עבודה זו מומנה על ידי NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B זרע גרנט, וכן מענק משלים NIH כדי FR, אחוות BB ל CM, המלגה CDT ל RG.

1. הכנת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 22 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ב 6 ס&quot;מ מנות תרבות התא, 1 שקופית לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף כל צד של כל שקופית, כמו גם את צלחת 6 ס&quot;מ אור אולטרה סגול (UV) במשך 15-20 דקות לעקר ברדס סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הכלים עם שקופיות בפנים עם parafilm ו חנות ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol> 2. הכנה של מדיה, Buffers, פתרונות, ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) במים deionized ולהוסיף 10 מ&quot;מ HEPES, 5 מ&quot;מ NaHCO 3 , ו 1 מ&quot;מ EGTA. התאם ל- pH 7.2-7.3 עם NaOH. חיץ מסנן עם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 900 מ&quot;ל של גלוקוז גבוהה של Dulbecco השתנה של נשר בינוני (DMEM) ש במים deionized. הוסף 44 מ&quot;מ NaHCO 3 ולהתאים את ה- pH 7.2-7.3 עם HCl. סנן מדיה עם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק autoclaved. הוסף 100 מ&quot;ל של עוברי boviNe בסרום (FBS) לתקשורת כדי להפוך את ריכוז FBS 10%. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L למאגר תאיים (125 מ&quot;מ KCl, 25 מ&quot;מ NaCl, 10 מ&quot;מ HEPES, 0.2 מ&quot;מ CaCl 2 , 0.5 מ&quot;מ EGTA, 0.2 מ&quot;מ MgCl 2 ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH ל -7.25. הסופי [Ca 2 + ] יהיה ~ 100 ננומטר. לפני השימוש, הוסף 0.5 מ&quot;מ ATP. חנות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של המאגר של רינגר (121 מ&quot;מ NaCl, 2.4 מ&quot;מ K 2 HPO 4 , 0.4 מ&quot;מ KH 2 PO 4 , 10 מ&quot;מ HEPES, ו 1.2 מ&quot;מ MgCl 2 ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH 7.2. חנות בטמפרטורת החדר. כדי להשתמש, aliquot 50 מ&quot;ל לתוך צינור 50 מ&quot;ל ולהוסיף 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + ו 10 מ&quot;מ גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של פתרון KCl לשטוף (125 מ&quot;מ KCl, 25 מ&quot;מ NaCl, 10 HEPES מ&quot;מ, 0.2 מ&quot;מ MgCl 2 ) במים deionized, ולהתאים את ה- pH ל 7.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5 מ&quot;ג של יונומיצין ב 1 מ&quot;ל של דימתיל sulfoxide (DMSO). Aliquot 30 μL לתוך microtubes ולאחסן ב -206; ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חומצה cyclopiazonic (CPA) המניות על ידי הפיכת CPA לתוך DMSO. ודא אחוז הסופי של DMSO הוא ≤ 1% עבור CPA הוסיף לתאים כדי למנוע אפופטוזיס. הכן 20 מ&quot;מ 4-chloro-m-cresol (4-cmc) על ידי המסת לתוך מסונן H 2 O ולתת לו לפזר בן לילה על ידי רועד ב 37 מעלות צלזיוס. הכן את מלאי ה- ATP על ידי המסת מסוננים H 2 O ל 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את K ב D באתרו , להכין 15 מ&quot;ל כל 1 מ&quot;מ EGTA, 0.2 מ&quot;מ, 0.6 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ, ו 100 מ&quot;מ Ca 2 + במאגר KCl באמצעות 100 MM EGTA המניות 1 מ &#39;CaCl 2 מלאי מומס במים deionized. </li></ol> 3. תרבות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות C2C12 myoblast ו HEK293 תאים על פי פרוטוקולים ATCC עבור כל שימוש 10 ס&quot;מ תרבית תרבות צלחות ברדס UV סטרילית. הערה: תאים C2C12 לא צריך להיות מותר לגדול גבוה יותר מאשר מפגש ~ 70% מאז myoblasts יתחילו differentiaTe לתוך myotubes. הן HEK293 ו C2C12 תאים לגדול בקלות ולא צריך להיות מותר לגדול בעבר 100% confluency לשמור על שלמות התא. בנוסף, תאים לא צריך להיות passaged יותר מ 10 פעמים לפני השימוש בהם עבור ניסוי כדי לשמור על בריאות התא. </li></ol> 4. transfection של תאים HEK293 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע HEK293 