Los autores no tienen reconocimientos.

El cuidado y tratamiento de los animales en este procedimiento se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Colorado. 1. Preparación de soluciones <ol><li> Preparar y almacenar todas las soluciones a temperaturas apropiadas, como se muestra en la Tabla 1 . </li></ol> 2. Recubrimiento de pozos y diapositivas NOTA: Las neuronas no se adhieren bien a superficies de plástico o vidrio. <ol><li> Un día antes del aislamiento de las neuronas, se cubren los pocillos de una placa de cultivo estéril de 24 pocillos con 0,5 ml de Poly-D-Lisina (PDL, Tabla 2 ) y se deja en una capa de flujo laminar O / N. NOTA: El método preferido es usar placas de 24 pocillos y cubrir solamente los pocillos centrales, ya que la evaporación de los pocillos periféricos tiende a ser más acelerada y conducir a resultados inconsistentes. Adicionalmente, se pueden colocar diapositivas de vidrio dentro de los pocillos antes de tO revestimiento. Las neuronas se unirán a las diapositivas de vidrio revestidas y se pueden retirar posteriormente para obtener imágenes microscópicas adicionales . </li><li> El día del aislamiento, retire el PDL de los pozos. Lavar con agua estéril durante unos minutos antes de retirar el agua restante y dejar que se seque durante 1 h (ver más abajo). </li><li> Después del secado, cubrir los portaobjetos con laminina ( Tabla 2 ). NOTA: Aproximadamente 10 μl de laminina (10 μg / μl) es suficiente para revestir cada pocillo de una placa estéril de 24 pocillos. Esto se mezcla con 340 μl de medio (volumen total: 350 μl) para cubrir todo el pocillo. Dejar reposar durante 2 h a RT en una campana de cultivo y luego aspirar antes de recubrir las células. </li></ol> 3. Cosechando las Cuerdas Espinales NOTA: Todos los instrumentos deben esterilizarse en autoclave (135 ° C y 30 psi durante 4 ciclos de 7 min) para la esterilidad. <ol><li> Euthanize cachorros de ratón C57BL / 6 de un día de edad en una cámara con isoflurano. Espere30 s después de la cesación del movimiento y pellizcar la pierna para confirmar la falta de respuesta. </li><li> Separar la cabeza del cuerpo usando tijeras, con el cachorro en la posición prona. </li><li> Estabilice las patas traseras o la cola y los brazos en la mesa de procedimientos, con el lado dorsal hacia el usuario. </li><li> Corte la piel usando tijeras de iris curvadas. </li><li> Corte la médula espinal de la región lumbar justo por encima de las caderas y proceda a cortar ambos lados del tórax para separarlo del cuerpo. NOTA: Esto requiere la disección cuidadosa de la médula espinal de los órganos viscerales para evitar daños inadvertidos a otros órganos ( Figura 1a ). </li><li> Se lava secuencialmente durante 10 s en placas de Petri de 3 x 10 cm que contienen 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) esterilizada con filtro de 0,2 μm para eliminar el exceso de tejido. </li><li> Inserte una aguja de 22 G y una jeringa llena de 5 mL de PBS esterilizado con filtro en el extremo caudal de la columna vertebral y enjuague cranealmente, permitiendo que el cordón tO salida en una cuarta placa de Petri ( Figura 1b ). </li><li> Recoger la médula espinal en un tubo de 15 mL con 5 mL de HABG ( Tabla 1 ) sobre hielo. Tenga cuidado de no aplastar la médula espinal. </li><li> Repita los pasos 3.1-3.8 para cada cachorro en la litera. NOTA: Idealmente, este proceso debe tomar menos de 30 min por médula espinal para asegurar el aislamiento sano de las neuronas. </li></ol> 4. Aislamiento de las neuronas NOTA: El siguiente paso debe realizarse en una campana de flujo laminar. Se espera una familiaridad con la técnica estéril básica. <ol><li> Huevo de Tejido <ol><li> Tome el tubo que contiene las cuerdas espinales y agite ligeramente para suspender el tejido. </li><li> Vierta el tejido del tubo en una placa de Petri de vidrio de 60 mm y pásela con una hoja de afeitar para crear piezas finas de ~ 0,5 mm de tamaño. </li><li> Transferir el tejido con una pipeta de diámetro ancho en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de HABG. </li><li> Colóquelo en un30 ° C durante 30 min