למחברים אין תודות.

הטיפול והטיפול בבעלי חיים בהליך זה בוצעו על פי הנחיות הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש באוניברסיטת קולורדו. 1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ואחסן את כל הפתרונות בטמפרטורות המתאימות, כפי שמוצג בטבלה 1 . </li></ol> 2. ציפוי בארות ושקופיות הערה: נוירונים לא לדבוק היטב פלסטיק או משטחי זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני הבידוד של הנוירונים, מעיל את הבארות של צלחת 24 תרבות סטרילית עם 0.5 מ&quot;ל של פולי-D- ליזין (PDL, טבלה 2 ) ולהשאיר אותו ברדס זרימה למינרית O / N. הערה: השיטה המועדפת היא להשתמש 24-גם צלחות מעיל רק בארות מרכז, כמו אידוי מן בארות הפריפריה נוטה להיות מואצת יותר ולהוביל לתוצאות עקבי. בנוסף, זכוכית שקופיות ניתן להציב את הבארות לפני לאO ציפוי. הנוירונים יצרפו את השקופיות זכוכית מצופה ניתן להסיר מאוחר יותר עבור הדמיה מיקרוסקופית נוספת . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של בידוד, להסיר את PDL מן הבארות. לשטוף עם מים סטריליים במשך כמה דקות לפני הסרת כל המים הנותרים ומאפשר להתייבש במשך שעה 1 (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש, מעיל את השקופיות עם laminin ( טבלה 2 ). הערה: כ 10 μL של laminin (10 מיקרוגרם / μL) מספיק כדי מעיל כל טוב של צלחת סטרילית 24 גם. זה מעורבב עם μL 340 בינוני (נפח כולל: 350 μL) על מנת לכסות את כל טוב. תן זה לשבת על 2 שעות ב RT ברדס תרבות ולאחר מכן לשאוב לפני ציפוי התאים. </li></ol> 3. קצירת חוט השדרה הערה: כל המכשירים צריכים להיות autoclaved (135 ° C ו 30 psi עבור מחזורי 4 x 7 דקות) עבור סטריליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 1-3 יום בן C57BL / 6 גורים העכבר בחדר עם isoflurane. לַחֲכוֹת30 s לאחר הפסקת התנועה וקמצוץ את הרגל כדי לאשר חוסר תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את הראש מן הגוף באמצעות מספריים, עם גור במצב נוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את הרגליים האחוריות או זנב וזרועות על השולחן ההליך, עם הצד הגב מול המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור באמצעות מספריים איריס מעוקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חוט השדרה מן האזור המותני רק מעל הירכיים ולהמשיך לחתוך את שני הצדדים של בית החזה להפריד אותו מהגוף. הערה: זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מאיברים הקרביים, כדי למנוע נזק מכוון לאיברים אחרים ( איור 1 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ברצף במשך 10 שניות ב 3 x 10 ס&quot;מ צלחות פטרי המכיל 5 מ&quot;ל של 0.2 מיקרומטר מסנן מעוקר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר רקמת עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 22 G מזרק מלא 5 מ&quot;ל של מסנן מעוקר PBS אל קצה הזנב של עמוד השדרה ואת סומק cranially, המאפשר את כבל tO היציאה לתוך צלחת פטרי הרביעי ( איור 1b ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף חוט השדרה בצינור 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של HABG ( טבלה 1 ) על הקרח. השתמש בזהירות כדי למנוע מוחץ את חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.8 עבור כל גור במיטה. הערה: באופן אידיאלי, תהליך זה צריך לקחת פחות מ -30 דקות לכל חוט השדרה כדי להבטיח בידוד נוירון בריא. </li></ol> 4. בידוד נוירונים הערה: השלב הבא צריך להתבצע מכסה המנוע זרימה למינרית. היכרות עם טכניקה סטרילית בסיסית צפויה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצינור המכיל את חוט השדרה ולנער קלות להשעות את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים רקמות מן הצינור לתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ זכוכית וקוביות עם להב גילוח כדי ליצור חתיכות בסדר ~ 0.5 מ&quot;מ בגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמה עם פיפטה רחב נשא לתוך צינור 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של HABG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אותו ב30 ° C אמבטיה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לאזן בטמפרטורה זו. שמור את התאים על שייקר מספיק רק כדי לאפשר להם להיות מושעה בנוזל. הערה: צעד זה נעשה כדי למנוע מזעזע את התאים עם המעבר מן הקרח המדיום העיכול. שמירה על התאים ב 30 מעלות צלזיוס מסייעת להפחית את המוות התא הקשורים מטבוליזם מוגברת אחרת ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום העיכול ( טבלה 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שיפוע צפיפות (טבלה 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כל אחת 4 שכבות 4 צינורות נפרדים 15 מ&quot;ל, כפי שתואר בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל מכל שכבה לתוך צינור 15 מ&quot;ל חדש. התחל עם שכבה 1 בתחתית להוסיף ברצף עד להגיע השכבה 4 בראש. הימנע להפריע את השכבות תוך הוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחות מצופה PDL משלב 2.2. לשטוף עם מים סטריליים במשך כמה דקות לפני הסרת כל המים הנותריםהמאפשר להם להתייבש במשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמה המדיום עיכול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור המכיל רקמות מן האמבט מים שייקר ב 30 מעלות צלזיוס ולאפשר לו להתיישב במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור העיכול בינוני מן האמבט מים 37 מעלות צלזיוס לשאוב אותו לתוך מזרק לנעול leur. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את HABG עודף מן הצינור המכיל רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש leur- לנעול 0.2 מסנן מיקרומטר על המזרק להוסיף בינוני עיכול לצינור המכיל רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור באמבט מים 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שמור על התאים רועד מספיק רק כדי לאפשר להם להיות מושעה בנוזל. הערה: חשוב לא לשמור את התאים במדיום העיכול זמן רב מדי או לתת לטמפרטורה להגיע גבוה מדי, אשר עלול להוביל לעיכול מופרז וכתוצאה מכך הרקמה הופכת תלויה בתערובת ג&#39;לטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, מעיל laminin כמו בשלב 2.3. </li> &lt;Li&gt; לבצע טחינה ( כלומר, הפרדת התאים מן הרקמה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מן רועד 30 מעלות צלזיוס אמבט מים ולאפשר לו להסתפק דקות ספורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב עודף מערכת העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הרקמה ב 2 מ&quot;ל של HABG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה צרה נשא, triturate 10x במשך 45 שניות. הערה: זה כנראה הצעד החשוב ביותר אחד יכול להפחית באופן משמעותי את התשואה אם ​​לא נעשה כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הרקמה לתוך פיפטה ומיד לרוקן את התוכן בחזרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע החדרת אוויר, שכן זה יהיה להפחית באופן משמעותי את התשואה קיימא. הערה: פיפטה האידיאלי הוא פיפטה זכוכית 9. קצה פיפטה צריך להיות מלוטש כדי להחליק את המשטחים הגסים.זה צריך להיות siliconized על ידי מיקום ב 1:20 פתרון של dichlorodimethylsilane (DMDCS) ב chloroform ו שמאל O / N. לאחר מכן, יש להסיר את פיפטה מותר לאוויר יבשהוא יהיה autoclaved עבור עיקור. זהירות: DMDCS ו chloroform הם דליקים מאוד, siliconizing צריך להתבצע במנדף קטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מ&quot;ל העליון של supernatant ומכניסים אותו לתוך צינור חדש 15 מ&quot;ל שכותרתו &quot;אוסף&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.7.3-4.7.5 שתי פעמים נוספות (צינור איסוף התא צריך 6 מ&quot;ל בסוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להעביר את התוכן צינור אוסף לתוך צינור שיפוע מוכן בשלב 4.2, הימנעות הפרעה של שיפוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, להסיר את המדיום neurobasal מוכן מראש ( טבלה 1 ) מהמקרר ולאפשר לו להתחמם ב 37 ° C אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הנוירונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור שפופרת במשך 15 דקות ב 800 xg ו 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השכבה הרצויה (ים) עם פיפטה ( איור 2 ) ו במקום צינור חדש 15 מ&quot;ל. עבור נוירו הגבוהה ביותר טוהרN בידוד ( כלומר &gt; 90%), לאסוף שכבה 3. לקבלת תשואה יותר עם פחות טוהר ( כלומר &gt; 70-80%), לאסוף שכבות 2 &amp; 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את שיפוע צפיפות על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של HABG לשכבות שנאספו זה עתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 דקות 2 ב 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant, מחדש להשעות 5 מ&quot;ל של HABG, וכן קפיצי גלולה להשעות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 2 דקות x 200 ב 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant, resuspend ב 3 מ&quot;ל של המדיום neurobasal, ואת קפיצי גלולה resuspend התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μL של הפתרון, עכשיו עם תאים במדיום neurobasal, ומערבבים עם 10 μL של כחול Trypan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 10 μL של תערובת זו בספירת זכוכית ספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תא ספירת זכוכית רגילה, לספור את מספר התאים בכל אחד מארבע 4 x 4 הרביעים. הוסף את כל התאים נספר (n), רברובד של 2 (גורם דילול), לחלק 4 (מספר הרביעים