תאים על גבי 22 מ&quot;מ x x 40 מ&quot;מ זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ב 6 ס&quot;מ צלחות כך שהם ~ 70% confluent יום transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בצע את הפרוטוקול של היצרן עבור מגיב transfection כדי transfect תאים באמצעות 2 מיקרוגרם של CDNA + CDNA ו 1: 3 (משקל / נפח) DNA: יחס מגיב transfection בתקשורת בסרום מופחת ( למשל Opti-MEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את התקשורת DMEM מהצלחת, ולהוסיף 3 מ&quot;ל של התקשורת בסרום מופחת. הוסף DNA: תערובת מגיב transfection למאכל ו דגירה של 4-6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 5-6 מ&quot;ל של HBSS. מחק את HBSS fROM את המנה ולהחליף עם 3 מ&quot;ל של DMEM טרי דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לאפשר ביטוי של GECI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של תאים C2C12 myoblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים C2C12 myoblast, תאים trypsinize על ידי הוספת מספיק טריפסין כדי לכסות את החלק התחתון של צלחת (1-2 מ&quot;ל). מניחים את המנה 37 ° C חממה עבור 2-6 דקות כדי לאפשר טריפסין כדי לשחרר את התאים מהחלק התחתון של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה הושלם, להסיר את טריפסין לשאוב את התאים 8 מ&quot;ל של DMEM. פיפטה התאים ביסודיות עם DMEM לפזר באופן שווה מחדש להשעות תאים te וזרע אותם על coverslips סטרילית ב 6 ס&quot;מ צלחות תרבות התא המכיל 3 מ&quot;ל של DMEM כך המפגש הסופי הוא 60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים באותו היום כפי שתואר בשלב 4.2-4.3. לדגור על 24 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.4. </li></ol></li></ol> 5. הכנת מיקרוסקופ שקופיות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את mIcroscope ומקור האור, ולאחר מכן לפתוח את תוכנית PCI פשוטה. אפשר המיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-20 דקות או עד תשלום מצמידים המכשיר (CCD) המצלמה מתקרר ל -65 ° C. הכן את החדר שקופית עם תאים בזמן ההמתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את החלק התחתון של פרופיל נמוך יהלום פתוח תא הדמיה עם שכבה דקה של איטום, באמצעות צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השקופית המכילה תאים transfected מתוך חממה בעדינות לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ&quot;ל של המאגר של רינגר עם 10 גלוקוז מ&quot;מ ו 1.8 מ&quot;מ CA 2 + שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו 1 מ&quot;ל של המאגר של רינגר בצלחת, כדי למנוע התייבשות תאים, ולהשתמש מלקחיים לקחת את השקופית מתוך המנה. אפשר פתרון עודף לספוג על רקמת מעבדה על ידי נגיעה בקצה השקופית לרקמה במעבדה. לאחר מכן מקום על הצד של החדר המכיל את השומן עם תאים הפונים כלפי מעלה לכיוון השמן ואת החדר מאובטח על הר הבמה באמצעות מברג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1מ&quot;ל של המאגר של רינגר לתא כדי למנוע תאים מתייבש בעת הרכבה החדר על הבמה ומשלים את שאר ההתקנה מיקרוסקופ. לאחר צינור שאיבה ואקום מחובר לתא, נפח הסופי החדר מחזיקה ~ 450 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המטרה מיקרוסקופ כדי 40X שמן טבילה המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר עדשות ובפתרון ניקוי העדשות לניקוי וייבוש המטרה. לא לשפשף את המטרה. מטפטפים בעדינות עד שהמשטח נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של שמן טבילה אל המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הר על הבמה מיקרוסקופ ולהוסיף את קצה ואקום לתא. לאחר צינור שאיבה ואקום מחובר לחדר מופעלת, נפח הסופי החדר מחזיקה ~ 450 μL. זה נפח סופי הוא ברמה עם הצדדים של החדר. זה הכרחי עבור הפתרון קאמרית להיות ברמה, במהלך הניסוי, כדי למנוע את הפתרון נשפך לתוך המטרה עקב מילוי יתר. </li><lI&gt; להרים את המטרה ולהשתמש התאמת גס עד השמן על המטרה