para permitir que las células se equilibren a esta temperatura. Mantenga las células en un agitador lo suficiente como para permitir que se suspendan en el líquido. NOTA: Este paso se hace para evitar el choque de las células tras la transferencia de hielo al medio de digestión. Mantener las células a 30 ° C ayuda a disminuir la muerte celular asociada con un metabolismo de otro modo aumentado a 37 ° C. </li></ol></li><li> Preparar el medio de digestión ( Tabla 1 ). </li><li> Preparar el gradiente de densidad (Tabla 1). <ol><li> Prepare cada una de las 4 capas en 4 tubos separados de 15 mL, como se indica en la Tabla 1 . </li><li> Añadir 1 ml de cada capa en un nuevo tubo de 15 ml. Comience con la capa 1 en la parte inferior y agregue secuencialmente hasta llegar a la capa 4 en la parte superior. Evite perturbar las capas mientras agrega. </li></ol></li><li> Lave las placas recubiertas de PDL de la etapa 2.2. Lavar con agua estéril durante unos minutos antes de retirar el agua restante yPermitiendo que se sequen durante 1 h. </li><li> Transferir el tejido al medio de digestión. <ol><li> Retirar el tubo que contiene los tejidos del baño de agua agitador a 30 ° C y dejar reposar durante unos minutos. </li><li> Retirar el tubo del medio de digestión del baño de agua a 37 ° C y aspirarlo en una jeringa de su-lock. </li><li> Aspirar el exceso de HABG del tubo que contiene los tejidos. </li><li> Utilice un filtro su-lock de 0,2 μm en la jeringa para añadir medio de digestión al tubo que contiene tejido. </li><li> Colocar el tubo en un baño de agua a 30 ° C durante 30 min. Mantenga las células temblando lo suficiente como para permitir que se suspendan en el líquido. NOTA: Es importante no mantener las células en el medio de digestión durante demasiado tiempo o dejar que la temperatura se eleve demasiado, lo que podría conducir a una digestión excesiva y dar lugar a que el tejido se suspenda en una mezcla gelatinosa. </li></ol></li><li> Durante este período, se cubre la laminina como en el paso 2.3. </li> &lt;Li&gt; Realizar la trituración ( es decir, separar las células del tejido). <ol><li> Retire el tubo del baño de agua templado a 30 ° C y deje reposar durante unos minutos. </li><li> Aspirar el exceso de medio de digestión. </li><li> Suspender el tejido en 2 mL de HABG. </li><li> Usando una pipeta de ánima estrecha, tritura 10 x durante 45 s. NOTA: Este es probablemente el paso más importante y puede disminuir significativamente el rendimiento si no se hace correctamente. <ol><li> Aspirar el tejido en la pipeta y vaciar inmediatamente el contenido. </li><li> Evitar la introducción de aire, ya que disminuirá significativamente el rendimiento viable. NOTA: La pipeta ideal es una pipeta de vidrio de 9 &quot;La punta de la pipeta debe ser pulida con fuego para suavizar las superficies rugosas Luego debe ser siliconada colocando en una solución 1:20 de diclorodimetilsilano (DMDCS) en cloroformo La pipeta debe ser removida y dejada secar al aire.Debe esterilizarse en autoclave. Precaución: El DMDCS y el cloroformo son altamente inflamables, y la siliconización debe realizarse en una campana extractora. </li></ol></li><li> Aspirar la parte superior de 2 ml de sobrenadante y colocarlo en un nuevo tubo de 15 ml denominado &quot;colección&quot;. </li><li> Repita los pasos 4.7.3-4.7.5 dos veces adicionales (el tubo de recolección de células debe tener 6 mL al final). </li><li> Transferir lentamente el contenido del tubo de recogida en el tubo de gradiente preparado en el paso 4.2, evitando la interrupción del gradiente. </li></ol></li><li> En este punto, retire el medio neurobasal previamente preparado ( Tabla 1 ) del refrigerador y deje que se caliente en un baño a 37ºC. </li><li> Purificar las neuronas. <ol><li> Centrifugar el tubo de gradiente durante 15 minutos a 800 xg y 22 ° C. </li><li> Recoja la (s) capa (s) deseada (s) con una pipeta ( Figura 2 ) y colóquela en un nuevo tubo de 15 ml. Para el neuro más puroN aislamiento ( es decir &gt; 90%), recoja la capa 3. Para obtener más rendimiento con menos pureza ( es decir, &gt; 70-80%), recoja las capas 2 y 3. </li><li> Diluir el gradiente de densidad añadiendo 5 mL de HABG a las capas recién recolectadas. