אנו מודים לו Weixan לקבלת סיוע טכני בתרבות ובתחזוקה של מניות תא Sf9. LAY נתמכה על ידי מלגת לימודים לתואר שני מועצה למחקר רפואי (MRC). RJCG היה אוניברסיטת חברה מלכותית עמית מחקר. חטיבת אוקספורד לביולוגיה מבנית היא חלק ממרכז קרן Wellcome לגנטיקה אנושית, Wellcome Trust Core פרס גרנט מספר 090532/Z/09/Z.

פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שעכבר גן kindlin-3 (FERMT3) כבר שובט בהצלחה לתוך וקטור במורד הזרם של אמרגן P10 מאוחר מאוד וכי הווקטור בעל איגוף רצפי baculovirus להתיר רקומבינציה עם bacmid BAC10 KO: 1629 שפותח על ידי IM ג&#39;ונס ו עמיתים 28. עבור פרוטוקול זה, גן kindlin-3 שובט לתוך pOPINE 29 וניתן למצוא פריימרים והאסטרטגיה שיבוט משמשים מתוארים במקומות אחרים 12. פלסמיד מתוכנן כך שגן FERMT3 (kindlin-3) נמצא תחת השליטה של אמרגן baculoviral P10 ואת הווקטור מכיל 5 &#39;UTR/ORF603 וORF 1629 ו מקודד בטרמינל C-6-התג שלו לטיהור במורד הזרם 29. 1. תרבית תאי חרקים ותחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההגברה baculovirus רקומביננטי, תאי frugiperda Spodoptera מותאמים לתרבות השעיה (תאי Sf9) צריכיםלהיות מבוגר ומתוחזק. תאי חרקים תמיד צריכים להיות מטופל באמצעות טכניקות אספטיים במנדף ייעודי רקמת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות השעיה של תאי חרקים מודגרת בSF-900 השני (SFM) מדיום נוזלי סרום ללא תוספת פניצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין בצלוחיות ב27 ° C עם רועד ב100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טווח צפיפות תרבית תאי חרקים בין 1 x 06-01 אוקטובר x 10 7 תאים / מיליליטר על ידי פיצול ודילול תרבית התאים עם SF-900 השני תקשורת טריות. הערה: בריא תאים צריכים להיראות אחידים בגודל וצריכים להיות צורה כדורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים בנפח דגימה באמצעות hemocytometer ומיקרוסקופ אור כדי לחשב את צפיפות תאי התרבות. </li></ol> 2. דור של רקומביננטי baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולשמור על תאי Sf9 בהשעיה באמצעות SF-900 השני תקשורת בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר penicillin ו100 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מיליליטר. עבור דור baculovirus, צריכים להיות מתורבת תאי חרקים למגוון צפיפות של 5 x 10 5 - x 1 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע כ 1 x 10 6 תאי Sf9 לכל טוב של צלחת סטרילית 6 גם רקמות תרבות ב2 מיליליטר של SF-900 השני תקשורת בתוספת פניצילין 100 מיקרוגרם / מיליליטר ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. השאר את תאי Sf9 ב RT במנדף לדבוק בבסיס של בארות פלסטיק ובכך יוצר שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דור baculovirus רקומביננטי ידי cotransfecting DNA bacmid ופלסמיד דנ&quot;א על ​​תרבות שכבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל transfection, לערבב 1-2 מיקרוגרם של pOPINE-mFERMT3 מטוהר, אשר ברשותה ORF1629 אלמנטי baculovirus, עם 0.5 מיקרוגרם של KO BAC10 מטוהר: 1629 בשל SF-900 השני SFM 100 μl ללא אנטיביוטיקה (פתרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור נפרד, לדלל 6 μl של Cellfectin השני מגיב עם של SF-900 השני SFM 100 μl ללא אנטיbiotics עבור כל תגובת transfection (פתרון ב &#39;). &quot;תערובת הורים &#39;יכולה להיווצר כאן, לטיפול נוזל מופחת, אם transfections רבים נדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב את שני פתרונות (A ו-B, כ 200 μl) ו לדגור על RT עבור 20 דקות כדי ליצור מורכבות שומנים-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מתחמי שומנים בדם DNA עם 800 μl SF-900 השני SFM ללא אנטיביוטיקה. בזהירות לשאוב תקשורת monolayer תא Sf9 ו פיפטה בזהירות / B ותקשורת הפתרון על גבי monolayer Sf9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי transfected בחממה humidified על 27 ° CO / N ולהוסיף עוד 1 מיליליטר של SF-900 השני SFM ללא אנטיביוטיקה לכל תרבות monolayer למחרת. דגירה תאים ב27 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר baculovirus רקומביננטי ישירות מהתרבות בינונית (כ -2 מיליליטר בסך הכל) ולהעביר לצינור צנטריפוגות נקי (לדוגמא צינור פלקון 15 מיליליטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר כל debr תא Sf9הוא על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. מעביר את הנגיף, אשר הוא בsupernatant וכתוצאה מכך וכונה P1, לצינור וחנות נקי ב 4 ° C בחושך עד לשימוש. בשלב זה monolayer Sf9 הנותר ניתן להשתמש כדי להעריך את דור וירוס רקומביננטי על ידי הערכת הנוכחות של kindlin-3 רקומביננטי בתאי החרקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend monolayer עם 0.5 מיליליטר PBS ולדלל מדגם 10 μl עם כמויות שווה של חיץ טעינה-SDS 2x. מחממים את הדגימות ב&gt; 95 מעלות צלזיוס למשך דקות לפחות 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate את המדגם עבור 1 שניות במשרעת 10% באמצעות קצה מייקר sonicator אם זה צמיג מדי לטעינת ג&#39;ל ראויה. </li></ol></li></ol> 3. הגברה של רקומביננטי baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגברה של נגיף בהשעיה, השתמש צפיפות תאים של 1.4 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ואת זה צריך לכבוש 1/20 מכלל נפח הבקבוק (כלומר תרבות מיליליטר 50 בבקבוק 2 ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ההגברה של נגיף רקומביננטי על ידי הדבקה של תרבית תאי חרקים עם מניית ויראלי P1 בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 0.1 באמצעות הנוסחה הבאה; <img alt="" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" /> הערה: דור וירוס P1 ניתן להניח שיש כייל נגיף