The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&amp;M Engineering Experiment Station for funds.

1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות לילה של המתח הרצוי נושאת את Flic דביק אלל 15,22 ב Tryptone מרק (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) ואחריו חיסון ב 1: 100 דילול ב 10 TB מ&quot;ל טריים. לגדול התרבות ב 33 מעלות צלזיוס חממה שייקר עד OD 600 = 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב 1500 XG במשך 5 - 7 דקות מחדש לפזר את גלולה במרץ ב 10 מ&quot;ל של חיץ תנועתיות מעוקר מסנן (MB; חיץ פוספט 10 מ&quot;מ: 0.05-0.06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 מיקרומטר מתיונין, pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.2 פעמים נוספות מחדש לפזר את הגלולה הסופית 1 MB המ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירה ההשעיה על ידי עובר הלוך ושוב ~ 75 פעמים בין שני מזרקים עם 21 עד 23 מתאמי מד מחובר על ידי צינורות פוליאתילן (7 - 12 ס&quot;מ אורך, 0.58 מ&quot;מ פנימי קוטר). הגבל את הזמן הכולל עבור הגז כדי 30 - 45 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים הטעונים ב 1500 XG במשך 5-7 דקות מחדש לפיזורגלולה ב 100 - 500 μL של MB. </li></ol> 2. שקופיות כנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא הדמיה על ידי הרבדה שנייה דבק דו צדדי בין תלוש-כיסוי שקופיות מיקרוסקופ. עבור מבחני chemotaxis, להעסיק כל תא microfluidic המאפשר חילופי MB וממריצים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.01% הפתרון פולי- L- ליזין בתא ואחרי 5 דקות בעדינות ולשטוף את המשטחים עם MB (80 - 100 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL של ההשעיה תא לתא ולאפשר מספיק זמן עבור התקשרות אל משטח זכוכית (7 - 8 דקות). לזרום החוצה תאים לקלף ידי הוספת 100 μL MB בצד אחד של החדר, תוך פתילת הפתרון עם נייר סינון מהצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 - 15 μL של חרוזי לטקס לתוך התא ולאפשר החרוזים זמן לפרוע באמצעותם ולצרף אל התאים (7 - 8 דקות). לשטוף בעדינות עם 100 μL של MB, כמתואר בשלב 2.3, להסיר לקלף חרוזים. להשתמש במגוון של חרוז-סיzes עבור הניסויים כל עוד ניגוד טוב זמין. </li></ol> 3. מעקב חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המדגם על במה מיקרוסקופ ולסרוק את השטח עבור חרוזים מצורפים מנועים. השתמש מטרת שלב 40X לבצע תצפיות למרות מיקרוסקופיה שלב לא הכרחית. לחלופין, להעסיק הדמית שדה בהיר כל עוד ניגוד ראוי נשמר להבחין חרוז בהיר בבירור על רקע כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם חרוז נבחרת, להזיז את הבמה רוחבית כדי למקם את החרוז בפינה שנקבעה מראש כפי שמוצג באיור 1 ב. חרוזים עמדו באותו בפינה כדי להבטיח כי כיוון הסיבוב של החרוז ידוע כראוי. מסלולו החרוז האידיאלי הוא כ עגול אבל מסלולי אליפטי הם קבילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תדר דגימה גבוה יותר מפי שניים את תדירות הסיבוב של המנוע, כדי למנוע טעויות הקשורות aliasing. בעבודה זו, להשתמש במנוע שהיה מסתובב50 הרץ ו מדגם בתדרים שהיו היה גבוה פי 10 (500 הרץ), כדי לקבל אות חלקה. </li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז ולהתאים את מתחי מוצא PMT ונכון סְגַלגַלוּת ב המסלולים עם טרנספורמציות המאוחד במידת צורך 23. השתמש ניתוח כוח ספקטרום לקבוע שיעורי סיבוב 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע זוויות קוטב, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). קבע את הווריאציות במהירויות מנוע ומיתוג לאורך זמן על ידי חישוב ω <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעסיק מסנן חציון להחליק את הנתונים מהירי מנוע. חלון מסנן מעל שני סיבובים מלאים מומלץ 23,24. </li></ol>