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 2 min a 22 ° C. </li><li> Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender en 5 mL de HABG y pellizque el sedimento para suspender las células. </li><li> Centrifugar durante 2 min 200 xg a 22 ° C. </li><li> Deseche el sobrenadante, resuspenda en 3 ml de medio neurobasal y pellizque el sedimento para resuspender las células. </li></ol></li><li> Cuente las celdas. <ol><li> Tomar 10 μL de la solución, ahora con células en medio neurobasal, y mezclar con 10 μl de azul Trypan. </li><li> Colocar 10 μL de esta mezcla en una cámara de recuento de vidrio. </li><li> Usando una cámara de recuento de vidrio estándar, cuente el número de células en cada uno de los cuatro cuadrantes de 4 x 4. Agregue todas las celdas contadas (n), multi(Factor de dilución), dividir por 4 (número de cuadrantes contados), multiplicar por 3 (volumen de medio neurobasal) y multiplicar por 10 4 para obtener la concentración de células en células / ml. <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> Sembrar las células en las placas de cultivo <ol><li> Diluir la suspensión celular a 300.000 células en 1 mL de medio neurobasal. NOTA: Sobre la base de la concentración de células obtenida en los pasos anteriores, se añade medio neurobasal adicional para obtener una concentración final de 3 * 10 5 células / ml. La ecuación es C 1 V 1 = C 2 V 2 , donde C 1 es la concentración inicial de células obtenidas de la cosecha; V $ ₁ $ es de 3 ml; Y C $ ₂ $ es de 3 x 10 $ ⁵ $ células / ml, como se discutió anteriormente. La ecuación se resuelve para V2. Añadir el volumen de neurobasal medio necesario para hacer el volumen total de células en solución igual aV 2 . </li><li> Agitar suavemente para distribuir las células en solución y agregar 1 ml a cada pocillo en las placas de 24 pocillos recubiertos. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Los autores no tienen revelaciones.

Esta técnica permite el cultivo confiable de las neuronas de la médula espinal. Una vez que la habilidad en la técnica se logra, se tarda aproximadamente 3,5 horas en completarse. Hemos podido llevar a cabo el aislamiento de neuronas de 2 camadas separadas (16 ratones en total) en aproximadamente 4 h. El paso clave en la factibilidad es ser capaces de extraer de manera competente las médulas espinales de los ratones. El rendimiento permite el chapado de varios pozos y la capacidad de probar las neuronas en diversas condiciones. Hemos sido capaces de tratar las neuronas después de la madurez y para evaluar de forma fiable la expresión de la proteína mediante el análisis de transferencia de Western. Además, el uso de diapositivas de vidrio en el interior de los pozos de fijación de las neuronas permite el análisis de tinción adicional de las neuronas. Este procedimiento es ventajoso porque no requiere tejido embrionario y la intensidad de mano de obra asociada. Además, no es necesario usar médulas espinales adultas para recolectar suficiente tejido paraE aislamiento neuronal. Esto evita que el factor de edad composición de comportamiento en la fisiología neuronal, como se observa con ratones adultos. Sin embargo, esta técnica no está exenta de limitaciones. Como se mencionó anteriormente, las neuronas envejecidas se excluyen mediante el uso de ratones neonatales, y esto puede ser una limitación si el comportamiento relacionado con la edad y la biología es el área de investigación. Hay una curva de aprendizaje para el procedimiento, que es necesario no sólo para optimizar el rendimiento, sino para asegurar que las neuronas aisladas son saludables. La técnica de extracción de la médula espinal puede tomar algún tiempo para dominar, especialmente con los ratones recién nacidos. Hemos observado que el tiempo prolongado asociado con la extracción de las médulas espinales conduce a neuronas que se pueden cultivar durante un período significativamente más corto. Esto es algo aliviado por la colocación de las neuronas en el hielo; Sin embargo, el