צפוי של 1 x 10 7 מיליליטר / pfu. עם זאת, assay פלאק יכול להתבצע לפני שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבות החרקים שנדבקה ב-P1 ב27 ° C עם הרועד בסל&quot;ד 100 במשך 3 ימים (72 hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את הווירוס על ידי הפרדת התאים מהתקשורת על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. שמור את התא גלולה וכתוצאה מכך בשלב זה לאישור לייצור וירוס רקומביננטי על ידי הערכת kindlin-3 ביטוי חלבון על ידי-SDS ומערבי סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התקשורת מועשרת וירוס הבהירה לצינור נקי ולאחסן ב 4 ° C בהחושך עד לשימוש. מניית ויראלי זה מסומן כמו P2. הערה: כייל נגיף של 2 x 10 8 מיליליטר pfu / (או שיעור הגברה של 100 pfu / תא) יכול להיות צפוי. </li></ol> 4. ביטוי של kindlin-3 בSf9 Infected-baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בנפח מספק של תרבויות תאי Sf9 בהשעיה בSF-900 השני SFM בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, לפני בקנה מידה גדולה kindlin-3 ביטוי רקומביננטי לטיהור. דגירה תרבויות ההשעיה ב27 ° C עם רועד ב100 סל&quot;ד ועם סך תרבות נפח: בקבוקון יחס נפח של 1:05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תרבויות השעיה של Sf9 בצפיפות של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסף תרבויות Sf9 עם ריכוז סופי של 1% (v / v) בסרום שור העוברי (FBS) אחריו עם וירוס Amplified רקומביננטי (מניית P2 ויראלית) לתת הפנים של 1. דגירה התרבויות נגועה ב27 ° C עם רועד ב100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> recombina קצירNT kindlin-3-CHIS 6-לבטא בתאי Sf9 לאחר זיהום 72 שעות על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 &#160; ותא גלולה וכתוצאה מכך מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש, או -80 ° C לאחסון ארוך טווח. </li></ol> 5. טיהור של רקומביננטי Kindlin-3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא חרקים הפשרה קפוא נגוע baculovirus (Sf9) להביע kindlin-3 רקומביננטי על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה מופשר עם חיץ תמוגה (50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), בתוספת מעכבי פרוטאז קוקטייל ללא EDTA ו1,000-2,000 U של DNase1. הערה: לחלופין, פוספט שנאגרו מלוח שונה (PBS) יכול לשמש גם, שבו ריכוז NaCl מותאם ל500 מ&quot;מ כדי למנוע אינטראקציות ספציפיות בין חלבונים אנדוגניים Sf9 תא ועמודת זיקת מתכת המשותקת המשמשת לטיהור במורד הזרם (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים על ידי דוגרים תאי resuspended עם חומר הניקוי וvortexing. Sonicate (משרעת 40%, 10 מחזורים של 10 דופק שניות אחריו 10 קירור שניות) לדוגמא עבור הפרעה תא נוספת באמבט קרח או לחלופין להשתמש homogenizer Dounce. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את lysate ידי צנטריפוגה ב48,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C. טען את supernatant וכתוצאה מכך על עמודת HisTrap (5 מיליליטר עמודת נפח), טרום equilibrated עם מאגר תמוגה, על 4 מעלות צלזיוס בשיעור של 1 מיליליטר / דקה. הערה: לחלופין, lysate הבהיר ניתן הודגרו עם 1-5 מיליליטר מיטת נפח של חרוזים sepharose ניקל equilibrated מראש (למשל Ni Sepharose 6 זרימה מהירה) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות. טור של sepharose Ni יכול להיווצר אחרי הצעד המחייב באמצעות זרימה הכבידה עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם 10 כרכי טור של חיץ לשטוף (50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 500 mM NaCl, 10 imidazole מ&quot;מ) כדי להסיר חלבונים מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשיפוע ליניארית imidazole 10-500 מ&quot;מ בשיעור של 10 מ&quot;מ / מיליליטר (או בכרכי טור 10) באמצעות FPLC תקטע לelutekindlin-3-CHIS הכפות רקומביננטי 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fractionate elution ל0.5-1 מיליליטר שברים באמצעות FPLC יקטע, עם אלה שברים המכילים kindlin-3-CHIS 6 בדרך כלל משחררי בריכוז imidazole של 300 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הרכב החלבון של eluant ידי-SDS ולpurifications לראשונה לאשר ידי מערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי-6 או אנטי עכבר נוגדן kindlin-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה שברים המכילים kindlin-3 וחיץ תמורה ל20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 מ&quot;מ NaCl באמצעות סדרה של דילולים לחיץ וריכוזי מדגם באמצעות רכז חלבון צנטריפוגלי עם חתוכי 50 משקל מולקולרי kDa (MWCO) ב 4 ° C. הערה: לחלופין, dialyze פתרון החלבון באמצעות Slide-A-lyzer דיאליזה קלטת עם MWCO של 30 kDa על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לO / N ל20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 מ&quot;מ NaCl. הערה: לחילוף יונים (ראה בהמשך) ריכוז נמוך יותר של NaCl, <eמ &#39;&gt; כלומר 50 מ&quot;מ, יכול להיות והיה בשימוש כבר בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישם את הפתרון בחלבון החליף חיץ על עמודת equilibrated מראש HiTrap הפרין HP (5 מיליליטר עמודת נפח) באמצעות FPLC יקטע בשיעור של 0.5 מיליליטר / דקה. הערה: kindlin-3 כפות הוא eluted באמצעות שיפוע ליניארית NaCl (0.2 M NaCl ל1 M NaCl) באותו החיץ, גדל בקצב של 10 מ&quot;מ / מיליליטר. Kindlin-3-CHIS6 צפוי elute ב ~ 0.6 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fractionate elution ל0.5-1 מיליליטר שברים ולהעריך את הרכב החלבון ידי-SDS ומערבי סופג, אם מתאים. הערה: אפשר לצפות טוהר חלבון של קרוב ל 95%, כפי שהוערך על ידי-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברים בריכה המכילים kindlin-3 ולהתרכז באמצעות רכז חלבון צנטריפוגות עם kDa MWCO 50 עד נפח סופי של 0.5-2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב אחרון, למרק את החלבון המרוכז וחיץ להחליף את החלבון באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל החלבון מטוהר על סוperdex S200 (16/60) או (10/30) מראש equilibrated ב20 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT בשיעור של 1 מיליליטר / דקה או 0.5 מיליליטר / דק &#39;תלוי בגודל עמודה בשימוש. הערה: כרומטוגרפיה הדרת גודל יכולה גם להתבצע בפוספט שנאגרו מלוח (PBS) במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את החלבונים על פי גודל על ידי יישום חיץ על הטור בשיעור של 1 מיליליטר / דקה או 0.5 מיליליטר / דקה, תלוי בגודל עמודה בשימוש. הערה: חלבון משחררי מהעמודה הוא מופרד ופיקוח באמצעות הספיגה ב 280 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא ספיגת אחת צריך להיות צפוי מ- SEC, שהוא מופרד והוערך על ידי-SDS כדי לקבוע הומוגניות, והוא בדרך כלל&gt; 95% טהורים לאחר שלב זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז מטוהר kindlin-3-CHIS 6 באמצעות רכז חלבון צנטריפוגות עם kDa MWCO 50 ל~ 15 מ&quot;ג / מיליליטר, כפי שהוערך spectrophotometrically באמצעות מקדם מחושב הכחדה (ε) של 109,320 M -1 cm -1 &lt;/ Sup&gt; (בהנחה שכל שאריות ציסטאין מופחתות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסון ב-20 מעלות צלזיוס ואחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס, aliquot החלבון לתוך צינורות PCR ופלאש להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי. לחלופין, את החלבון ניתן להשתמש ישירות לחקירה תוך שימוש במספר הטכניקות ביוכימיות וbiophysical. </li></ol>

<ol>
	<li>Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+of+integrins,+talin,+and+kindlins.">The tail of integrins, talin, and kindlins.</a> Science. 895, 899 (2009).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin+2+forms+a+transcriptional+complex+with+&#946;-catenin+and+TCF4+to+enhance+Wnt+signalling.">Kindlin 2 forms a transcriptional complex with &#946;-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling.</a> EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin+2+promotes+breast+cancer+invasion+via+epigenetic+silencing+of+the+microRNA200+gene+family.">Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family.</a> Int J Cancer. , (2013).</li><li>Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kindlin+protein+family:+new+members+to+the+club+of+focal+adhesion+proteins.">The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins.</a> Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).</li><li>Siegel, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+kindlin-1,+a+human+homolog+of+the+Caenorhabditis+elegans+actin-extracellular-matrix+linker+protein+UNC-112,+causes+Kindler+syndrome.">Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).</li><li>Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kindlin+3+PH+domain+has+an+essential+role+in+integrin+LFA-1-mediated+B+cell+adhesion+and+migration.">The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+Kindlin-2+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation.">Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-2+regulates+podocyte+adhesion+and+fibronectin+matrix+deposition+through+interactions+with+phosphoinositides+and+integrins.">Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins.</a> J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).</li><li>Yates, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Characterisation+of+the+Kindlin-1+Pleckstrin+Homology+Domain.">Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).</li><li>Bouaouina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+lipid-binding+loop+in+the+kindlin+FERM+F1+domain+is+required+for+kindlin-mediated+&#945;IIb&#946;3+integrin+coactivation.">A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated &#945;IIb&#946;3 integrin coactivation.</a> J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).</li><li>Goult, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+N-terminus+of+kindlin-1:+a+domain+important+for+AlphaIIbBeta3+integrin+activation.">The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation.</a> J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).</li><li>Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Analysis+of+Kindlin-3+Reveals+an+Elongated+Conformation+and+Maps+Integrin+Binding+to+the+Membrane-Distal+&#946;-Subunit+NPXY+motif.">Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal &#946;-Subunit NPXY motif.</a> J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).</li><li>Anthis, N. J., Campbell, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+of+integrin+activation.">The tail of integrin activation.</a> Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).</li><li>Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-1+and+-2+directly+bind+the+C-terminal+region+of+beta+integrin+cytoplasmic+tails+and+exert+integrin-specific+activation+effects.">Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects.</a> J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).