נספר), להכפיל את ידי 3 (נפח המדיום neurobasal), להכפיל ידי 10 4 כדי להשיג את ריכוז התאים בתאים / מ&quot;ל. <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע את התאים על לוחות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה התא 300,000 תאים 1 מ&quot;ל של המדיום neurobasal. הערה: בהתבסס על ריכוז של תאים שהתקבלו בשלבים לעיל, בינוני נוירובאס נוסף נוסף כדי להשיג ריכוז סופי של 3 * 10 5 תאים / מ&quot;ל. המשוואה היא C 1 V 1 = C 2 V 2 , כאשר C 1 הוא הריכוז הראשוני של תאים המתקבלים מן הקציר; V 1 הוא 3 מ&quot;ל; ו C 2 הוא 3 * 10 5 תאים / מ&quot;ל, כפי שפורט לעיל. המשוואה נפתרת עבור V 2 . הוסף את נפח המדיום neurobasal צורך להפוך את הנפח הכולל של תאים בפתרון שווהאשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער בעדינות כדי להפיץ את התאים בפתרון ולהוסיף 1 מ&quot;ל היטב כל מצופים 24-גם צלחות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Qayumi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+for+investigation+of+spinal+cord+injury+caused+by+aortic+cross-clamping.">Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping.</a> J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).</li><li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption.">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li><li>Taira, Y., Marsala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+proximal+arterial+perfusion+pressure+on+function,+spinal+cord+blood+flow,+and+histopathologic+changes+after+increasing+intervals+of+aortic+occlusion+in+the+rat.">Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat.</a> Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+the+simultaneous+preparation+of+primary+neuronal+cultures+of+the+neocortex,+hippocampus+and+cerebellum+from+individual+newborn+(P0.+5)+C57Bl/6J+mice.">Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice.</a> J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Graber, D. J., Harris, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+culture+of+spinal+motor+neurons+from+rat+embryos.">Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).</li><li>Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+motor+neurons+from+the+newborn+mouse+spinal+cord.">Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord.</a> Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).</li><li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons,+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord.">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li><li>Brewer, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li><li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption.">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li><li>Su, M., Zhong, W., Ren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+protection+of+reseveratrol+against+spinal+cord+ischemic-reperfusion+injury+in+rats.">Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats.</a> Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).</li><li>Haapanen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+ischemic+preconditioning+protects+the+spinal+cord+against+ischemic+insult:+An+experimental+study+in+a+porcine+model.">Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).</li><li>Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+complications+after+thoracic+aortic+surgery:+long-term+survival+and+functional+status+varies+with+deficit+severity.">Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity.</a> J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).</li><li>Wong, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+spinal+cord+deficits+after+thoracoabdominal+aortic+aneurysm+repair.">Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair.</a> Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).</li><li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-2+agonist+attenuates+ischemic+injury+in+spinal+cord+neurons.">Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons.</a> J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).</li><li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+protection+via+alpha-2+agonist-mediated+increase+in+glial+cell-line-derived+neurotrophic+factor.">Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).</li></ol>

למחברים אין גילויים.