נוגע בתחתית השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מצב שדה בהיר, להתאים את הרווח 175 ואת זמן החשיפה ל 0.03 s כדי למקד את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים ממוקדים, לעבור למצב הקרינה באמצעות עירור 488 ננומטר. שנה את זמן החשיפה ל- 0.07 s. אתר שדה תצוגה שיש בו מספיק תאים כי הם בריאים עם הקרינה נאותה לתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שדה הראייה נבחר, לצלם במצב הקרינה ואת שדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעגל אזור עניין (ROI) בתאים או מעגל את התא כולו כדי להקליט את העוצמה מהאזור הנבחר. </li></ol> 6. הדמיה סמים המושרה Ca 2 + חולפים ב Situ K ד כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את עוצמת העוצמה עם קצב המסגרת שנקבע בכל 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר את עוצמת הבסיס לייצב עבור 20-30 מסגרות (100-150 s). במידת הצורך, להקטין את frAmes / s במהלך שלב זה כדי למנוע photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב כמות של 4 ס&quot;מ נדרש ממלאי 20 מ&quot;מ מבוסס על נפח החדר הסופי של μL ~ 450 לעשות ריכוז סופי של 200 מיקרומטר. לעשות דילולים של המניה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקחת 60 μL של חיץ רינגר מן החדר מקום בצינור microcentrifuge. לדלל את הסכום המחושב של 4-cmc עם פתרון זה ולהוסיף חזרה לחדר כדי לעורר את התגובה המיועדת מן התאים להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסכום המחושב של 4-cmc לצינור microcentrifuge ומערבבים על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו בעדינות את הפתרון מעל שדה הראייה, תוך הוספת סמן האירוע במדידת העוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זמן התרופה כדי לאגד את הקולטן ולאחר מכן ירידה האות, ולאחר מכן לשטוף עם 3-6 מ&quot;ל של המאגר של רינגר עם 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + ו 10 מ&quot;מ גלוקוז בעת ובעונה אחת להוסיף את סמן האירוע. מאז נפח החדר הוא 450 &amp;# 181; L והוא מחובר ואקום, הוספת 3-6 מ&quot;ל של חיץ מבטיחה כי הפתרון הקודם המכיל את התרופה נשטף והחליף עם הפתרון החדש הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 6.1-6.7 עבור 100 מיקרומטר ATP ו -15 מיקרומטר מחיר לרכישה, באמצעות שקופית חדשה של תאים transfected עבור כל assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידה תושלם, לסיים את איסוף הנתונים בחלון המדידה עוצמת בתוכנית פשוטה PCI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות פלואורסצנטי ו brightfield של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ הנתונים עבור הניסוי. הנה, מעגל מחדש את התאים או אזורים של עניין כדי לחשב מחדש את העוצמה ערכים, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את באתרו K ב C2C12 תאים myoblast, בצע את הפרוטוקול כפי שמתואר בסעיף 4.2 ו סעיף 5 ו לשים 1 מ&quot;ל של 0 mM Ca 2 + חיץ של רינגר בחדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים עם 0.002-0.005% saponin במאגר תאיים עבור 15-30 s לרוקן את התאים של כלCatcher + זה יכול להיות cytosol. לשטוף את התאים עם 3-6 מ&quot;ל של 1 מ&quot;ל EGTA במאגר KCl עם 10 מיקרומטר ionomycin. אפשר את עוצמת הירידה עד להגיע לרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 3-6 מ&quot;ל של חיץ KCl עם 10 מיקרומטר יונומיצין ולאפשר את העוצמה לייצב, ולאחר מכן להוסיף כל Ca 2 + פתרון מפורט בשלב 2.7. אפשר את העוצמה להגיע לרמה בין כל תוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכייל את החיישן עבור basal [Ca 2 + ] כימות, בצע את שלב 6.12. השתמש EGTA ואת 100 מ&quot;מ Ca 2 + חיץ משלב 2.7 כדי לקבל את עוצמת הקרינה המינימלית והמקסימלית. </li></ol> עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את קובץ הגיליון האלקטרוני של נתוני מדידת העוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים עבור