</li><li>Tadokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+binding+to+integrin+beta+tails:+a+final+common+step+in+integrin+activation.">Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation.</a> Science. 302, 103-106 (2003).</li><li>Garcia-Alvarez, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+integrin+recognition+by+talin.">Structural determinants of integrin recognition by talin.</a> Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).</li><li>Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+of+the+N-terminal+ubiquitin-like+domain+of+kindlin-2+is+crucial+for+its+regulation+of+integrin+activation.">Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation.</a> Structure. 19, 1664-1671 (2011).</li><li>Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kindlins:+subcellular+localization+and+expression+during+murine+development.">The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development.</a> Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).</li><li>Bialkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+co-activator+Kindlin-3+is+expressed+and+functional+in+a+non-hematopoietic+cell,+the+endothelial+cell.">The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell.</a> J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).</li><li>Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-3+is+essential+for+integrin+activation+and+platelet+aggregation.">Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation.</a> Nat. Med. 14, 325-330 (2008).</li><li>Lefort, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+talin-1+and+kindlin-3+in+LFA-1+extension+and+affinity+regulation.">Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation.</a> Blood. 119, 4275-4282 (2012).</li><li>Moser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-3+is+required+for+beta2+integrin-mediated+leukocyte+adhesion+to+endothelial+cells.">Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells.</a> Nat. Med. 15, 300-305 (2009).</li><li>Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-3-mediated+signaling+from+multiple+integrin+classes+is+required+for+osteoclast-mediated+bone+resorption.">Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption.</a> J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).</li><li>Malinin, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+in+KINDLIN3+ablates+activation+of+three+integrin+subfamilies+in+humans.">A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans.</a> Nat. Med. 15, 313-318 (2009).</li><li>Svensson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion+deficiency-III+is+caused+by+mutations+in+KINDLIN3+affecting+integrin+activation.">Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation.</a> Nat. Med. 15, 306-312 (2009).</li><li>Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+kindlin-2+PH+domain+reveals+a+conformational+transition+for+its+membrane+anchoring+and+regulation+of+integrin+activation.">Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation.</a> Protein Cell. 3, 434-440 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+kindlin-2+protein+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation.">Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li><li>Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+baculovirus+recombination.">Improving baculovirus recombination.</a> Nucleic Acids Res. 31, (2003).</li><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ligation-independent+cloning+method+suitable+for+high-throughput+expression+screening+applications.">A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications.</a> Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J Struct. Biol. 172, 55-65 .</li><li>Wasilko, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).</li><li>Yates, L. A., Fleurd&#233;pine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+the+activity+of+a+cytoplasmic+RNA+terminal+uridylyl+transferase.">Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).</li><li>Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+CrgA,+a+LysR-type+transcriptional+regulator+from+pathogenic+Neisseria+meningitidis+MC58.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58.</a> Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+adhesion+and+migration+by+Kindlin-3+cleavage+by+calpain.">Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain.</a> J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 .