ברשתית האנטופלסמית יש תחום צינורי דינמי אשר מקיים אינטראקציה רציפה עם הציטוסקלטון ועובר תנועה וסידור מחדש קבועים. האופן שבו ה-ER מייצר ומתחזק את הארגון הזה עדיין לא מובן במלואו. כאן אנו מציגים עניין נוח כדי ליצור מודל organelle מבני מלמטה למעלה עבור חדר הER, אשר מורכב מערכת קרום ללא חלבון נתמך מוצק שניתן להעביר לרשתות חלקיקים שומנים מורכבים.
הידרופיליה היא תרכובת אורגנית לאנרגיה. טיהור חלבונים ומיצוי חלבונים אינם נדרשים. הרכיבים החיוניים היחידים הם המצע המוצק והפוספוליפידים המספקים את מודל ה- ER הבסיסי ביותר.
העבר את פתרונות השומנים המומסים לתוך בקבוקון בצורת אגס הפוך 10 מיליליטר מוסיף עד כמות כוללת של 3, 000 מיקרוגרם של שומנים ו 300 microliters של כלורופורם. לאחר מכן לחבר את הבקבוק לאידוי סיבובי ולמקם אותו עם הטיה של 45 מעלות. סובב את הבקבוק ב 24 סל"ד בתוך אמבט מים ב 23 מעלות צלזיוס במשך שש שעות עם לחץ אוויר מופחת לאט לחלוטין להסיר את הכלורופורם.
התחל להפחית את הלחץ מיד לאחר ייזום הסיבוב על ידי צעדים של 20 קילופסקלים כל שתי דקות עד הלחץ מגיע 20 קילופסקלים. לאחר שש שעות, לעצור את הסיבוב ולהגדיל את לחץ האוויר שוב בהדרגה על ידי צעדים של 20 kilopascals כל שתי דקות עד להגיע 100 קילופסקלים. הסר את הבקבוק מן האידוי הסיבובי ולהוסיף שלושה מיליליטר של PBS ו 30 microliters של גליצרול.
מערבבים בעדינות את הבקבוק כדי להמיס את הגליצרול. השתמש פקק זכוכית אוויר הדוק כדי לאטום את הבקבוק המכיל את השומנים. לאחסן את הבקבוק במקרר בארבע מעלות צלזיוס לילה עבור התייבשות ונפיחות של סרטי השומנים.
ביום שלמחר, sonicate השומנים עם אמבט מים קולי בטמפרטורת החדר ובתדירות 35 קילוהרץ עד להשגת השעיית שומנים אחידה מעט turbid. Sonication יכול לקחת בערך 10 עד 30 שניות. sonication ממושך מייצר חום והוא מזיק היווצרות דם.
שלבים אלה מניבים השעיה המכילה שני סוגים של מבנים לכלי רכב. זיקים רב-לאלמלריים וזיקים יונימלריים ענקיים. לאחסון, מחלקים את מתלי השומנים ל-100 מיליקוטים מיקרוליטרים באמצעות סך של 30 צינורות מיקרוצנטריפוגה.
לאחסן את aliquots במקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס. הקפאת פלאש עם חנקן נוזלי אינה הכרחית. להפשיר את ההשעיה השומנים ולהעביר טיפת ארבעה microliter של השעיה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה או להחליק כיסוי.
לאחר 20 דקות של ייעוד, טיפה יתמוטט לתוך סרט עגול שטוח של שומנים אשר גלוי לעין. Rehydrate סרט השומנים עם מיליליטר אחד של חיץ HEPES במשך 3 דקות. הכן את תא התצפית עם חלק עליון פתוח כדי לאפשר החלפת מאגר באמצעות פיפטה אוטומטית, הנדרשת ליזום את המרת חדר הER כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
לאחר הסרת לוח PDMS נרפא עם מרית, להשתמש באזמל לחתוך את המסגרת לתוך הממדים ואת הגיאומטריה המתאימה לפתיחה הזמינה בשלב מיקרוסקופ. מידות של 1.5 על 1.5 על 0.5 ס"מ מתאימות לרוב ההתקנות. להביא את הצד החלק של מסגרת PDMS במגע עם הצד הפעיל של פני השטח שבו הסרט תחמוצת אלומיניום שוכן בעדינות להפעיל לחץ כדי לדחוף את המסגרת ואת פני השטח אחד נגד השני כדי לגרום להם לדבוק.