כל תא על עוצמת הבסיס (F / F 0 ). מגרש את הנתונים המנורמלים לעומת הזמן בכל תוכנית גרפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את השינוי%, לחסר את שיא השיא מנורמלUe מ 1 ו להכפיל ידי 100. לחשב את סטיית הממוצע ו סטנדרטי אם תאים מרובים היו צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את יחס אות לרעש, SNR, לפתוח את קובץ התמונה שנשמר בניסוי בתוכנת עיבוד תמונה, כגון ImageJ, ולאחר מכן למדוד את האות, תאים transfected, רעש, רקע. חישוב SNR באמצעות המשוואה SNR = אות / רעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את K באתרו D מן הנתונים שנאספו הדמיה פלואורסצנטי, הממוצע נתוני עוצמת, המרכיבים את המישורים, לאחר תוספת של כל Ca 2 + ריכוז EGTA (0 mM Ca 2 + ). לחשב את הרוויה החלקית (בעוצמה יחסית) באמצעות θ = (F - F דקות ) / (F מקס - F דקות ), כאשר θ היא עוצמת יחסית, F הוא הקרינה בכל נקודה, F דקות היא עוצמת הקרינה המינימלית, ו F מקסימום הוא עוצמת הקרינה המרבי, כדי לראות את השינוי בעוצמת tהוא לחקור עם תוספת של Ca 2 + לעומת עוצמת המינימום. מגרש את נתוני האינטנסיביות היחסית כנגד [Ca 2+ ] בכל תוכנית התאמה של גרפים ועקומות. השתמש במשוואת הכריכה 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) המתורגם לכל תוכנית התאמה של גרפים ועקומות כדי לחשב את K d . M T הוא ריכוז המתכת הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את הסידן הבסיסי מהכיול המתואר ב -6.13, ממוצע נתוני האינטנסיביות, המהווים את המישורים, לאחר תוספת של 1 מ&quot;מ EGTA (F דקות ) ו -100 מ&quot;מ Ca 2 + (F מקסימום ). השתמש במשוואה כיול [Ca 2 + ] = K ד ([F - F דקות ) / (F מקס - F)] כדי לחשב את הסידן הבסיסי. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator.">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li><li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2.">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li><li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חי בודד תא הדמיה של בדיקות ניאון, כגון Catcher + , היא טכניקה יעילה לנתח מסובך ER / SR Ca 2 + תהליכי איתות בכל תא בתגובה אגוניסטים קולטן או אנטגוניסטים. טכניקה זו שימושית גם עבור הדמיה תוך שימוש באורכי גל מרובים בו זמנית, כגון הצורך Fura-2 או תמונה Catcher + ו Rhod-2 יחד כדי לפקח הן ER ושינויים סידן cytosolic, בהתאמה. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול זה; Transfection תא יכול להיות בעל השפעה רבה על הכדאיות של הדמיה. שיעורים נמוכים transfection יכול לגרום ביטוי מספיק של GECI לניטור תגובות סידן. מצד שני, overexpression של Catcher + לא תהיה השפעה אגירה על ER / ER Ca 2 + , בעיה הקשורים צבעים סידן סינתטי. Buffering ההשפעות של Ca 2 + בדיקות מושפעים [Ca 2 + ] באורגנל, K ד של pחלוק וריכוז החללית הנדרשת למדידה. Cytosolic [Ca 2 + ] הוא בדרך כלל בטווח nanomolar נמוך, עם זאת, הריכוז בדיקה נדרש הוא בטווח דומה. במקרה זה, כמות ריכוז צבע ויכולתה במאגר סידן cytosolic היה, והוא, הדאגה העיקרית עבור הדמיה הסלולר. לעומת זאת, ER / SR [Ca 2 + ] הוא ב 100s של micromolar ל millimolar טווח 31 כפי שקבענו עבור שורות תאים יונקים שונים 25 . מאז 0.1-1 ביטוי מיקרומטר של Catcher + מספיק כדי לאפשר זיהוי של סידן ER, אפקט חציצה של Catcher הוא זניח. לפיכך, Catcher + יכול לפקח Ca 2 + השטף בסביבות [Ca 2 + ] גבוהה ללא כל אפקט חציצה על לומינל ER / SR Ca 2 + 32 . מספר גורמים יכולים להשפיע על יעילות transfection של GECI כגון זמן הדגירה, thE מגיב transfection, טמפרטורת הדגירה, ואת confluency התא. התא confluency, כאשר זריעת התאים בשקופית, יכול להשפיע באופן משמעותי על איכות הדמיה. Low confluency יכול לגרום למספר נמוך של תאים (n) ופחות דיוק סטטיסטי, בעוד רמות גבוהות של confluency להוביל שכבות חופפות של תאים המייצרים משתנים גדולים הדמיה. הזמן והטמפרטורה עבור transfection צריך להיות מותאם בהתאם לסוג