</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מערכות ביטוי baculovirus הופכות פופולרית יותר ויותר ומהווה כלי חשוב לייצור של כמויות מיליגרם של חלבון רקומביננטי לאפיון חלבונים באמצעות מחקרי biophysical, כולל קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן. למרות היותו יותר בניסוי דורש מערכות ביטוי baculovirus מציעות מספר יתרונות על פני א coli שהאחד מהם היא סביבה כמעט טבעית לחלבונים ממוצא אוקריוטים למשל הנוכחות של מלווים והזדמנות לשינוי שלאחר translational המתאימים. במסגרת המאמצים שלנו כדי להביע את kindlin-3, מארחים ביטוי חלופיים שימשו כוללים תא קווי יונקים וזני ביטוי חיידקים (תצפיות לא פורסמו). באופן כללי, א &#39;רבות coli זנים שנבדקו הפיקו כמויות קטנות מאוד של kindlin-3 רקומביננטי (~ 0.5 מ&quot;ג / ליטר של תרבות; תצפיות לא פורסמו). עם זאת, הביטוי מונע baculovirus בתאי חרקים היה יעיל במיוחד, ובשיתוףmparison לביטוי חולף בתאי יונקים, נוחים יותר ליצירת ביומסה הגדולה הנדרשת לבידוד מיליגרם של חלבונים רקומביננטיים cytoplasmic (תצפיות לא פורסמו). אנו משערים כי המלווים אוקריוטים הנוכחות עשויים לאפשר ייצור יעיל של kindlin-3. Baculoviridae להדביק תאי חרקים ולביטוי חלבונים רקומביננטיים baculovirus המשמש בעבודה זו מבוסס על Autographa californica וירוס polyhedrosis גרעיני (AcNPV). בטבע AcNPV, אשר מדביק californica Autographa (lopper אספסת) זחלי חרקים, דורש חלבון polyhedrin כדי ליצור חסימות לפי virons כמוסות במטריצת גבישי חלבון ובכך לספק את ההגנה הנדרשת לשחרורם. בתאים בתרבית היווצרות של גופי חסימה אינה נדרשת לשכפול ולכן הוא מיותר. במקרה של ביטוי חלבונים זרים גן חלבון polyhedrin יכול להיות replaced בAcNPV רקומביננטי עם הגן לחלבון של עניין. AcNPV יכול להדביק מיני Lepidopteron אחרים ולמטרות של frugiperda Spodoptera תולעת צבא ביטוי חלבון רקומביננטי תאי השחלה גלמים משמשים. בגישה שתוארה כאן, bacmid AcNPV (BAC10) מתוכנן כך שגן חיוני נגיפי, ORF1629, הוא מומת על ידי ההחדרה של transferase אצטיל כלורמפניקול וכתוצאה מכך bacmid עקום החוצה (BAC10: KO 1629), כך שזה לא מסוגל ליצור baculovirions זיהומיות 28. Cotransfection של תאי Sf9 עם BAC10 ינארית: KO 1629 ו תיקוני וקטור ההעברה FERMT3 המכיל ORF1629 פעיל, באמצעות טרנספוזיציה, וכתוצאה מהגנום קיימא שגם שילב את גן FERMT3 תחת השליטה של אמרגן polyhedrin 28. אנו מתארים פרוטוקול טיהור לבידוד של עכבר רקומביננטי טהור מאוד kindlin-3 דרך threגישת chromatographic צעד דואר. השיטות המשמשות כאן בקלות יכולה להיות מיושמות על חלבונים מתויגים-אחרים. אנחנו עובדים צעד חילוף יונים לטהר kindlin-3 נוסף אך אנו מאמינים כי מדובר בצעד פסאודו זיקה נוספת כמו kindlin-3 הוא בעל מספר גדול של שאריות בסיסיות, כוללים מתיחת poly-ליזין בתחום F1 שלה. בנוסף, kindlin-3 נחשב להיקשר ולאינטראקציה עם הפנים cytoplasmic של קרום הפלזמה, שבו הוא מתפקד, ולכן אנו צופים כי באשכולות של שאריות בסיסיות יאפשר את החלבון כדי לסתור את הממברנה הטעונה השלילי. המאגרים מתוארים בפרוטוקולים הטיהור נחשבים סטנדרטיים ומשמשים לעתים קרובות בביולוגיה מבנית. Assay thermofluor (איור 5) מראה כי kindlin-3 הוא יציב ברוב תנאי חיץ מעל pH 6.0. זה היה שימושי במיוחד וחשוב ליידע הניסויים שלנו כאשר לומדים kinldin-3: β1אינטראקציה זנב על ידי תמ&quot;ג, אשר הניב ספקטרום מצוין ב-pH 6.1 עם ריכוזים נמוכים של 12 NaCl. לפני שניתן יהיה התחייב כל מחקר biophysical, חשוב על מנת להוכיח כי החלבון מטוהר של עניין הוא אכן נכון מקופל והוא מבחינה תפקודית פעיל. בפרסום קודם הראינו כי kindlin-3 רקומביננטי הביע ומטוהר בשיטה זו הייתה מונומר וmonodispersed בפתרון, כפי שהוערך על ידי כרומטוגרפיה גודל הדרה, פיזור אור דינאמי, ultracentrifugation אנליטיים ופיזור קרני רנטגן בזווית קטן, והיה גם מסוגל מחייב והכרת NPxY קרום דיסטלי ואשכול סרין / תראונין במעלה הזרם של זנבות cytoplasmic 1A β 14, ובכך אישר כי הוא מתנהג כמו חלבון ילידים, אשר עולים בקנה אחד עם מחקרים סלולריים ופיסיולוגיים קודמים 14,20,22. שימוש assay יציבות תרמית הוא דרך נוספת של מציע הדואר קיפול נכון של חלבון של עניין, כמו חלבון מקופל בצורה לא נכונה יגרום רקע הקרינה גבוה בשל שאריות הידרופובי חשופות. משפחת kindlin של חלבונים הייתה במוקד תשומת לב רב מאז תפקידם בלתי צפוי כמו coactivators החיוני של integrins in vivo התגלה. זה מופעל מאמץ רב כדי לבטא אותם recombinantly ולפתור המבנים שלהם. עד כה הצלחה מוגבלת כבר דיווחה בהבעת כמויות מיליגרם של חלבון רקומביננטי באורך מלא, אבל יש לנו כאן תאר את השימוש במערכת baculovirus המאפשרת ביטוי בקנה מידה גדולה ברמות שבו המחקרים מבניים הפכו אפשריים. על ידי יצירת כמויות גדולות של kindlin-3 רקומביננטי אנו צופים כי זה יסייע במחקרים נוספים של חלבון זה. העבודה בשיטה וטיהור מונע baculovirus המתואר כאן לkindlin-3 עכבריים רקומביננטי יכול לשמש גם כדי להביע ולטהר isoforms kindlin האחר, שגם הם קשים להביע וגם להחזיק משתרעים poly-ליזין, ועשוי להיות מותאם יותר לחלבוני cytoplasmic אחרים, כגון חלבונים מחייבים חומצות גרעין, שאינם מצליחין לבטא בזני חיידקים.

חלבונים ממשפחת kindlin הם מרכיב חיוני של הרכבה הידבקות מוקד, ולכן חיוני לחיים מורכבים. Kindlins, אשר יש 3 isoforms ביונקים (kindlin-1, kindlin-2, וkindlin-3), נחשב coactivators של integrins קולטנים תאי לצד ילין 1. הידבקות תא בתיווך Integrin מחברת את תא השטח למטריצה ​​תאית (ECM) באאוקריוטים גבוהים יותר. זהו תהליך קריטי ונפוץ בשפע של תופעות פיסיולוגיות, הכוללות שלמות רקמות, עובר, מטבוליזם של עצם, עצירת דימום, וחסינות. הידבקות תא בתיווך Integrin מופעלת באמצעות מבפנים החוצה הולכים אותות באמצעות הקשירה של תלין וkindlin לזנבות β-למקטע integrin cytoplasmic (CTS) במוטיבי NPxY שימור שלהם. החשיבות של חלבונים ביו kindlin משתרעת עם זאת ככל הגרעין, שבי kindlin-2 הוכח בכמה דיווחים אחרונים להיות מעורבים בשעתוקאל לשלוט 2,3. Kindlins הם חלבוני multidomain של כ 75 kDa, בסימן החזקה של Ferm bipartite טרמינל C-(4.1 להקה, ezrin, radixin, moesin) תחום, שנקטע על ידי הומולוגיה pleckstrin תחום (PH) במרכזה של משנה F2 4,5. מחקרים של תחומים kindlin-2 וkindlin-3 PH הראו כי הוא נקשר לphosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphate וphosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate 6-8 השליחים שני שומנים בדם. עם זאת, מחקרים של תחום PH kindlin-1 מראים כי הוא נקשר לPtdIns P (3,4,5) 3 עם זיקה הרבה יותר נמוכה, שיכול להיות מוסבר בkindlin-1 על ידי גשר מלח איזופורם ספציפי מניעת שומנים מלהיקשר 9. בנוסף, יש