ממלאים מיד את תא התצפית במאגר סידן HEPES. אין למלא את כל נפח התא כדי לאפשר תוספת של שומנים מיובשים בשלב הבא. מניחים את התא על שלב המיקרוסקופ הקונפוקל.
העבר את חומר השומנים rehydrated, עכשיו השעיה המכילה וריונים ענקיים, לתוך התא עם פיפטה מרעה פלסטיק. המתן 10 עד 20 דקות כדי לאפשר לווסיקלים לדבוק במצע ולהתפשט על פני השטח. ההתפשטות מתחילה מיד לאחר התצהיר של שומנים על פני השטח.
לפני השומנים מתפשט המבנה חילופי החיץ חייב להיעשות בעדינות ככל האפשר הסרה מהירה או תוספת מהירה של החיץ מפריע מבני השומנים על פני השטח. לאחר התבוננות כפולות שומנים מרובים, לאט להסיר את מאגר הסביבה באמצעות פיפטה אוטומטית. כך שרק סרט חיץ דק נשאר בתחתית.
יש לדאוג כדי למנוע הסרה מהירה. המשך להחלפת מאגר הסביבה על-ידי מילוי איטי של תא התצפית במאגר HEPES של כלטור באמצעות פיפטה אוטומטית. הימנע תוספת פתאומית.
השלב האחרון מניב רשתות ננו-טבולריות דינמיות שנוצרו כתוצאה מהתהוות והנסיגה המושרה של ה- DLBM לווסיקלים הרב-לאלמלריים. המוצגים להלן מיקרוגרפים של רשתות הננו-צינוריות שהושגו בפרוטוקול. בתמונה זו, האזורים האדומים הבהירים הרציף הם השבר הנשלף של ה- DLBM, המסומן בקו מקווקו כחול.
מוצג כאן, הוא מיקרוגרף של רשת צינורית כי כבר הפוך כדי להגדיל את הניגודיות. כאן, הפחתת צפיפות הצינור מוצגת על אזור קרום במהלך שלוש שעות ו -20 דקות. הירידה בצפיפות הצינורית מתרחשת עקב תיחוי הדרגתי ואחריו נסיגה של DLBM מפני השטח.
מיקומים של נקודות הצמדה מתווכות סידן ניתן ליצור כנקודות שבהן צינורות יש פניות מסוף או חדה. פניות חדות נקראות צמתים v או נקודות מפנה בגלל השינוי הפתאומי בכיוון יישור הצינורות. נקודת הסיום מייצגת את הסיום של הצינור המונע מהצינור לסגת.
אם ההתפשטות נמשכת לתקופות ממושכות, מתח הממברנה עולה ומוביל לקרע. מאז השומנים מסומנים באופן פלואורסצנטי, ה קרע ניתן לראות ישירות. אינדיקטור מרכזי לקרע הוא הירידה המשמעותית בעוצמת הפלואורסצנטיות באזור הקרוע.
התייבשות מוחלטת של המדגם או החלפה מהירה של מאגרים גורמת להפרעה, קרע או עיוות של המדבקות. המורכבות של המודל ניתן לבנות על ידי הוספת רכיבים הקשורים ER כגון חלבוני השומנים. מודל זה יכול גם להיות מרומז ללמוד הרכבה עצמית, nanofluidics, זרימת מרנגוני, ותופעות תחבורה.
כלורופורם הוא רעיל ותנודתי מאוד זה תמיד צריך להיות מטופל תחת מכסה המנוע אדים עם ציוד מגן אישי הקשורים כולל כפפות מעבדה אצטט פוליוויניל, חלוק מעבדה, ומשקפי בטיחות.