התא. בנוסף, הוספת DMEM עם התקשורת בסרום מופחתת היא אופטימלית עבור transfection פעמים ארוכות יותר כדי למנוע אפופטוזיס. GECI המקורי Catcher הקרינה בתאי יונקים, כאשר תרבותי transfected, היה רק ​​30 מעלות צלזיוס. הקרינה של Catcher היה אופטימיזציה אופטימיזציה משופרת עבור ביטוי ב 37 מעלות צלזיוס וכתוצאה מכך החדש, משופרת גרסה Catcher + . כתם המערבי באמצעות נוגדן נגד EGFP ניתן לבצע כדי לאשר את הביטוי של Ca 2 + בדיקה. יתר על כן, אניThod ועקביות של משלוח מגיב הוא קריטי. ריאגנטים ניתן להוסיף לחדר על ידי זלוף, דיפוזיה נפח קטן, או על ידי משאבות מכניות, כל אשר יכול להפיק תגובות שונות. זה הכרחי כי החדר הפתרון הוא חתום כראוי על ידי החלת שכבת איטום על החלק התחתון של החדר כי ימוקמו על השקופית. יש לבחור את אורך הגל הנכון עבור החללית. אורכי גירוי ופליטה עבור Catcher + הם 395/488 ננומטר ו 510 ננומטר, בהתאמה. עבור הדמיה תא, רק 488 ננומטר משמש עירור, כדי למנוע את ההשפעה המזיקה של אור UV על תאים. לכן, באמצעות כל מסננים אופטיים אשר לרגש ב 488 ננומטר ולאסוף את הפליטה ב 510 ננומטר יהיה מקובל להשתמש בתמונה עם Catcher + . כדי למנוע photobleaching, המאמצים עשוי להיות ממוקד כדי לייעל את עוצמת האור ואת החשיפה לאור כגון מסגרות / 33 . בעוד פרוטוקול זה אידיאלי לנתח את effEct של ER / SR שינויים באמצעות Catcher + Ca 2 + ER / SR פלואורסצנטי בדיקה, יש מגבלות כצפוי בכל ניסוי. מאחר שתא בודד של דימות חי בודק רק מסגרת קטנה של תאים, מספר התאים (n) יכול לנוע בין 1 ל -100 תאים בממוצע, אך יכול להיות נמוך יותר עבור שורות תאים גדולות יותר. זה מוביל מספרי תאים נמוכים ותוצאות מגוונות סטטיסטית ללא ניסויים מרובים. נדרש n&gt; 6 לדיוק סטטיסטי. כדי לקבל n גדול, מנות רבות חייב להיות צילמו או טכניקות אחרות יש להשתמש, במקביל. בנוסף, Catcher + הוא אורך גל יחיד ER / SR Ca 2 + בדיקה, זה מוביל לנושאים אחרים של בדיקות אורך גל יחיד וצבעים עם לא להיות מסוגל לכמת את האות, לא לדעת אם האות נכון לעומת הפרעה של תאים חפץ, ורעש גדול בהשוואה למערכות ratiometric 34 . עבודה זו מראה כי אלה אופטימיזציה Ca 2 + בדיקות יכוללהיות מיושם סוגי תאים שונים או סוגי רקמות לפקח קולטן בתיווך ER / SR Ca 2 + שחרור. Catcher + הוא אורך גל יחיד ER / SR Ca 2 + בדיקה. לכן, חשוב כי הפרמטרים הניסוי והגדרות עקביים למדידה כמותית. כיול מפורט של ריכוז סידן K ד של חיישן סידן בקווים התא הם מדידות חשובות נוספות לניתוח כמותי. אלה חיישנים סידן פיתח יכול גם להיות ממוקד למיקומים ספציפיים בתוך ER / SR כדי לפקח על שונה מאוד Ca 2 + ארעיים הקיימים לעומת העולמי Ca 2 + שינויים בתנאים ביולוגיים ופתולוגיים שונים. ממצאים אלה ימשיכו לדחוף את השדות של Ca 2 + הדמיה ועיצוב בדיקה קדימה כדי לספק כלים עתידיים לאבחון Ca 2 + הקשורות מחלות. הפרוטוקולים המדווחים והחיישן המפותח יכולים גם להיות מותאמים לתרופה dIscoveries נגד מחלות הקשורות עם סידן איתות.

התכונות הספציו-טמפורליות של סידן תאיים (Ca 2 + ) חולפות פונקציות ביולוגיות שונות 1 . אלה Ca 2 + אירועים איתות מופעלות מחוץ לתאי באמצעות גירויים שונים נשלט intracellularly על ידי Ca 2 + האחסון הגדולות אחסון על ידי רבים Ca 2 + משאבות, ערוצים, Ca 2 + חלבונים מחייב. Ca 2 + transients יכול להיות שונה באופן משמעותי כתוצאה של פגמים עם אפנון האות, המוביל למחלות שונות 2 . בגלל המהירות ואת המורכבות של Ca 2 + מערכת איתות, עם endo- (ER) ו sarcoplasmic reticulum (SR) במרכז, גנטית מקודדים Ca 2 + בדיקות כי כבר אופטימיזציה עבור ביטוי יונקים עם קינטיקה מהירה יש צורך כדי לעקוב אחר Ca 2 + המקומי המקומי שינויים בתאים שונים 3 . ER ו SR, עמיתו בתאי השריר, הם תאיים מרכזי תא Ca 2 + אחסון ולפעול כמו Ca 2 + כיורים המסייעים להגביר את Ca 2 + אות 4 . ER / SR הוא חלק בלתי נפרד Ca 2 + איתות עם תפקידים כפולים כמו משדר מקלט של אותות 5 . הקולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) הם Ca 2 + קולטנים שחרור ממוקם על הקרומים של ER / SR