לולאה ~ 100 חומצת אמינו מוכנסת לתוך תחום F1 של kindlins שצפוי להיות פרש אבל נקשר phosphatidylserine בעלון הפנימי של קרום הפלזמה 10,11. Ferm kindlinתחום נחשב הומולוגי לתחום Ferm ילין, אם כי תחום Ferm ילין לא מחזיק תחום הומולוגיה pleckstrin. kindlins ונלין גם אינטראקציה עם מוטיבים NPxY על β-זנבות integrin דרך אזור F3 של תחום Ferm, אבל kindlin נקשר למוטיב דיסטלי הקרום, בעוד תלין מטרות הפרוקסימלי קרום אחד 12-16. Kindlins וילין שני בנוסף יש תחום F0 N-מסוף עם קיפול כמו היוביקוויטין-כי הוא לא נמצא בחלבוני Ferm אחרים 11,17. מחקרים על תחום F0 של kindlin-2 הראו כי הוא באופן עצמאי נקשר לממברנות מועשרים phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate 17. Kindlins מפגין דפוסי paralogue ספציפי רקמות ביטוי ופונקציות פיסיולוגיות nonredundant. Kindlin-1 בא לידי ביטוי בעיקר באפידרמיס, אלא גם במידה פחותה יותר במעי הגס, קיבה והכליות; kindlin-2 מתבטאים בכל מקום באבל מרוכזת במפוספס וחלקשרירים והם kindlin רק בא לידי ביטוי בהתפתחות עוברית 4; וkindlin-3 באו לידי ביטוי ברקמות hematopoietic עם הריכוז הגבוה ביותר של kindlin-3 נמצא בmegakaryocytes 18. עם זאת, מחקרים מאוחרים יותר הראו כי חלבון פונקציונלי באו לידי ביטוי, כמו גם 19 ברקמות האנדותל. Kindlin-3 הוא עניין רפואי אקוטי בשל התפקיד הפיזיולוגי החשוב שלה בדם. זה קריטי לאגרגציה של טסיות דם ומתפשט במהלך היווצרות פקיק 20, מתגלגל לויקוציטים בתגובה לזיהום ודלקת 21,22 והיווצרות podocyte osteoclast בספיגת עצם 23. יתר על כן, דלדול של kindlin-3 בבני האדם מוביל לויקוציטים הידבקות מחסור מסוג III - מחלה המאופיינת על ידי הפרעות דימום מסכני חיים וזיהומים חיידקיים חוזרים 20,24,25. מחקרים עקום החוצה Kindlin-3 בעכברים גילו את הפונקציה חיונית של החלבון בתא הידבקות KIND3 -. / - עכברים להציג פנוטיפים שונים, כגון דימום חמור בשל integrins פעילה טסיות דם, osteopetrosis החמור, והידבקות לויקוציטים לקויה 20,22, שמזכירים תסמינים בבני אדם חסרי kindlin-3. נתונים מבניים ברזולוציה גבוהה על kindlins, עד כה, הוגבל לתחומי משנה בודדים כגון ההומולוגיה pleckstrin תחום (PH) של kindlin-1 9 וkindlin-2 26,27 ותחום F0 של kindlin-1 11 וkindlin -2 17. רוב תחומי המשנה של כל פוליפפטיד kindlin יש אולם התנגד לשיבוט וניתוח מבני (ייטס וגילברט, תצפיות לא פורסמו), ומחקרים של החלבונים באורך מלא שהתעכבו בשל הקושי להביע וטיהור כמויות מספיקות באמצעות E. coli (תצפיות לא פורסמו וHarburger et al. 14). יש עניין רפואי רב בkindlin-3 ופו שלהnction, לצד שני בני משפחה האחרים, ולאחרונה נוצרו כמויות מיליגרם שלו על ידי ביטוי רקומביננטי בתאי frugiperda Spodoptera מונעים על ידי זיהום baculovirus 12. לפיכך, אנו כאן מתארים שיטות לייצור כמויות מיליגרם של kindlin-3 עכבר רקומביננטי בתרבית תאי חרקים, מתאימות למחקרים מבניים מקיפים וניתוח ביוכימי. בפרוטוקול זה אנו עושים שימוש bacmid מהונדס נוקאאוט (BAC10 KO: 1629) כלומר, לבד, לא מסוגל לייצר ויריונים קיימא 28. ה-DNA הנגיפי הוא חולץ ובכך על ידי רקומבינציה עם וקטור העברה כי במקרה זה כולל גם את גן kindlin-3 (FERMT3) ותוצאות בגן FERMT3 החלפת הווירוס מאוחר מאוד גן, אשר בא לידי ביטוי מאוד אבל מיותר, וכתוצאה מכך רקומביננטי וירוס שמבטא kindlin-3 העכבר כחלק ממחזור החיים של נגיף 28. זיהינו זהשיטה לייצור kindlin-3 לאחר הניסיונות להביע ולטהר אותו במארחי ביטוי אחרים היו קשים להחריד (תצפיות לא פורסמו), אלא גם בשל צדדיות של חבילת וקטור pOPIN, שבו השתמשה לשיבוט ושניתן לפרוס בביטוי רבים מארח 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1147">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid</td>
			<td style="width:123px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td style="width:439px;">store at 4&#176;C and warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td style="width:123px;">InVitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Streptomycin Sulphate (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>S0148</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Penicillin G, potassium salt (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>P0580</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td>Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HisTrap FF (5ml)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-5286-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HiTrap Heparin (5ml)</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-0407-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td style="width:439px;">15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies

Kindlins הוא coactivators חיוני, עם תלין, של integrins קולטני תא השטח וגם להשתתף בintegrin מחוץ-באיתות, והבקרה של שעתוק הגנים בגרעין התא. Kindlins הם ~ 75 חלבוני multidomain kDa ולהיקשר למוטיב NPxY ואשכול T / S במעלה הזרם של זנב cytoplasmic β-למקטע integrin. איזופורם hematopoietically החשוב kindlin, kindlin-3, הוא קריטי לאגרגציה של טסיות דם במהלך היווצרות פקיק, ויקוציטים מתגלגלים בתגובה לזיהום ודלקת והיווצרות podocyte osteoclast בספיגת עצם. התפקיד של Kindlin-3 בתהליכים אלה הביא למחקרים סלולריים ופיסיולוגיים רבים. עם זאת, יש צורך בשיטה יעילה של רכישת כמויות מיליגרם באיכות גבוהה של החלבון למחקרים נוספים. פיתחנו פרוטוקול, שתואר כאן, לביטוי והטיהור יעילים של kindlin-3 העכברי רקומביננטי על ידי שימוש בbaculovirus-dמשוסע מערכת ביטוי בתאי Sf9 מניב כמויות מספיקות של חלבון באורך מלא גבוה טוהר כדי לאפשר אפיון biophysical. אותה הגישה יכולה להילקח במחקר של isoforms kindlin יונקים האחר.