tiempo todavía juega un papel clave. Hay pasos clave en el procedimiento que ayudan a asegurar el rendimiento óptimo de las neuronas. Si el rendimiento de la neurona no es como eSe deben evaluar algunos pasos. En primer lugar, el número de médulas espinales debería ser idealmente superior a 4. Cuando se utilizan 3 médulas espinales o menos, el rendimiento es generalmente inferior a 1 millón de neuronas. Se debe asegurar una preparación adecuada del medio de digestión (paso 4.5). Dejar el tejido durante demasiado tiempo en el medio de digestión causará una descomposición excesiva de las células, mientras que el uso de un medio de digestión que no se ha activado a 37 ° C resultará en menos neuronas aisladas. Finalmente, la técnica de trituración (paso 4.7) debe realizarse con precisión. Los rendimientos bajos suelen ser el resultado de una trituración inadecuada. Un buen indicador es ver si la solución se vuelve turbia durante la trituración - si esto no sucede, es probable que la trituración sea demasiado suave. Si el rendimiento es el esperado, pero las neuronas no parecen regenerar los procesos dentro de los primeros 1-2 días, el problema suele ser un fracaso en el revestimiento adecuado, ya sea con un lavado inadecuadoO secado (etapa 2.2). Si las células inicialmente proyectan procesos pero posteriormente se convierten en apoptóticos antes de la marca de 5-7 días, podría haber varios problemas. En primer lugar, asegúrese de que la solución de HABG se prepara en las 24 h de aislamiento y que se utiliza el suplemento de B27 fresco que se ha descongelado el mismo día de la preparación de HABG. Los antioxidantes en este suplemento necesitan ser frescos y no expirados. A continuación, asegúrese de que no se introduzcan burbujas durante el proceso de trituración (paso 4.7). La introducción de burbujas de aire contribuye a esta cuestión y puede estar relacionada con el secado de las neuronas. Además, asegúrese de que el cultivo no está abrumado con la contaminación, que se puede atribuir a los fallos en la esterilidad. Aquí, describimos el uso de placas de 24 pocillos sobre los cuales se sembraron las neuronas. A veces, es necesario llevar a cabo tiempo y / o ensayos de dosificación, como cuando se utilizan agentes farmacológicos. La técnica puede ser modificada y las neuronas pueden ser sembradas en 48 pocillosEn su lugar. Dado que la superficie de un pocillo en una placa de 48 pocillos es la mitad de la que se encuentra en una placa de 24 pocillos, los volúmenes de soluciones de revestimiento utilizados deben cortarse por la mitad. Las células también deben recubrirse a la mitad del volumen ( es decir, 0,5 ml en lugar de 1,0 ml). Sin embargo, su concentración debe permanecer la misma ( es decir, 1-5 x 10 5 células / ml). Aunque este estudio se ha llevado a cabo usando ratones C57BL / 6, la técnica debería ser aplicable a través de otras cepas manipuladas genéticamente. La isquemia y la protección de la médula espinal es un área de creciente interés 12 , 13 , 14 . Clínicamente, la cirugía de la aorta toracoabdominal puede resultar en una parálisis devastadora relacionada con la isquemia y la reperfusión de la médula espinal, cuya fisiopatología sigue siendo completamente comprendida 15 , 16 . Comprender cómo responden las neuronasEl estrés de la isquemia es factible utilizando este modelo. Nuestro grupo ha publicado previamente sobre lesión neuronal medular relacionada con el insulto isquémico a través de la privación de glucosa de oxígeno utilizando esta técnica [ 17] . El modelo también se ha ampliado para incluir el cultivo de astrocitos, independiente de las neuronas [ 18] . En conclusión, esta técnica es valiosa para el estudio de la fisiopatología de la médula espinal y la microbiología neuronal. El cultivo libre de suero permite un control ambiental preciso. Permite el acceso directo para la aplicación de agentes farmacológicos. Combinada con técnicas adicionales, como la privación de la glucosa del oxígeno, esta técnica puede ser útil para ampliar nuestra comprensión de la fisiopatología de la isquemia determinante de la médula espinal.