<ol>
	<li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli.">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li><li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract.">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li><li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections.">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li><li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rotary+motor+of+bacterial+flagella.">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li><li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus.">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li><li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor.">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li><li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence.">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li><li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms,+flagella,+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria.">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).</li><li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility.">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li><li>Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+Kinetics+in+Bacterial+Chemotaxis.">Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis.</a> J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li><li>Blair, D. F., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+torque+in+defective+flagellar+motors.">Restoration of torque in defective flagellar motors.</a> Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).</li><li>Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torque-generating+units+of+the+flagellar+motor+of+Escherchia+coli+have+a+high+duty+ratio.">Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio.</a> Nature. 403, 444-447 (2000).</li><li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load.">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li><li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load.">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li><li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torque-speed+Relationship+of+the+Na+-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus.">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li><li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor.">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li><li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators.">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li><li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards.">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li><li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis.">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299 (2015).</li><li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli.">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li><li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch.">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li><li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11.">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li><li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli.">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li><li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor.">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

על מנת להקל על מעקב חרוז קשור ואמידה נכונה של מגבילי מנוע, את המידע הבא צריך להיבדק. בעת ביצוע מדידות אלה עם תאים והולקה בשוט, הגז הוא שלב קריטי. גזיזה מפחיתה את נימת flagellar כדי בדל גרידא, ובכך להבטיח כי העומס הצמיג על המנוע הוא בעיקר בשל החרוז ניתן לאמוד בתוך 10% שגיאה 16. גזיזה גם משפרת את הסיכוי למצוא מסלולים עגולים עם מוזרויות מופצות בחוזקה (&lt;חרוז בקוטר 14). תוצאות גז פסולת מסלולים סוררים, אשר תרכובות טעויות מעקב בחישוב שאיפות צמיגות, כמו גם וכתוצאה מכך יחסי אות לרעש עניים. השימוש אוסצילוסקופ מאפשר היעלמות מהירה של נתונים כאלה. מאז המאפיינים ביומכנית של חוטים flagellar צפויים להשתנות עם מינים, שיטות הגז יצטרכו להתאים סביר על מנת להבטיח מריחה נאותה tהוא חיידקי עניין. דרך יעילה להפחתת טעויות קשורות גז היא לעבוד עם תאים חסרי הגנים המקודדים את חלבוני הנימה. חרוזים Probe אז יכול להיות מחובר ישירות וו באמצעות נוגדנים נגד וו. מציאת חרוז כי הוא קשור כראוי יכול להיות מאתגר. זאת משום שרוב חרוזי שדה הראייה או יודבקו גופי התא או משטח הזכוכית. ניתן חרוזים כאלה הביאו בנקל מיקוד חד. חרוזים אחרים יופיעו לרטוט או לסובב בעליל עם אמפליטודות גדול או מוזרויות גדולות (&gt; 1.5 - 2x קוטר חרוז). אלה הם בדרך כלל קשורים flagellar חוטים שלא היה טעון במלואו או לסובב במטוס כי הוא נוטה אל מישור המוקד. דגימה של חרוזים כאלה בדרך כלל תגרום רעש גבוה, וזמן-וריאציות המון צמיגה עלולות לגרום הערכה נמוכה מדי של מגבילי מנועים לשימוש בגודל חרוז נתון. חלק קטן מן החרוזים קשורים יעבור אקראיתְנוּעָה; אלה רק עוברים סיבוב בראונית. שבריר של החרוזים יופיע מטושטש ולא ניתן להביא בפוקוס בקלות. אלה הם הסיכוי הטוב ביותר להיות מנועים אשר היו קשורים כראוי והם מנועים של עניין. בין המגבלות של מנוע יחיד מעקב כגון זה המתואר כאן הוא חוסר היכולת לבצע ניסויי תפוקה גבוהה. מצלמה במהירות גבוהה שתמונות אזור גדול יותר של עניין יכול להיות יתרון בעניין זה. מגבלות נוספות כוללות שגיאות הקשורות אותות מרובים הנובעים מתוך חרוזים מסתובבים צפופים בתחום המבט של PMTs. לבסוף, טעויות בקביעת המיקום הנכון של החרוז רשם ביחס לשני החרכים המכפילים תגרומנה להערכה מדויקת של דינמיקת המיתוג. יתרונותיו של ההתקנה המתוארת כאן כוללים את היכולת לעקוב אחר הסיבוב של החרוזים על פני משכי זמן ארוכים בזמן אמת. זֶהמאפשר היעלמות מהירה של מסלולי מועדת לטעויות, משהו שאולי קשה להשיג עם מצלמות מהירות. בנוסף, עם כמה שינויי התקנה זו יכולה להיות משולבת עם מבחנים שנועדו להכפיף תאים למגוון של גירויים. בשילוב עם ותרמית קירור 26, הטכניקה יכולה להיות מועסקת על מנת למדוד את התגובות של מנועי פרט לגירויים תרמיים. אינטגרציה עם פינצטה אופטית יכולה לאפשר המדידות של שיפוץ מנועים בודדים בתגובה לגירויים מכאניים, כפי שנעשה 6 לאחרונה. לבסוף, העיבוד של מנוע ממריצים כימיים ניתן למדוד עם השימוש בתא זלוף מתאים ומשאבות 11. רוב המינים הידועים חיידקי הם ניע ותנועתיות בתיווך flagellar הוא השולט בטבע. השיטות הפגינו כאן צפויות להמשיך לסייע בפיתוח של תובנה-שיפוץ מבני ואת הסתגלות of מנוע flagellar.