טכניקה זו מאפשרת תרבות אמין של נוירונים חוט השדרה. לאחר מיומנות הטכניקה מושגת, זה לוקח בערך 3.5 שעות כדי להשלים. הצלחנו לבצע את הבידוד של נוירונים מ 2 litters נפרדים (16 סה&quot;כ עכברים) כ 4 שעות. צעד המפתח היתכנות היא היכולת לחלץ את חוט השדרה מן העכברים. התשואה מאפשרת ציפוי כמה בארות ועל היכולת לבחון את הנוירונים בתנאים שונים. הצלחנו לטפל נוירונים לאחר בגרות להעריך באופן אמין ביטוי חלבון באמצעות ניתוח כתם המערבי. יתר על כן, באמצעות שקופיות זכוכית בתוך הבארות עבור קבצים מצורפים נוירון מאפשר ניתוח מכתים נוספת של הנוירונים. הליך זה הוא יתרון בכך שהוא אינו דורש רקמות עובריים ואת עוצמת העבודה הקשורים. יתר על כן, אין צורך להשתמש במיתרים בעמוד השדרה בוגרים כדי לאסוף רקמות מספיק עבור הליוויבידוד נוירון. זה מונע את הגורם של גיל הרכבה התנהגות פיזיולוגיה נוירון, כפי שניתן לראות עם עכברים בוגרים. עם זאת, טכניקה זו אינה ללא מגבלות. כפי שצוין קודם לכן, נוירונים בגילאי אינם נכללים באמצעות עכברים בילודים, וזה יכול להיות מגבלה אם התנהגות הקשורות לגיל וביולוגיה היא שטח החקירה. יש עקומת למידה לנוהל, אשר יש צורך לא רק כדי לייעל את התשואה, אבל כדי להבטיח כי הנוירונים מבודדים בריאים. טכניקת החילוץ של חוט השדרה יכולה להימשך זמן מה, במיוחד עם עכברים שנולדו לאחרונה. שמנו לב כי זמן ממושך הקשורים החילוץ של מיתרי השדרה מוביל נוירונים שיכולים להיות מתורבת לתקופה קצרה משמעותית. זה קצת הקלה על ידי המיקום של הנוירונים על הקרח; עם זאת, הזמן עדיין משחק תפקיד מפתח. ישנם שלבים עיקריים בהליך המסייעים להבטיח את התשואה האופטימלית של נוירונים. אם התשואה נוירון אינו כמו הXpected, כמה צעדים יש להעריך. ראשית, מספר מיתרי השדרה צריך באופן אידיאלי להיות יותר מ 4. כאשר 3 מיתרי חוט השדרה או פחות משמשים, התשואה היא בדרך כלל פחות מ 1 מיליון נוירונים. הכנה נאותה של המדיום העיכול חייב להיות מובטחת (שלב 4.5). השארת רקמת זמן רב מדי במדיום העיכול יגרום התמוטטות מופרזת של תאים, תוך שימוש במדיום עיכול כי לא הופעל ב 37 ° C תגרום פחות נוירונים מבודדים. לבסוף, הטכניקה טחינה (שלב 4.7) חייב להתבצע בדייקנות. תשואות נמוכות בדרך כלל נובעות מטחינה לא מספקת. מחוון טוב הוא לראות אם הפתרון הופך מעונן במהלך הטחינה - אם זה לא יקרה, סביר להניח כי טחינה דקה עדינה מדי. אם התשואה היא כצפוי אבל הנוירונים לא מופיעים מחדש תהליכים בתוך 1-2 ימים הראשונים, הבעיה היא בדרך כלל כישלון בציפוי הנכון, עם או כביסה לא מספקתאו ייבוש (שלב 2.2). אם תאים בתהליכים הפרויקט הראשון אבל לאחר מכן להפוך אפופטוטיים לפני סימן 5-7 יום, יכול להיות מספר בעיות. ראשית, להבטיח כי הפתרון HABG מוכן בתוך 24 שעות של בידוד וכי B27 תוספת טריים כי כבר מופשר באותו יום של הכנת HABG משמש. נוגדי החמצון בתוסף זה צריך להיות טרי ולא פג. לאחר מכן, ודא כי לא בועות מוצגים במהלך תהליך טחינה דקה (שלב 4.7). המבוא של בועות אוויר תורם לנושא זה עשוי להיות קשור לייבוש של הנוירונים. כמו כן, להבטיח כי התרבות אינה מוצפת זיהום, אשר ניתן לייחס לכשלים סטריליות. כאן, אנו מתארים את השימוש של 24 גם צלחות שעליו זרע את הנוירונים. לפעמים, יש צורך לבצע זמן ו / או ניסויים במינון, כגון בעת ​​שימוש סוכני תרופתי. הטכניקה יכולה להיות שונה ואת הנוירונים ניתן seeded על 48-גם plבמקום זאת. מאז פני השטח של