הביטוי בקנה מידה הגדולה של kindlin-3 עכבר רקומביננטי באמצעות תאים שנדבקו ב-Sf9 baculovirus יכול לקחת פחות משבועיים כדי להשיג כמויות מיליגרם, כפי שמודגם באיור 1 א סכמטי ודורש רק כמות קטנה מאוד של ה-DNA פלסמיד מערכת QIAprep Miniprep, עבור ירושלים. הדור של baculovirus רקומביננטי מושגת על ידי cotransfecting תאי Sf9 עם עכבר kindlin-3 (FERMT3) המכיל פלסמיד יחד עם מהונדס bacmid היא לינארית (BAC10: KO 1629) וקציר ויריונים שהוקמו אחרי 5-7 ימים, כפי שמוצג באיור 1 א. שיטה זו של תוצאות דור baculovirus בוירוסי רקומביננטי 100% ובעצם מוותרת על הצורך ב28,30 טיהור פלאק. תרבות נציג בקנה מידה קטנה (2 monolayer מיליליטר) תפיק פתרון המכיל וירוס רקומביננטי עם כייל צפוי ויראלי של יוצרי יחידות 1 x 10 7 פלאק (pfu) לכל מיליליטר שלתרבות. אחד יכול לבצע assay פלאק כדי לקבוע את כייל הנגיף בפועל אבל זה אולי גם עתיר עבודה, כאשר מספר גבוה של מבנים, נבחן צורך במחקרים מבניים. ההצלחה של צעד דור וירוס ניתן להעריך באמצעות פלסמיד המכיל eGFP במקביל, או, לkindlin-3 מבנה זה, monolayer Sf9 ניתן resuspended ב PBS והוערך על ידי SDS-PAGE ומערבי סופג, אשר בדרך כלל מדגים להקה ברורה המקביל לחלבון שלו מתויג 75 kDa, כפי שמוצג באיור 1. הווירוס מוגבר לאחר מכן לייצר כמויות מספיקות עבור בקנה מידה גדולה (כרכי ליטר) זיהום תא חרק ובידוד חלבון רקומביננטי. הווירוס השני המעבר (P2) נוצר על ידי הדבקה של תרבויות השעיה עם משרד הפנים משוער של 0.1 (ראה פרוטוקול). זה חיוני כי תרבות ההשעיה ההגברה Sf9 תופסת רק עשרים בסך הכל הבקבוק בנפח. אוורור נוסף זו מבטיח כי vir כתוצאהמדיה מכילה, שנקטפו לאחר 3 ימים (72 שעה) לאחר פגיעה, תפיק כמויות מספיקות של kindlin-3 בתרבות הביטוי לאחר מכן. המניה מוגברת הווירוס (P2) הנחה היא להחזיק כייל נגיף צפוי של 2 x 10 8 מיליליטר / pfu מבוססים על הערכה שמרנית של 100 pfu / תא באמצעות צפיפות תאים של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ביום 31 בהגברה. באופן כללי, לייצור הגברה baculovirus אופטימלית וחלבון, תאי Sf9 צריכים להיות אחידים בגודלם וכדורי, כפי שמוצגים באיור 1 ג. בנוסף, ביטוי הגברה וחלבון נגיפי הוא מקסימאלי ב72 לאחר זיהום משאבי אנוש, ושניהם מופחתים באופן משמעותי ב96 לאחר זיהום משאבי אנוש. ברגע שוירוס כבר מוגבר ונהג להדביק תאי Sf9 בניסויים בקנה מידה גדולים kindlin-3 רקומביננטי הוא מטוהר באופן חלקי מכוח chro המהונדס בטרמינל C-6-התג באמצעות משותק זיקת מתכתmatography, כפי שמוצג באיור 2. חשוב לבצע את הטיהור על 4 מעלות צלזיוס וכי מעכבי פרוטאז מספיק נוספו כדי למנוע proteolysis. Kindlin-3 באופן חלקי המטוהר מטוהר נוסף להומוגניות קרובה על ידי כרומטוגרפיה חילוף יונים (IEC) באמצעות טור הפרין, כפי שמוצג באיור 3. אנחנו עובדים על השימוש בטור הפרין במקום עמודת מטבע יונית קונבנציונלית, כפי שחזינו כי המספר הגדול של שאריות בסיסיות, כולל מתיחת poly-ליזין בתוך תחום F1 kindlin-3, הייתי אינטראקציה חזקה עם מטען השלילי קבוצות סולפט של העמודה. אסטרטגיה זו היא שימושית במיוחד עבור ה-DNA וחלבונים קושרי RNA עם תיקונים מחייבים חומצות גרעין בסיסיים, למשל המסוף מחייב RNA uridylyltransferase Cid1 32. לבסוף kindlin-3 טוהר הוא &quot;מלוטש&quot; על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל להסיר אגרגטים ולהשיג הומוגניות, כפי שמוצג באיור 4. המאגרים שצוינו בפרוטוקולים הם מאגרים סטנדרטיים המשמשים לעתים קרובות בטיהור חלבונים לניתוח מבני. באופן כללי, מאגרים על בסיס פוספט, הם נמנעו לטיהור חלבונים למחקרים מבניים, במיוחד הקרנת התגבשות עקב היווצרות של גבישי פוספט בטיפי ההתגבשות (במיוחד עבור ניסויים על 4 מעלות צלזיוס). עם זאת, ביצענו assay משמרת תרמי מבוססת Thermofluor כדי לקבוע אילו מאגרים היו ייצוב לkindlin-3, כפי שמוצג באיור 5. בקצרה, פתרון חלבון מטוהר מדולל למאגרים שמכסים טווח של ריכוזי כלוריד pH ונתרן, ולכן יוצר מסך 2 ממדים. ההיתוך של החלבון נמדד על ידי התבוננות את הקרינה מצבע Sypro הכתומה (בדיקות מולקולריות), שנקשר לשאריות הידרופובי בתוך ליבת החלבון המקופלת, מעל C ° 20-95 טווח טמפרטורות (293-368 K). טמפרטורת נקודת האמצע שבו בהחלבון דואר נפרש (טמפרטורת מעבר, T מ &#39;) חושב באמצעות תוכנת Opticon הצג והוא מתוארת במקומות אחרים 33. Kindlin-3 נצפה להיות יציבים בריכוזים גבוהים של נתרן כלורי (500 מ&quot;מ) בטווח pH 7.0-9.0, עם טמפרטורה עקבית מעבר (T מ) 55 ° C. כמו כן, ציין כי מ &#39;T של Kindlin-3 היה כ 55 ° C בטווח pH 7.0-7.5 ללא קשר לריכוז נתרן כלורי. מצאנו שיש proteolysis המוגבל של kindlin-3 במהלך