כי מוסדרים על ידי Ca 2 + 6 . סוכנים אחרים במישרין או בעקיפין לעורר את הפונקציה של קולטנים אלה. 4-chloro-m-cresol (4-cmc) הוא אגוניסט חזק של ריר, בעל 10 רגישות גבוהה יותר מאשר קפאין להפקת SR Ca 2 + שחרור שבו שניהם מועסקים באופן קבוע ללמוד RI בתיווך Ca 2 + שחרור ב תאים בריאים וחולים. ATP מגדיל IP 3- מתווכת Ca 2 + מחדשחכירה באמצעות IP 3 R 8 . ATP נקשר לקולטן הפורינרגי P2YR, קולטן G יחד עם ה- GPR, המפעיל את ייצור ה- IP 3 המחובר ל- IP 3 R כדי לשחרר Ca 2 + ממכשיר ה- ER 9 , 10 . המשאבה הסרקו-endoplasmic reticulum סידן ATPase (SERCA) היא משאבת ATPase מסוג P, הממוקמת גם על קרום ER / SR המפחית cytosolic Ca 2 + וממלא את ER / SR על ידי פעיל לשאוב את יון לתוך לומן ER / SR 11 . מעכבים ספציפיים של המשאבה SERCA כוללים thapsigargin, מ Thapsia garganica , וחומצה cyclopiazonic (CPA), מ Aspergillus ו פניציליום . מחיר לרכישה יש זיקה נמוכה עבור המשאבה וחוסמת באופן הפוך את נקודת הגישה 2 + Ca 12 . Thapsigargin, לעומת זאת, באופן בלתי הפיך נקשר המשאבה Ca 2 + חינם ב שאריות F256 ב הסליל M3 עם nanomolז. ניתוח וכימות השינויים הכרוכים Ca 2 + אירועים מגורה כבר ונשאר אתגר. מאז ER / SR הוא תת subcellular מרכזי Ca 2 + המכיל תא עם פונקציה מרכזית בהפצה של האות Ca 2 + , הרבה עבודה כבר התמקדו בהבנה ER / SR Ca 2 + איתות 5 . יצירת סינתטי Ca 2 + צבעים עזר לקדם את השדה והנוהג של Ca 2 + הדמיה. למרות צבעים, כגון מג-פורה -2, נעשה שימוש נרחב למדידת Ca 2 + תאים בתאים שונים, 13 , 14 , 15 יש להם מגבלות כגון עומס צבע אחיד, photobleaching, ואת חוסר היכולת להיות ממוקד לארגנים ספציפיים . גילוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקידום של חלבון פלואורסצנטי,מבוסס Ca 2 + בדיקות יש דחף את שדה Ca 2 + הדמיה קדימה 16 . חלק GECIs הקיימים הם Förster תהודה העברת אנרגיה (סריג) זוגות מעורבים חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP), רמודודולין ואת פפטיד M13 מחייב 17 , 18 . Troponin C מבוססי GECIs זמינים גם כמו זוגות סריג של CFP ו Citrine וכן בדיקות fluorophore יחיד 19 , 20 , 21 . אחרים, כגון GCaMP2 ו- R-GECO הם חיישנים fluorophore יחיד המעורבים רגוע 22 , 23 . כדי להתגבר על המגבלות של כוונון צר של K ד &#39;ו שיתופית קשורה הקשורים מספר Ca 2 + אתרים מחייב למצוא Ca 2 שלהם + תחומים מחייב 24 , מחלקה חדשנית של סידן סןסורס נוצר על ידי עיצוב Ca 2 + אתר מחייב על פני השטח של חבית ביתא במיקום רגיש chromophore של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) 25 , 26 . זה חיישן touted, קרא Catcher, יש K d של ~ 0.18 מ&quot;מ, ak על גבול דיפוזיה, ו ak של 700 s -1 . Catcher שימש כדי לפקח על קולטן בתיווך ER / SR סידן לשחרר שורות תאים יונקים שונים כגון HeLa, HEK293, ו C2C12 25 . בגלל הקינטיקה המהירה שלה, Catcher היה בשימוש סיבי שריר מכופף digitorum brevis (FDB) של צעירים וידידים חבר &#39;ה ב NIH ג&#39; קסון (FVB) עכברים לחשוף כי יותר Ca 2 + נשאר SR לאחר 2 של פוליאוריזציה של FDB סיבי עכברים ישנים בהשוואה לזו של עכברים צעירים 27 . כדי להתגבר על הקרינה נמוכה ב 37 מעלות צלזיוס, אשר מעכב את היישומים שלה הדמיה סידן של יונקיםתאים, פיתחנו גרסה משופרת של Catcher שנקרא Catcher + . Catcher + תערוכות משופרת הקרינה על 37 מעלות צלזיוס ליישום טוב יותר בתאי יונקים. מוטציות נוספות שולבו Catcher כדי לשפר את thermostability ו פלואורסצנטי ב 37 ° C 28 , 29 , כדי ליצור Catcher + . Catcher + מציג עלייה פי שישה ביחס האות לרעש (SNR) מעל Catcher 30 . כאן, הפרוטוקולים של התרבות transfection של HEK293 ו C2C12 תאים עם Catcher + ויישומו לניטור ER / SR קולטן בתיווך סידן חולפים מוצגים. תוצאות נציג מוצגים עבור Catcher + לידי ביטוי HEK293 תאים שטופלו 4-cmc, CPA ו- ATP. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול לקביעת באתרו K של Catcher + ב C2C12 תאים myoblast ו quaNtification של הבסיס [Ca 2 + ].