מנועי flagellar לאפשר תאים לשחות ידי החלפת חוטים תאיים סליל. כמות מומנט המנוע יכול לייצר עבור באורך נתון של השוטון (כלומר, את העומס הצמיג) מקובעת את מהירויות השחייה. מצד השני, היכולת שלה כדי להעביר את כיוון הסיבוב שולטת נדידת תאים בתגובת כימיקלים, תהליך המכונה chemotaxis. Chemotaxis ו ארסיות להיות תנועתיות גורמי 1-3, מנועים flagellar מתאפיינים היטב במשך השנים 4. הראיות המצטברות החברה עולה כי המנוע משמש mechanosensor - זה מכנית מזהה נוכחות של 5,6 מצעים מוצקים. יכולת זו מסייעת סביר המעוררים קולוניזציה משטח וזיהומים 5,7. כתוצאה מכך, המנגנונים לפיה מנוע חושי משטחים ויוזם איתות הם בעלי חשיבות 8,9. מנוע flagellar ניתן ללמוד בקלות על ידי קושר את flagellאממ לרוטצית תא מצע והתבוננות. קשירה כזו הושגה לראשונה על ידי סילברמן וסיימון, שעבד עם מוטציה polyhook ב E. coli ו ווים לחבר בהצלחה מצעי זכוכית עם נוגדנים נגד וו 10. את assay הקשורים התאים אפשר לחוקרים ללמוד את התגובות של מתג המנוע למגוון של גירויים כימיים. לדוגמה, סגל ועמיתים לעבודה מגורה תאים קשור כימית בעזרת טפטפות iontophoretic. השינויים המתאימים הטיה CW (את החלק היחסי של מנועים הזמן לסובב עם כיוון השעון, CW) אפשרה להם למדוד את קינטיקה של הסתגלות ברשת chemotaxis 11,12. בעוד assay התא הקשור היה יעיל בחן את תשובות מתג, זה היה מסוגל רק להציע תובנה מכניקת מנוע פני טווח מוגבל של עומסים צמיגים 13. כדי להתגבר על בעיה זו, ריו ועמיתים לעבודה קשורה כדורי, חרוזי גומי כדי נימה השוברים על תאים תקועים על משטחים. החרוזים היואז מעקב באמצעות אינטרפרומטריה גב מוקד עם מלכודות אופטיות חלשות 14. הודות לשיתוף פעולה עם חרוזים בגדלים שונים, חוקרים יכלו ללמוד את המנוע על פני טווח רחב יותר של עומסים. assay זה היה שיפור מאוחר יותר על ידי יואן וברג, אשר פיתח טכניקה חרוז מעקב מבוססי מכפיל בשילוב עם תאורה כהה שדה לייזר. המעקב מופעל שיטתם של nanobeads זהב הקשור כי הם כה זעירים (~ 60 ננומטר) כי ההתנגדויות הצמיגות החיצוניות היו נמוכות לעומת ההתנגדויות הצמיגות הפנימיות סיבוב 15,16. זה הוביל את המידות של מהירויות המרביות השגה ב E. coli (~ 300 הרץ). ב V. alginolyticus, מבחני חרוז דומים מופעלים מדידות של שיעורי ספינינג בעומסים צמיגים ביניים (~ 700 הרץ) 17. בכך שהיא מאפשרת מדידות של תגובות המנוע על פני הטווח האפשרי השלם של המון צמיגה (מאפס עומס לקרוב-דוכן), החרוז-המבחנים ספקו כלי biophysical חשוב להבין את torque דור תהליך 18,19. לאחרונה, שינינו את assay יואן-ברג לכלול פינצטה אופטית שאפשרה לנו ליישם גירויים מכאניים מדויקים מנועים בודדים 6. באמצעות טכניקה זו, הראינו כי-גנרטורים כוח לסובב את המנוע הם mechanosensors דינמי - יעשו שינויים בתגובה לשינויים המון צמיגה. יתכן כי עומס חישה כגון מפעילת התמיינות תאים לתוך חיידקים שורצים, למרות המנגנונים עדיין אינם ברורים. כמו כן סביר להניח כי מנועי flagellar במינים אחרים הם גם mechanosensitive 20, למרות ראיות ישירות חסרות. כאן, אנו דנים מבוססי מכפיל (PMT) הגישה למעקב אחר סיבוב של חרוזים לטקס הרתומים חוטים flagellar 15. בהשוואת מעקב עם מצלמות מהירות, את ההתקנה המכפילה יש יתרון משום שהוא הוא פשוט יחסית כדי לעקוב אחר חרוזים יחידים בזמן אמת ושוב הדורה ארוכהמשא. זה שימושי במיוחד כאשר לומדים ותיק שיפוץ מתחמי מנוע flagellar בשל גירויים סביבתיים 21. למרות שאנחנו פרוטוקולים בפירוט במיוחד עבור E. coli, הם יכולים להתאים בקלות ללימוד מנועים flagellar במינים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>7307</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Luer Slip Tip Syringe</td>
			<td>Exel Int.</td>
			<td>26048</td>
			<td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>427565</td>
			<td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>59-8325</td>
			<td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier Tubes</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>R7400U-20</td>
			<td>Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,&#160; 0.78 ns response time&#160; 
			http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x1 mm precision slits</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>NT39-908</td>
			<td>2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TBS 1032B</td>
			<td>Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&#160; 
			http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 Pole LP/HP Filter</td>
			<td>Krohn-Hite</td>
			<td>3384</td>
			<td>Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.&#160;&#160;&#160; 
			http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiphot microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used. 
			https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50:50 (R:T) Cube Beamsplitter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biophysical characterization of flagellar motor functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

