fractions from MAMs and mitochondrial preparations.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Neuroscience

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Biochemistry

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Bioengineering

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific physicochemical conditions during purification to obtain them with high purity and structural quality and in a catalytically active form. The disaccharide trehalose is a compatible solute that is synthesized and accumulated in high concentrations in the yeast cytoplasm to stabilize the membranes and proteins. The use of trehalose as an additive in the protocol for the purification of plasma membrane H+-ATPase results in a high-quality preparation, the hexameric structure of which is shown by biochemical analytical methods. Trehalose can, therefore, be used as a stabilizing additive for the purification of membrane proteins (P-ATPases). This protocol describes the modification of the classical protocol for SERCA purification by subjecting SERCA to centrifugation on a trehalose concentration gradient. The inclusion of this carbohydrate led to the purification of SERCA in a catalytically active form with high purity and, importantly, in a stable form. Partial biochemical characterization of the purified SERCA (SDS-PAGE, enzyme kinetics, FITC labeling, circular dichroism spectroscopy) showed that the enzyme is suitable for functional and structural studies. The use of trehalose in the purification protocol of P-type ATPases and other labile membrane (and cytosolic) proteins is suggested.

This protocol describes an improved SERCA purification method, which includes the disaccharide trehalose in the final centrifugation step. This carbohydrate stabilizes proteins under harsh conditions. The purified SERCA was catalytically active and displayed high purity, making it suitable for structural and functional studies.

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca2+-ATPase משריר הארנב

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Biology

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

The Endoplasmic Reticulum

The endoplasmic reticulum or ER makes up for more than half of the membranes in a cell and accounts for 10% of total cell volume. It is also the primary protein and lipid synthesis factory for most cell organelles, such as the Golgi apparatus, lysosomes, secretory vesicles, and the plasma membrane. Despite being the most extensive and functionally complex subcellular organelle, ER was the last to be discovered. After years of deliberation, Keith Porter and George Palade in the year 1954, produced the first high-resolution electron microscope images to affirm the presence of ER in the eukaryotic cell.
The ER membranes were identified as sites for protein synthesis and crucial for intracellular transport using radio-labeled and fluorescent-labeled amino acids. The isolation of ER is a tricky task as it forms an intricate mesh with other subcellular organelles. However, on cell homogenization, the disrupted ER membranes reseal into small closed vesicles called microsomes. These vesicles form a microsystem capable of sustaining all ER-related functions like protein and lipid synthesis, calcium signaling, and glycosylation. Subcellular fractionation is the best and often-used technique for the purification of these membranes. When separating using a sucrose gradient, the rough ER microsomes sediments at a higher density than smooth ER microsomes.
The ER network in a cell is dynamic. It is constantly shape-shifting along with the cytoskeleton to bolster mechanical support for the cell structure. Despite the distinct cisternae and tubule morphologies of the ER membrane, interconversion between the two is possible and is governed by the expression of membrane proteins. The ER network rearranges by tubule growth, retraction, and fusion of adjacent ER-ER membranes.
As mentioned above, the ER network is required for optimal overall cellular health. Disruption of ER morphology is linked to pathological conditions, including neurological disorders like Alzheimer&#39;s disease, hereditary spastic paraplegia, and viral infections like hepatitis C virus, and dengue virus.

הרשתית האנדופלסמית

The endoplasmic reticulum or ER makes up for more than half of the membranes in a cell and accounts for 10% of total cell volume. It is also the primary ...

Education

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

KEY TERMS AND CONCEPTS

ER Retrieval Pathway

In the secretory pathway, vesicles transport proteins from one cellular compartment to another in forward transport to deliver the protein to its correct location. Occasionally, misfolded proteins and incorrect proteins escape their original compartments, and a retrieval pathway is used to return the escaped proteins to their original compartment.
The ER uses many checkpoints to prevent the entry of incorrectly folded or a resident protein as cargo onto a transport vesicle. These mechanisms include cargo selectivity of the receptors, aggregation of functionally similar proteins, and retention sequences on resident proteins.
Biochemical studies characterizing the cargo-sorting receptors have shown that they are ligand-specific and bind only at specific pH (pH 5.0 in yeast and mammals). Functionally similar ER-resident can proteins aggregate to form large complexes that cannot be loaded onto transport vesicles, thus avoiding the accidental escape of these proteins from the organelle. Additionally, the membrane-spanning domain of several ER and Golgi proteins contain a retention sequence that marks these proteins for staying back in the ER, so receptors do not bind them.
If an ER-resident protein escapes these checkpoints and gets loaded onto a Golgi-bound vesicle, a specific amino acid sequence called a retrieval signal helps the protein get recognized and transported back to the ER. The receptors involved in retrieval mechanisms recognize the retrieval signals at the carboxyl terminus of soluble proteins of the ER and in the cytoplasmic domain of some ER and Golgi membrane proteins. The receptors selectively capture such proteins and package them in vesicles that transport them back to the ER.
Two well-characterized retrieval signals are the carboxy-terminal tetrapeptide KDEL and KKXX found in many ER lumen resident proteins. BiP, a molecular chaperone, plays a vital role in preventing the aggregation of misfolded proteins. Interaction between BiP and unfolded proteins is mediated by a substrate-binding domain and a nucleotide-binding domain for ATPase activity. KDEL receptor in the post-ER compartments such as ERGIC and Golgi binds with the carboxyl-terminal retrieval signal of BiP and returns BiP to the ER via COPI vesicles.

מסלול אחזור ER

In the secretory pathway, vesicles transport proteins from one cellular compartment to another in forward transport to deliver the protein to its correct ...

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

Summary

Explore More Videos