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

סידן תאיים (Ca 2 + ) transients עורר על ידי גירויים תאיים ליזום מספר רב של תהליכים ביולוגיים אורגניזמים חיים. במרכזו של שחרור סידן תאיים הם האורגנים הגדולים אחסון סידן תאיים, reticulum endoplasmic (ER) ואת reticulum sarcoplasmic מיוחדים (SR) בתאי שריר. שחרור דינמי של סידן מן האברונים האלה מתווכת על ידי קולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) עם מילוי המתרחשים באמצעות משאבת הסרקו / endoplasmic סידן ATPase (SERCA). חיישן סידן מקודד גנטית (GECI) בשם Catcher נוצר כדי לפקח על שחרור סידן מהיר ER / SR. הנה, פרוטוקולים מפורטים עבור transfection וביטוי של שיפור, ER / SR- ממוקד GECI Catcher + ב HEK293 ו C2C12 תאים ויישומה ניטור IP 3 R, ריר, SERCA משאבת בתיווך סידן חולףS בתאים HEK293 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתואר. קולטן אגוניסט או מעכב של בחירה הוא התפזר פתרון קאמרי ואת השינויים בעוצמה נרשמות בזמן אמת. עם שיטה זו, ירידה סידן ER נראה עם הפעלת ריר עם 4-chloro-m-cresol (4-cmc), ההפעלה העקיפה של IP 3 R עם אדנוזין טריפוספט (ATP), וכן עיכוב של משאבת SERCA עם cyclopiazonic חומצה (CPA). כמו כן, אנו דנים בפרוטוקולים לקביעת באתרו K ב ו לכמת הבסיס [Ca 2 + ] בתאי C2C12. לסיכום, פרוטוקולים אלה, המשמשים יחד עם Catcher + , יכולים לעורר קולטן בתיווך סידן בתיווך עם יישום עתידי בחקר ER / SR סידן פתולוגיות הקשורות.

סעיף זה ימחיש את התוצאות שהושגו בשיטות שתוארו קודם לכן באמצעות ה- GECI Catcher המיועד ל- ER / SR המיועד לזיהוי שינויים ב- ER / SR Ca 2 + באמצעות מסלולים שונים בתיווך קולטן. איור 1 ממחיש ER לרוקן דרך ריר מגורה עם 200 מיקרומטר 4 ס&quot;מ. 4-cmc הוא אגוניסט של RyR. תוספת של התרופה גורם לירידה סידן ER כפי שנמדד על ידי ירידה בעוצמת הקרינה + Catcher. כפי שמסומן, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר הדמיה ומדידה של קולטן בתיווך Ca 2 + הארעיים באמצעות Catcher + המספק מידע על השינויים CA Ca 2 + . כפי שמתואר באיור 2 , תוספת של 15 מיקרומטר מחיר לרכישה, כדי לחסום באופן הפוך את המשאבה SERCA, מייצרת ירידה גדולה בעוצמת הקרינה היוצרת הרמה. כמו הפונקציה של המשאבה SERCA הוא עכבות, ER CA 2 + ערוצי שחרור עדיין פעיל משחרר Ca 2 + לתוך cytosol גורם עוצמת הקרינה לרדת. התאים להתאושש לאחר שטיפת מחיר לרכישה משם עם המאגר של רינגר המכיל 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + ו 10 מ&quot;מ גלוקוז. תוצאות אלה מאשרות את היכולת של Catcher + לפקח Ca 2 + הארעיים ספציפיים המשאבה SERCA. איור 3 מציג נתונים מייצג עבור ההפעלה העקיפה של ה- IP 3 R עם 200 מיקרומטר ATP ב HEK293 תאים transfected עם Catcher + . ATP נקשר לקולטן P2Y, קולטן G- חלבון מצמידים, אשר מייצר IP 3 המפעילה Ca 2 + שחרור דרך ה- IP 3 R. למרות השינויהוא קטן, תוספת של 200 מיקרומטר ATP מייצרת ירידה ניכרת עוצמת האות. שטיפת התאים עם המאגר של רינגר המכיל 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + ו 10 מ&quot;מ גלוקוז מאפשר ER כדי למלא את האות לחזור לקו הבסיס. תוצאות אלה מדגישות את היכולת של Catcher + לפקח על ה- IP 3 R- בתיווך סידן שחרור באמצעות גירוי עקיף. באיור 4 , Catcher + היה transfected לתוך תאים C2C12 myoblast כדי לקבוע את באתרו K ד . הנתונים נאספו כפי שתואר בפרוטוקול. C2C12 תאים myoblast היו permeabilized עם saponin 0.005% עבור 15-30 s מכן שטף עם 1 מ&quot;מ EGTA במאגר KCl המכיל 10 ionomycin מיקרומטר. ריכוז Ca 2 + שונים הוכנו במאגר KCl המכיל 10 ionomycin מיקרומטר והוספו בצורה מדורגת. הנתונים מנורמל והותאם באמצעות 1: 1 לאגד- משוואה. הממוצע K ד היה 3.1 ± 1.4 מ&quot;מ עבור 7 תאים. זיקה חלשה של Catcher + מאפשר לה לחוש Ca 2 + גבוה Ca 2 + organelles כמו ER או SR. כדי לקבוע את הבסיס [Ca 2 + ] ב SR, תאים C2C12 היו permeabilized עם saponin 0.005% עבור 15-30 s, שטף עם חיץ KCl, ולאחר מכן שטף עם 1 מ&quot;מ EGTA במאגר KCl המכיל 10 מיקרומטר ionomycin להשיג F דקות . לאחר שטיפת EGTA משם עם חיץ KCl מקסימום, F מקסימום , של 100 מ&quot;מ Ca 2 + עם 10 מיקרומטר ionomycin נוסף. הבסיס Ca 2 + חושב להיות 0.4 ± 0.2 מ&quot;מ. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig1.jpg" /> איור 1: גירוי של ריר באמצעות 4 ס&quot;מ ב HEK293 תאים. ( א ) תיאור ההפעלה של ריר עם 4 ס&quot;מ. ( B ) הקלטה בעוצמה של HEK293 תאיםTransfected עם Catcher + , מקומי ER, שטופלו 200 מיקרומטר 4 ס&quot;מ. גירוי של ריר עם 4 ס&quot;מ גורם לירידה בעוצמת הקרינה מנורמל באופן ישיר בקורלציה לירידה [Ca 2 + ] ER . N מתייחס למספר התאים שצולמו. ההפחתה הממוצעת של האות הייתה 12.0 ± 2.2%. נוכחות של 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + במאגר של רינגר הקל על מילוי של ER משתקף התאוששות עוצמת הבסיס. תמונות הבלט להראות את התאים לפני ואחרי הטיפול עם 4 ס&quot;מ. SNR חושב להיות 4.3 ± 0.8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig2.jpg" /> איור 2: ירידה [CA 2 + ] ER באמצעות P SERCA הפיך pUmp מעכב CPA ב HEK293 תאים. ( א ) עיכוב משאבת SERCA על ידי רו&quot;ח. ( B ) הדמיה חיה של תאים HEK293 transfected עם Catcher + , מקומי ER, שטופלו עם CPA 15 מיקרומטר. בגלל Ca 2 + עדיין יכול לזרום דרך ה- IP 3 R ו RR, חסימת המשאבה SERCA עם רו&quot;ח גורם לירידה בעוצמת הקרינה מנורמל באופן ישיר בקורלציה לירידה [Ca 2 + ] ER . N מתייחס למספר התאים שצולמו. תמונות Inset הן HEK293 תאים transfected עם Catcher + לפני ואחרי הטיפול. הירידה הממוצעת של האות הייתה 21.0 ± 0.3%. נוכחות של 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + במאגר של רינגר הקל על מילוי של ER משתקף התאוששות עוצמת הבסיס. SNR חושב להיות 5.5 ± 0.8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של</a>הדמות הזאת. <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig3.jpg" /> איור 3: ATP מקטין [Ca 2 + ] ER ב HEK293 תאים. ( א ) סכמטי של ההפעלה העקיפה של IP 3 R עם ATP דרך P2YR קולטן purinergic. P2YR הוא GPCR שיוצר IP 3 על ATP מחייב. ה- IP 3 מפעיל את ה- IP 3 R, מגרה את שחרור הסידן מהמכשיר. ( ב ) הדמיה בזמן אמת של תאים HEK293 transfected עם Catcher + , מקומי ER, שטופלו עם 200 מיקרומטר ATP. גירוי עקיף של ה- IP 3 R דרך קולטן P2Y עם ATP גורם לירידה בעוצמת הקרינה מנורמל כי בקורלציה ישירה לירידה [CA 2 + ] ER . N מתייחס למספר התאים שצולמו. הירידה הממוצעת האות היה 6.0 ± 3.0%. SNR היה cAlculated להיות 6.7 ± 2.7. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig4.jpg" /> איור 4: במקום K K של Catcher + ב C2C12 תאים myoblast. עקבות נציג עבור עוצמת מנורמל שנאספו מ permeabilized C2C12 תאים myoblast transfected עם Catcher + . תאים היו permeabilized עם 0.005% saponin במאגר תאיים עבור 15-30 s. EGTA ו Ca 2 + פתרונות הוכנו חיץ KCl, N מתייחס למספר תאים צילמו. ( א ) תמונות פלואורסצנט הבלעה הם נציג של תאים לפני ואחרי הטיפול. 0.3, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50, ו 100 מ&quot;מ Ca 2 + נוספה לתאים my2l12 permeabilized permeabilized בנוכחות 10 מיקרומטרIonomycin כדי לקבל K ד של 3.1 ± 1.4 מ&quot;מ. ( ב ) תמונות פלואורסצנט הבלעה מייצגים תאים בערכים מינימום ומקסימום, לאחר תוספת של 1 מ&quot;מ EGTA ו 100 מ&quot;מ Ca 2 + עם 10 מיקרומטר ionomycin כל, בהתאמה. הבסיס Ca 2 + חושב להיות 0.4 ± 0.2 מ&quot;מ. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

14.8K Views.  Georgia State University.  אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול ?...

Video: Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

הדמיה תפקודית עם חיזוק, Eyetracking, ניטור פיזיולוגית

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

שחרור הדופמין ב מסופי Presynaptic הפרט דמיינו עם FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...