<html> La comprensión de la patología de la médula espinal requiere el uso de varios modelos, tanto en los niveles macroscópico y microscópico. Los modelos animales grandes y pequeños 1 , 2 , 3 se usan para investigaciones in vivo de la enfermedad y lesión de la médula espinal. Mientras que el estudio de estos temas in vivo tiene sus méritos, el análisis de la médula espinal se limita a toda la médula espinal homogenado o tejido secciones [ 4] . Esto crea cierta ambigüedad al tratar de aislar respuestas específicas y objetivos en la médula espinal entre sus neuronas residentes y la glía circundante. La creciente disponibilidad de ratones manipulados genéticamente permite realizar investigaciones más detalladas de la biología a nivel celular y molecular. Por lo tanto, un modelo de ratón neonatal se utiliza aquí, lo que permite el estudio de las propiedades únicas y la biología de las neuronas de la médula espinal in vitro . El aislamiento y el mantenimiento de las neuronas in vitro no es particularmente sencillo.Existe una abundancia relativa de técnicas para el aislamiento neuronal del tejido cortical de los roedores adultos que parecen resultar en un número sustancial de neuronas aisladas ( es decir, millones) 5 , 6 , 7. En cambio, el rendimiento de las neuronas del tejido de la médula espinal es inferior 8 , 9 , 10 , en parte debido a la menor masa de tejido, y en los ratones existe una relativa escasez de técnicas para el aislamiento de neonatos Las neuronas de la médula espinal y los métodos existentes están limitados por rendimientos de neuronas más bajos ( es decir, cientos) 9 o por técnicas laboriosas y pesadas en recursos que requieren el aislamiento de ratones embrionarios 10 . En este protocolo,Utilice una técnica que permita el aislamiento económico y eficaz de un número sustancial de neuronas de las médulas espinales de los ratones neonatales. Como es común en las técnicas publicadas anteriormente, utilizamos la papaína como una proteasa enzimática, lo que permite la liberación de neuronas del tejido de la médula espinal 5 , 6 . Además, se utiliza un gradiente de densidad para la separación refinada de células, que se ha demostrado que es eficaz 6 , 10 . Mientras que el medio en el que las células se incuban puede variar, en nuestra experiencia y como se publicó anteriormente 11 , la suplementación con el suplemento de medio de cultivo B27 fresco ha demostrado ser crítico para la longevidad de las neuronas. Las neuronas son típicamente viables hasta 10 días, permitiendo que se realice el tratamiento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1357">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Hibernate A Medium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:107px;">A1247501</td>
			<td style="width:805px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Brainbits</td>
			<td>HA-Ca</td>
			<td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax 100X - 100 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement 50X - 10 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain, Lyophilized - 100 mg</td>
			<td style="width:116px;">Worthington</td>
			<td>LS003119</td>
			<td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal A Medium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine hydrobromide - 5 mg</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Laminin - 1 mg</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>23017015</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue - 20 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>440272-100ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306-1L</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glass Pippette - 9&#34;</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">13-678-20C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette bulb - 5 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z186678-3EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&#38;region=US&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BRAND&#174;&#160;Petri dish, glass - 60x15 mm</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455717-10EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td>
			<td style="width:116px;">Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-1.5-Pre</td>
			<td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &#181;L</td>
			<td style="width:116px;">Abcam</td>
			<td>ab177487</td>
			<td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &#181;L</td>
			<td style="width:116px;">Abcam</td>
			<td>ab11267</td>
			<td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de neuronas de la médula espinal. Las neuronas se obtienen a partir de ratones C57BL / 6 neonatales y se aíslan el día 1-3 postnatal. Una litera de ratón, generalmente 4-10 cachorros nacidos de un par reproductor, se recolecta para un experimento, y las médulas espinales se recogen individualmente de cada ratón después de la eutanasia con isoflurano. La columna vertebral se disecciona y luego la médula espinal se libera de la columna. Las médulas espinales se cortan entonces para aumentar el área superficial de suministro para una proteasa enzimática que permite que las neuronas y otras células sean liberadas del tejido. La trituración se utiliza entonces para liberar las células en solución. Esta solución se fracciona posteriormente en un gradiente de densidad para separar las diversas células en solución, permitiendo que las neuronas sean aisladas. Aproximadamente 1-2.5 x 10 6 neuronas se pueden aislar de un grupo de la litera. Las neuronas se sembraron luego en pocillos recubiertos con adhesivoRs que permiten un crecimiento y maduración adecuados. Las neuronas tardan aproximadamente 7 días en alcanzar la madurez en el medio de crecimiento y cultivo y pueden utilizarse posteriormente para tratamiento y análisis.