ההתקנה המכפילה מוצגת באיור 1 א. חשוב כי יש PMTs רגישויות גבוהות על פני טווח של אורכי גל מפוזרים על ידי החרוזים של עניין. PMTs מועסק כאן לפעול בטווחים הגלויים קרוב אינפרא אדומים, הצליח לזהות אור מפוזר על ידי חרוזים המוארים על ידי מקור אור ההלוגן. תנאי תאורה אופטימליים, לאספקת מתח ישתנו מהגדרת אחד למשנהו. עבור ההתקנה המשמשת בעבודה זו, רווח PMT ~ 10 אפריל - 10 מאי הוכיח את יעילותו. כל מכפיל היה מכוסה למעט חרך 3 x 1 מ&quot;מ ממוצבת מול המכפיל. החרכים להגביל באזור בתא-מדגם שממנו האור יכול להיכנס photomultipliers, ואת שני החריצים הם אורתוגונליים זה לזה. כאשר חרוז מסתובב ממוקם במיקום הנכון (האיור 1B), כמות האור הנכנסת עליות המכפילות כמו החרוז מגיעבתצוגה והירידות כמו שביל המעגלי שלה לוקח אותה הרחק מהנוף. התדרים של יציאות מתח PMT סינוסי לציין את מהירות הסיבוב ואת הפרשי המופע בין שני האותות לציין את כיוון הסיבוב. שימוש אוסצילוסקופ כדי להציג את פלטי PMT מאפשר הדמיה של מסלולי חרוז בזמן אמת. אותות PMT משתנה בזמן, y (t) ו- x (t), ממנוע נציג מוצגים איור 2 א. אורתוגונליות של שני החריצים מציגה בפיגור מופע בין שני האותות. אמפליטודות האות תלויות יחס אות לרעש, כמו גם את האקסצנטריות של סיבוב. מסלוליהן המקבילים של החרוז מסומנים בתרשים 2B. היסטוגרמה של המהירויות נמדדו ממנוע יציג סטרייצ&#39;י - זן נמחק מוצגת באיור 3 א </strong&gt;. המחיקות מבטיחות כי מנועי flagellar לא יכולים לעבור ולסובב בלעדי שעון (CCW). המהירות הממוצעת מ המנוע המסוים הזה הייתה 60 הרץ ואת מהירויות הנמדדות הן בקנה אחד עם דיווחים קודמים על מנועים קשורים עם 1 מיקרומטר חרוז 25. החרוז היה ממוקם ראשון בפינה הימנית התחתונה, כפי שניתן לראות סכמטי באיור 1B. מהירות הזוויתית המקבילה מוצגת באיור 3 ב (פנל עליון). מיצוב החרוז לפינה השמאלית התחתונה הסמוכה הביא היפוך של השלט על מהירויות מנוע (פנל תחתון). לפיכך, הזזת חרוז פינת סמוך תשתנה בכיוון הנצפה של סיבוב מנוע. בהקשר זה, באלכסון מול פינות זהות. לכן חיוני לדעת את המיקום של החרוז במהלך מדידות כדי לקבוע את דינמיקת המיתוג נכון. איור 3 ג תערוכות מעברים חוזרים ונשנים של מנוע wild-type בין שני כיווני הסיבוב. <html> קודים מותאמים אישית לתוכנות להרכשת נתונים הותאמו מעבודה לפני לתעד את הנתונים במחשב 15. תפוקת PMT היה AC מצמידים נמוך לעבור סינון עם תדר החיתוך של 100 הרץ. מעקב בזמן אמת היה מופעל על ידי חיבור התפוקות מסוננים אוסצילוסקופ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig1.jpg" /> איור 1: הגדרת חרוזי גשש. א) סכמטי של הגדרת המעקב המבוססת PMT. ב) המיקום האידיאלי של חרוז (יחסית שחור כדור) לשני החרכים המאונכים. המסלול מסומן על ידי קווים מקווקווים. הדואר האקסצנטרי הוא רדיוס המעגל המקווקו. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55240/55240fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ove_content &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig2.jpg" /> איור 2: יציאות PMT. א) נמוך לעבור סינון פלטים משני photomultipliers, לאחר מרכוז / קנה מידה. ב) מסלולי חרוז מתקבלים על פי נתוני PMT, שנדגמו מעל 3 שניות. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55240/55240fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55240/55240fig3.jpg" /> איור 3: מסלולי חרוז. א) היסטוגרמה של מהירויות CCW בלבד של מנוע נציג. B) מהירויות סיבוב של מנוע CCW בלבד צלם בפינה ימנית תחתונה (פנל עליון). מהירויות סיבוב של אותו המנוע כשהוא מוצב בפינה השמאלית התחתונה (פנל תחתון). C) </strong&gt; החליף בתוך מנוע wild-type נציג. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55240/55240fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions at JoVE.com