באר בצלחת 48 גם חצי זה של צלחת 24 גם, הכרכים של פתרונות ציפוי בשימוש צריך להיות לחתוך במחצית. התאים צריכים גם להיות מצופה במחצית נפח ( כלומר 0.5 מ&quot;ל במקום 1.0 מ&quot;ל). עם זאת, הריכוז שלהם צריך להישאר זהה ( כלומר 1-5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל). בעוד מחקר זה בוצע באמצעות C57BL / 6 עכברים, הטכניקה צריכה להיות ישימה על פני זנים אחרים מניפולציה גנטית. איסכמיה בחוט השדרה והגנה היא שטח של עניין הולך וגדל 12 , 13 , 14 . מבחינה קלינית, ניתוח אאורטי thoracoabdominal יכול לגרום לשיתוק הרסני הקשור איסכמיה חוט השדרה reperfusion, הפתופיזיולוגיה של אשר נשאר להיות מובן לחלוטין 15 , 16 . הבנת איך נוירונים להגיב לE הלחץ של איסכמיה הוא ריאלי באמצעות מודל זה. הקבוצה שלנו פרסמה בעבר על פגיעה בעמוד השדרה של חוט השדרה הקשורה לעלבון איסכמי באמצעות מחסור בגלוקוז בחמצן באמצעות טכניקה זו 17 . המודל יש גם המורחבת לכלול את התרבות של astrocytes, נפרד הנוירונים 18 . לסיכום, טכניקה זו היא בעלת ערך לחקר פתופיזיולוגיה של חוט השדרה ומיקרוביולוגיה נוירונים. התרבות נטולת הסרום מאפשרת שליטה סביבתית מדויקת. זה מאפשר גישה ישירה עבור היישום של סוכני תרופתי. בשילוב עם טכניקות נוספות, כגון מניעת גלוקוז חמצן, טכניקה זו יכולה להיות שימושית כדי להרחיב את ההבנה שלנו של פתופיזיולוגיה של איסכמיה חוט השדרה דטרמינלית.

<html> הבנת הפתולוגיה של חוט השדרה מחייבת שימוש במודלים שונים, הן ברמה המקרוסקופית והן ברמת המיקרוסקופיה. דגמי בעלי חיים גדולים וקטנים 1 , 2 , 3 משמשים בחקירות vivo של מחלת חוט השדרה ופציעה. בעוד שלומדים נושאים אלה in vivo יש את היתרונות שלה, ניתוח של חוט השדרה מוגבל homogenate חוט השדרה כולו או לסעיפים רקמות 4 . זה יוצר כמה עמימות כאשר מנסים לבודד תגובות ספציפיות ומטרות בעמוד השדרה בין נוירונים תושביה גליה הסובבים אותה. הזמינות הגוברת של עכברים מניפולציות גנטית מאפשרת חקירות מפורטות יותר של הביולוגיה ברמות תאית ומולקולרית. לכן, מודל העכבר הילוד משמש כאן, המאפשר ללמוד את המאפיינים הייחודיים והביולוגיה של נוירונים חוט השדרה במבחנה . &quot;הבידוד והשימור של נוירונים במבחנה אינו פשוט במיוחד.יש שפע של טכניקות לבידוד נוירון מן רקמת קליפת המוח של מכרסמים בוגרים, כי נראה לגרום למספר ניכר של נוירונים מבודדים ( כלומר מיליונים) 5 , 6 , 7. לעומת זאת, התשואה של נוירונים מרקמת חוט השדרה הוא נמוך 8 , 9 , 10 , בין השאר בשל המסה הקטנה של רקמות.יתר על כן, בעכברים, יש מיעוט יחסית של טכניקות לבידוד של הילודים נוירונים של חוט השדרה, ושיטות קיימות מוגבלים על ידי תשואות נוירונים נמוכות יותר ( כלומר מאות) 9 או מטורפות ומשאבים כבדים טכניקות הדורשות בידוד של עכברים עובריים 10 . בפרוטוקול זה, אנחנולהשתמש בטכניקה המאפשרת בידוד עלות משאבים יעיל של מספר ניכר של נוירונים מן החוט השדרה של עכברים בילודים. כפי נפוץ בטכניקות שפורסמו בעבר, אנו משתמשים papain כמו פרוטאז אנזימטי, המאפשר לשחרור של נוירונים מרקמת חוט השדרה 5 , 6 . בנוסף, אנו משתמשים שיפוע צפיפות הפרדת תאים מעודן, אשר בעבר הוכח להיות יעיל 6 , 10 . בעוד המדיום שבו תאים מודגרת יכול להשתנות, מניסיוננו כפי שפורסם בעבר 11 , תוספת עם תוסף בינוני B27 בינוני הוכיחה להיות קריטי עבור אריכות ימים נוירון. נוירונים הם בדרך כלל קיימא עבור עד 10 ימים, המאפשר טיפול להתבצע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1357">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Hibernate A Medium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:107px;">A1247501</td>