Utilizando esta técnica, una sola camada (4-10 cachorros) permite el aislamiento de 1-2.5 10 6 neuronas adecuadas para siembra en placas de cultivo. Típicamente, se sembran 4-8 pocillos a la concentración mencionada anteriormente ( es decir, 300.000 células / ml). La Figura 3 demuestra la aparición de neuronas a esta concentración después de una semana en cultivo a microscopía de luz de aumento de baja ( a ) y alta ( b ). Sin embargo, también hemos sido capaces de cultivar células en concentraciones tan altas como 500.000 células / pocillo y tan bajas como 100.000 células / pocillo. El uso de las concentraciones más altas requiere más atención mediana y cuidadosa a las condiciones ambientales, ya que los nutrientes pueden ser agotados rápidamente, dando lugar a un ambiente ácido tóxico para las células. Con concentraciones más bajas, las células tienden a no alcanzar la madurez completa, y un crecimiento excesivo de células de soporte ( es decir , oligodendrocitos, miCroglia y astrocitos). Las células empezarán típicamente a adherirse a la superficie dentro de las primeras dos horas ( Figura 4a ). Los axones comenzarán a brotar dentro de las primeras 24-48 h ( Figura 4b- 4c ). Las conexiones entre varias neuronas en el cultivo típicamente alcanzan la madurez a los 7 días ( Figura 4d ), momento en el que los experimentos se llevan a cabo típicamente en las neuronas. Las neuronas son identificables bajo microscopía óptica, ya que tienen proyecciones axonales distintas. Nuestros aislamientos utilizando la capa 3 ( Figura 2 ) produce ~ 80-90% de neuronas en el cultivo. Esto se confirmó utilizando la tinción inmunofluorescente de marcadores neuronales específicos. En la figura 5c , la proteína citoesquelética de la neurona proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2) es sMostrando contornos y proyecciones axonales de las neuronas después de una semana en cultivo. De manera similar, en la Figura 6c , el marcador nuclear neuronal específico NeuN está teñido, mostrando núcleos neuronales. Estos marcadores neuronales se combinan con imágenes de núcleo (DAPI, Figura 5a , 6a ) y citoplasma (GFP, Figura 5b , 6b ), y las imágenes resultantes se combinan ( Figura 5d , 6d ), detallando la abundancia relativa de neuronas con otras células en cultura. Cuando se usan las capas 2 y 3, el rendimiento de las neuronas es ligeramente superior; Sin embargo, tienden a haber menos neuronas en la solución pura (~ 70%). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig1.jpg" /> Figura 1: columna vertebral disecada y médula espinal liberada de un ratón neonatal de 3 días de edad. losFlecha en ( a ) puntos hacia el extremo caudal de la columna vertebral, donde se inserta una aguja para liberar la médula espinal. Una médula espinal liberada ( b ) se muestra sumergida en PBS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig2.jpg" /> Figura 2: Gradiente de densidad, con células añadidas después de la centrifugación. Las capas son esbozadas y mejor visualizadas en la representación de dibujos animados. La capa más superficial (0) es generalmente restos del tejido de la médula espinal. La capa 1 es rica en oligodendrocitos y astrocitos. Las capas 2 y 3 contienen la mayoría de las neuronas. Mientras que la capa 3 contiene neuronas con la mayor pureza, algunas células de soporte ( es decir, astrocitos y oligodendrocitos) se encuentran en la capa 2. El peLlet en la parte inferior contiene principalmente células microgliales. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig3.jpg" /> Figura 3: Microscopía de luz de cultivos de células neuronales después de 7 días de aislamiento. A una ampliación de 10X ( a ), se pueden ver conexiones axonales entre varios conglomerados de neuronas. En la ampliación 40X ( b ), las neuronas pueden ser visualizadas más de cerca con sus proyecciones axonales. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig4.jpg" /> <strong<html> &gt; Figura 4: Curso de tiempo de las neuronas después de la siembra en los pozos. La imagen ( a ) muestra las células 1 h, ( b ) 24 h, ( c ) 48 h, y ( d ) 1 semana después de la siembra. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig5.jpg" /> Figura 5: Coloración inmunofluorescente de las neuronas utilizando Marcador Citoesquelético Neuronal MAP2. La tinción nuclear (DAPI) se muestra en azul ( a ), con tinción citoplasmática (GFP) en verde ( b ) y proteína citoesquelética neuronal (MAP2) en rojo ( c ). Las imágenes fusionadas ( d ) se combinan, mostrando la abundancia relativa de neuronas.Target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55856/55856fig6.jpg" /> Figura 6: Coloración inmunofluorescente de las neuronas utilizando Neuronal marcador nuclear NeuN. La tinción nuclear (DAPI) se muestra en azul ( a ), con tinción citoplasmática (GFP) en verde ( b ) y núcleos neuronales (NeuN) en rojo ( c ). Las imágenes fusionadas ( d ) se combinan, mostrando la abundancia relativa de neuronas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55856/55856fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Medios de comunicación </td><td> Almacenamiento </td><td colspan="3"> Ingredientes </td><td> Preparación </td></tr><tr><td rowspan="4"> HABG </td><td rowspan="4"> 4 ° C / 24h </td><td></td><td colspan="2"> 100 ml </td><td rowspan="4"> - Descongelar B27 en refrigerador 4 ° C O / N - Esterilizar el filtro (0,22 μm) </td></tr><tr><td> Hibernar A </td><td colspan="2"> 97,8 ml </td></tr><tr><td> B27 [2%] </td><td colspan="2"> 2 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX [0,5 mM] </td><td colspan="2"> 0,25 ml </td></tr><tr><td rowspan="5"> Medios Neurobasal </td><td rowspan="5"> 4 ° C / 1 semana </td><td></td><td colspan="2"> 100 ml </td><td rowspan="5"> - Descongelar B27 en refrigerador 4 ° C O / N - Esterilizar el filtro (0,22 μm) - Alícuota de porciones de 50 ml en tubos de 50 ml (almacenar a 4 ° C) </td></tr><tr><td> Neurobasal A </td><td colspan="2"> 97 ml </td></tr><tr><td> B27 [2%] </td><td colspan="2"> 2 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX [0,5 mM] </td><td colspan="2"> 0,25 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep [1%] </td><td colspan="2"> 1 ml </td></tr><tr><td rowspan="4"> Medios de digestión </td><td rowspan="4"> Día del aislamiento </td><td></td><td colspan="2"> 10 ml </td><td rowspan="4"> - Agite vigorosamente - Dejar reposar en baño a 37 ° C durante 30 min (idealmente preparado 30 minutos antes del uso) - Esterilizar el filtro (0,22 μm) </td></tr><tr><td> HA-Ca </td><td colspan="2"> 10 ml </td></tr><tr><td> Papaína </td><td colspan="2"> 25 mg </td></tr><tr><td> GlutaMAX [0,5 mM] </td><td colspan="2"> 0,025 ml </td></tr><tr><td rowspan="7"> Gradiente de densidad </td><td rowspan="7"> Día del aislamiento </td><td></td><td colspan="2"> 1 Gradiente </td><td rowspan="7"></td></tr><tr><td rowspan="2"> Capa </td><td> OptiPrep </td><td> HABGRAMO </td></tr><tr><td> (0,13 ml) </td><td> (5,29 ml) </td></tr><tr><td> 1 Parte inferior </td><td> 0,26 ml </td><td> 1,24 ml </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,19 ml </td><td> 1,31 mL </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,15 ml </td><td> 1,35 ml </td></tr><tr><td> 4 Arriba </td><td> 0,11 ml </td><td> 1,39 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Preparación de los medios y soluciones utilizados en este Protocolo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustrato de revestimiento </td><td> Almacenamiento </td><td colspan="2"> Ingredientes </td><td> Preparación </td></tr><tr><td rowspan="2"> PDL </td><td rowspan= &quot;2&quot;&gt; - 20 ° C Congelar-descongelar una vez </td><td> Poli-D-lisina hidrobromuro </td><td> 5 mg </td><td rowspan="2"> - Alícuota de 4 ml en tubos de 15 ml y almacenar inmediatamente a -20 ° C - 0,5 ml / pocillo (placa de 24 pocillos) </td></tr><tr><td> Agua esteralizada </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> Laminina </td><td rowspan="2"> Día de recubrimiento </td><td> La laminina (1 mg / ml) </td><td> 80 μL </td><td rowspan="2"> - Suficiente para 8 pozos en una placa de 24 pocillos - 0,35 ml / pocillo (placa de 24 pocillos) </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> 2,72 ml </td></tr></tbody></table> Vskip1.000000 baselineskip TABLA 2 Preparación de los sustratos de revestimiento usados ​​para revestir los pocillos sobre los cuales se cultivan las neuronas.

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Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.0K vistas.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática. 

Video: Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Percusión fluido lateral: Modelo de Lesión Cerebral Traumática en ratones

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...