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Views.  Texas A&M University. Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Video: Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as language1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, memory11, and attention12 is underway worldwide involving adults, children and infants 3,4,13,14,15,16,17,18,19 with typical and atypical cognition20,21,22. The contemporary challenge of using fNIRS for cognitive neuroscience is to achieve systematic analyses of data such that they are universally interpretable23,24,25,26, and thus may advance important scientific questions about the functional organization and neural systems underlying human higher cognition.
Existing neuroimaging technologies have either less robust temporal or spatial resolution. Event Related Potentials and Magneto Encephalography (ERP and MEG) have excellent temporal resolution, whereas Positron Emission Tomography and functional Magnetic Resonance Imaging (PET and fMRI) have better spatial resolution. Using non-ionizing wavelengths of light in the near-infrared range (700-1000 nm), where oxy-hemoglobin is preferentially absorbed by 680 nm and deoxy-hemoglobin is preferentially absorbed by 830 nm (e.g., indeed, the very wavelengths hardwired into the fNIRS Hitachi ETG-400 system illustrated here), fNIRS is well suited for studies of higher cognition because it has both good temporal resolution (~5s) without the use of radiation and good spatial resolution (~4 cm depth), and does not require participants to be in an enclosed structure27,28. Participants cortical activity can be assessed while comfortably seated in an ordinary chair (adults, children) or even seated in mom s lap (infants). Notably, NIRS is uniquely portable (the size of a desktop computer), virtually silent, and can tolerate a participants subtle movement. This is particularly outstanding for the neural study of human language, which necessarily has as one of its key components the movement of the mouth in speech production or the hands in sign language. 
The way in which the hemodynamic response is localized is by an array of laser emitters and detectors. Emitters emit a known intensity of non-ionizing light while detectors detect the amount reflected back from the cortical surface. The closer together the optodes, the greater the spatial resolution, whereas the further apart the optodes, the greater depth of penetration. For the fNIRS Hitachi ETG-4000 system optimal penetration / resolution the optode array is set to 2cm. 
Our goal is to demonstrate our method of acquiring and analyzing fNIRS data to help standardize the field and enable different fNIRS labs worldwide to have a common background.

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Here we describe a data collection and data analysis method for functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS), a novel non-invasive brain imaging system used in cognitive neuroscience, particularly in studying child brain development. This method provides a universal standard of data acquisition and analysis vital to data interpretation and scientific discovery.

היכרות עם תפקודים קוגניטיביים אצל תינוקות, ילדים &amp; מבוגרים עם ספקטרוסקופית אינפרא אדום הקרוב

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.