			<td style="width:805px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Brainbits</td>
			<td>HA-Ca</td>
			<td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax 100X - 100 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement 50X - 10 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain, Lyophilized - 100 mg</td>
			<td style="width:116px;">Worthington</td>
			<td>LS003119</td>
			<td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal A Medium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine hydrobromide - 5 mg</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Laminin - 1 mg</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>23017015</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue - 20 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>440272-100ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306-1L</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glass Pippette - 9&#34;</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">13-678-20C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette bulb - 5 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z186678-3EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&#38;region=US&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BRAND&#174;&#160;Petri dish, glass - 60x15 mm</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455717-10EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td>
			<td style="width:116px;">Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-1.5-Pre</td>
			<td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &#181;L</td>
			<td style="width:116px;">Abcam</td>
			<td>ab177487</td>
			<td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &#181;L</td>
			<td style="width:116px;">Abcam</td>
			<td>ab11267</td>
			<td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות של נוירונים של חוט השדרה. הנוירונים מתקבלים C57BL הילוד / 6 עכברים מבודדים על הלידה 1-3 יום. עכבר המלטה, בדרך כלל 4-10 גורים שנולדו מתוך זוג הרבייה אחד, נאסף לניסוי אחד, מיתרי השדרה נאספים בנפרד מכל עכבר לאחר המתת חסד עם isoflurane. עמוד השדרה הוא גזור החוצה ואז חוט השדרה הוא שוחרר מן הטור. חוט השדרה הם לאחר מכן טחון כדי להגדיל את פני השטח של המשלוח עבור פרוטאז אנזימטי המאפשר נוירונים ותאים אחרים להשתחרר מן הרקמה. Trituration משמש לאחר מכן כדי לשחרר את התאים לתוך פתרון. פתרון זה מחולק לאחר מכן ב שיפוע צפיפות להפריד בין תאים שונים בתמיסה, המאפשר נוירונים להיות מבודדים. בערך 1-2.5 x 10 6 נוירונים יכול להיות מבודדים מקבוצה אחת המלטה. הנוירונים הם seeded אז על בארות מצופה דבק FactoRs המאפשרים צמיחה נכונה והתבגרות. הנוירונים לוקחים בערך 7 ימים כדי להגיע לבגרות במדיום הצמיחה והתרבות וניתן להשתמש בהם לאחר מכן לטיפול וניתוח.

באמצעות טכניקה זו, יחיד המלטה (4-10 גורים) מאפשר בידוד של 1-2.5 10 6 נוירונים מתאים זריעה על צלחות תרבות. בדרך כלל, בארות 4-8 הם seeded בריכוז שהוזכר לעיל ( כלומר 300,000 תאים / מ&quot;ל). איור 3 מראה את המראה של נוירונים בריכוז זה לאחר שבוע בתרבות ב נמוך ( א ) גבוה ( ב ) מיקרוסקופ אור הגדלה. עם זאת, יש לנו גם מסוגל לתאי התרבות בריכוזים גבוהים כמו 500,000 תאים / טוב נמוך כמו 100,000 תאים / טוב. שימוש בריכוז גבוה דורש תשומת לב בינונית וזהירה יותר לתנאים סביבתיים, כמו חומרים מזינים ניתן מדולל במהירות, המוביל לסביבה חומצית רעילה עבור התאים. עם ריכוזים נמוכים יותר, התאים נוטים לא להגיע בגרות מלאה, וכן יתר של תאים תומכים ( כלומר oligodendrocytes, מיילCroglia, ו astrocytes) הוא ציין. התאים בדרך כלל להתחיל היצמדות אל פני השטח בתוך השעות הראשונות של שעות ( איור 4 א ). האקסונים יתחילו לנבוט בתוך 24-48 h הראשון ( איור 4 ב -4 ג ). קשרים בין נוירונים שונים בתרבות בדרך כלל להגיע לבגרות ב 7 ימים ( איור 4 ד ), שבו ניסויים נקודה מתבצעים בדרך כלל על הנוירונים. נוירונים הם ניתנים לזיהוי תחת מיקרוסקופ אור, כמו שיש להם תחזיות axonal שונים. הבידוד שלנו באמצעות שכבה 3 ( איור 2 ) תשואות ~ 80-90% נוירונים בתרבות. זה אושר באמצעות מכתים immunofluorescent של סמנים ספציפיים נוירון. בתרשים 5c , חלבון cytoskeletal נוירון Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) הוא sמוכתמים, מראה קווי המתאר ואת התחזיות אקסונל של הנוירונים לאחר שבוע בתרבות. באופן דומה, באיור 6 ג , נוירון ספציפי סמן גרעיני NeuN מוכתם, מראה גרעינים עצביים. אלה סמנים נוירונים משולבים עם גרעין (DAPI, איור 5 א , 6 א ) ו cytoplasm (GFP, איור 5 ב, 6 ב ) הדמיה, ואת התמונות שהתקבלו הם התמזגו ( איור 5 ד, 6 ד ), המפרט את השפע היחסי של נוירונים לתאים אחרים תַרְבּוּת. בעת שימוש בשכבות 2 ו -3, התשואה של נוירונים הוא מעט גבוה יותר; עם זאת, יש נוטים להיות נוירונים פחות בפתרון הטהור (~ 70%). <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig1.jpg" /> איור 1: עמוד השדרה ניתח חוט השדרה פורסם מתוך עכבר 3 הילוד עכבר. החץ ב ( א ) נקודות לקראת סוף הזנב של עמוד השדרה, שבו מחט מוכנס כדי לשחרר את חוט השדרה. חוט שדרה שוחרר ( ב ) מוצג שקוע PBS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig2.jpg" /> איור 2: צפיפות צבע, עם תאים התווסף לאחר צנטריפוגה. השכבות מתוארות ומופיעות טוב יותר על תיאור הקריקטורה. השכבה השטחית ביותר (0) היא בדרך כלל פסולת מן רקמת חוט השדרה. שכבה 1 עשיר oligodendrocytes ו astrocytes. שכבות 2 ו -3 מכילים את רוב הנוירונים. בעוד שכבה 3 מכיל נוירונים עם טוהר הגבוהה ביותר, כמה תאים תומכים ( כלומר, astrocytes ו oligodendrocytes) נמצאים בשכבה 2. peLlet בתחתית בעיקר מכיל תאים microglial. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig3.jpg" /> איור 3: מיקרוסקופיה אור של תרבויות תא עצבי לאחר 7 ימים של בידוד. ב 10x הגדלה ( א ), קשרים axonal בין קונגלומרטים שונים של נוירונים ניתן לראות. בהגדלה 40X ( b ), הנוירונים יכולים להיות דמיינו יותר מקרוב עם התחזיות אקסונל שלהם. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig4.jpg" /> <strong<html> &gt; איור 4: זמן הקורס של הנוירונים לאחר זריעת על וולס. תמונה ( א ) מראה את התאים 1 שעות, ( ב ) 24 שעות, ( ג ) 48 שעות, ו ( ד ) שבוע לאחר זריעה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig5.jpg" /> איור 5: כתם Immunofluorescent של נוירונים באמצעות סמן Cytoskeletal עצביים MAP2. מכתים גרעיני (DAPI) מוצג בכחול ( א ), עם מכתים cytoplasmic (GFP) ירוק ( ב ) ו נוירון cytoskeletal חלבון (MAP2) באדום ( ג ). התמונות הממוזגות ( ד ) משולבות, מראה את השפע היחסי של נוירונים.יעד = &quot;_ ריק&quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig6.jpg" /> איור 6: כתם Immunofluorescent של נוירונים באמצעות סמן גרעיני עצבי NeuN. מכתים גרעיני (DAPI) מוצג בכחול ( א ), עם מכתים cytoplasmic (GFP) ב ( ב ) גרעינים נוירונים (NeuN) באדום ( ג ). התמונות הממוזגות ( ד ) משולבות, מראה את השפע היחסי של נוירונים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת </td><td> אִחסוּן </td><td colspan="3"> רכיבים </td><td> הכנה </td></tr><tr><td rowspan="4"> HABG </td><td rowspan="4"> 4 ° C / 24h </td><td></td><td colspan="2"> 100 מ&quot;ל </td><td rowspan="4"> - הפשרת B27 ב 4 ° C מקרר O / N - מסנן לעקר (0.22 מיקרומטר) </td></tr><tr><td> מצב שינה א </td><td colspan="2"> 97.8 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> B27 [2%] </td><td colspan="2"> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> GlutaMAX [0.5 מ&quot;מ] </td><td colspan="2"> 0.25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td rowspan="5"> מדיה Neurobasal </td><td rowspan="5"> 4 ° C / 1 בשבוע </td><td></td><td colspan="2"> 100 מ&quot;ל </td><td rowspan="5"> - הפשרת B27 ב 4 ° C מקרר O / N - מסנן לעקר (0.22 מיקרומטר) - Aliquot 50 מנות מ&quot;ל לתוך צינורות 50 מ&quot;ל (חנות ב 4 ° C) </td></tr><tr><td> Neurobasal A </td><td colspan="2"> 97 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> B27 [2%] </td><td colspan="2"> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> GlutaMAX [0.5 מ&quot;מ] </td><td colspan="2"> 0.25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> עט / דלקת [1%] </td><td colspan="2"> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td rowspan="4"> עיכול מדיה </td><td rowspan="4"> יום של בידוד </td><td></td><td colspan="2"> 10 מ&quot;ל </td><td rowspan="4"> - לנער במרץ - תן לזה לשבת 37 מעלות צלזיוס אמבטיה למשך 30 דקות (מוכן באופן אידיאלי 30 דקות לפני השימוש) - מסנן לעקר (0.22 מיקרומטר) </td></tr><tr><td> HA-Ca </td><td colspan="2"> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פאפאן </td><td colspan="2"> 25 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> GlutaMAX [0.5 מ&quot;מ] </td><td colspan="2"> 0.025 מ&quot;ל </td></tr><tr><td rowspan="7"> צפיפות הדרגתית </td><td rowspan="7"> יום של בידוד </td><td></td><td colspan="2"> 1 שיפוע </td><td rowspan="7"></td></tr><tr><td rowspan="2"> שִׁכבָה </td><td> OptiPrep </td><td> HABז </td></tr><tr><td> (0.13 מ&quot;ל) </td><td> (5.29 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> 1 תחתית </td><td> 0.26 מ&quot;ל </td><td> 1.24 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.19 מ&quot;ל </td><td> 1.31 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.15 מ&quot;ל </td><td> 1.35 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 4 למעלה </td><td> 0.11 מ&quot;ל </td><td> 1.39 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הכנת המדיה והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ציפוי מצע </td><td> אִחסוּן </td><td colspan="2"> רכיבים </td><td> הכנה </td></tr><tr><td rowspan="2"> PDL </td><td rowspan= &quot;2&quot;&gt; - 20 ° C להקפיא להפשיר פעם אחת </td><td> פולי-ליזין הידרוברומיד </td><td> 5 מ&quot;ג </td><td rowspan="2"> - Aliquot 4 מ&quot;ל לתוך צינורות 15 מ&quot;ל ולאחסן מיד ב -20 מעלות צלזיוס - 0.5 מ&quot;ל / טוב (צלחת 24 גם) </td></tr><tr><td> מים סטריליים </td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr><tr><td rowspan="2"> Laminin </td><td rowspan="2"> יום ציפוי </td><td> Laminin (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> 80 μL </td><td rowspan="2"> - מספיק עבור 8 בארות בצלחת 24 גם - 0.35 מ&quot;ל / טוב (צלחת 24 גם) </td></tr><tr><td> בינוני נוירובי </td><td> 2.72 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2: הכנת מצעים ציפוי המשמש את המעיל וולס על אילו נוירונים הם מתורבתים.

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice at JoVE.com

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

spinal-cord-neurons-isolation-and-culture-from-neonatal-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.0K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי. 

Video: Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...