הטיהור אבל SDS-PAGE ניתוח של חלבון מרוכז מאוד (~ 15 מ&quot;ג / מיליליטר) הראה זיהום מוגבל עם שני פוליפפטידים נוספים של עוצמה שווה. באופן מוזר, עם זאת אין כל אינדיקציה של מינים נוספים של כרומטוגרפיה הדרת גודל, כפי שמוצג באיור 4. וכך הוא חשב כי חלבון חתוכות ידי פרוטאזות אך נשאר מקופל וhydrodynאין להבחין amically מחלבון באורך מלא. מעניין, calpain הוא פרוטאז ידוע כי דבק kindlin-3 בTyrosine373, שהוא בלולאת β1-β2 של ההומולוגיה pleckstrin תחום (PH) 34 ועשויים להסביר את התצפיות שלנו. יתר על כן, מערבי סופג מגלה כי אחד מכפילויות פוליפפטיד בעל טרמינל C-התג שלו והמשקל המולקולרי לכאורה של כפיל, כאשר סיכמו, שווה 75 kDa, אותו המשקל מולקולרי של החלבון המקורי. התשואה של kindlin-3 המטוהרים רקומביננטי לליטר של תאי Sf9 (~ משקל תא 2 ז) היא, במקרה הטוב, 5 מ&quot;ג. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> איור 1. סקירת סקירה של ביטוי חלבון Heterologous נגוע baculovirus תאי חרקים. () schematized של generatio baculovirusn וביטוי של kindlin-3 בתאי Sf9. בשרטוטי וקטור ה-DNA, 5&#39;UTR / ORF603 הוא בצבע באדום, ORF1629 הוא בצבע ירוק וב, את הגן של החלבון של עניין (POI) הוא בצבע כחול. (ב) כתם מערבי, באמצעות נוגדן 6 נגדו, של שש תרבויות (2 monolayer מיליליטר) בקנה מידה קטנה (נתיבים מסומנים בהתאם לתרבות) של תאי Sf9 הפקת baculovirus רקומביננטי וkindlin-3 העכברי רקומביננטי. (C) תמונת מיקרוסקופ אור של תאי Sf9 בריאים גדלו בהשעיה בSF-900 השני SFM בתוספת אנטיביוטיקה והועברה לצלחת 35 מ&quot;מ תרבית רקמה היטב (ראה פרוטוקול). תמונה היא בהגדלה 20X. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> איור 2. Represeטיהור ntative של kindlin-3 על ידי כרומטוגרפיה משותקת זיקת מתכת (IMAC). SDS-PAGE של זיקת ניקל מטוהר רקומביננטי עכברי kindlin-3 הביע בbaculovirus תאים הנגועים Sf9 (~ משקל תא 2 גר &#39;). חלבון Adsorbed היה eluted באמצעות שיפוע imidazole (המוצג לעיל ג&#39;ל). נתיבים מסומנים כדלקמן: MW, סמן משקל מולקולרי; ליס, lysate התא כולו; FT, לזרום דרך (מאוגד); WI, לשטוף 1; WII, לשטוף 2. ניתוח כתם מערבי (להלן) בוצע גם באמצעות השברים elution כדי לאשר את קיומו של מהונדס התג שלו על חלבון רקומביננטי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> איור 3. Repreפרופיל Elution טיהור sentative של kindlin-3 על ידי הפרין זיקה כרומטוגרפיה. () נצפה ב280 ננומטר (כחול) בו מוצגות שיא סימטרי אחת משחררי תחת שיפוע נתרן כלוריד ליניארי (ירוק) שימוש בטווח ריכוז NaCl של .05-1.0 מ &#39;( B) SDS-PAGE ניתוח של elution המופרד מפגין את נוכחותו של חלבון kDa 75, kindlin-3 (K3 שכותרת). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> איור 4. נציג כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל ומרוכז kindlin-3. פרופיל elution סינון ג&#39;ל (א) לkindlin-3 המטוהרים באמצעותS200 Superdex (16/60) בטריס-HCl, pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl ו1 מ&quot;מ DTT ב20 ° C. בהתבסס על elution הנפח, kindlin-3 נודד כצפוי לחלבון kDa 75, מה שמרמז שזה בעיקר monomeric. (B)-SDS של מרוכז מאוד מטוהר kindlin-3 רקומביננטי ב14.5 מ&quot;ג / מיליליטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> Assay Shift תרמי מבוסס Thermofluor איור 5. להצפת הקרנה. Kindlin-3 היה מדולל למאגרים שונים המרכיבים מסך דו ממדים של ה-pH לעומת ריכוז נתרן כלורי. טמפרטורות מעבר (טמפרטורת אמצע נקודות) נצפו על ידי הקרינה שלצבע קשור hydrophobically, כתום Sypro (בדיקות מולקולריות) ומחושב באמצעות תוכנת Opticon הצג. (א) היסטוגרמה 3D של טמפרטורות המעבר היא להתוות יחד עם (ב) השינוי בטמפרטורת מעבר מהממוצע המחושב של 50.4 ° ​​C. לשם בהירות הברים נצבעים בהתאם לטווח של טמפרטורות שבה הם מתאימות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies at JoVE.com

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins הוא יסוד להידבקות תא דרך integrins אך מחקרים שלהם כבר הקשו על ידי הקושי שנתקל בביטוים recombinantly במארחי חיידקים. אנו מתארים כאן שיטות לייצור היעילה שלהם בתאי חרקים שנדבקו ב-baculovirus.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

efficient-production-purification-recombinant-murine-kindlin-3-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K Views.  University of Oxford.  Kindlins הוא יסוד להידבקות תא דרך integrins אך מחקרים שלהם כבר הקשו על ידי הקושי שנתקל בביטוים recombinantly במארחי חיידקים. אנו מתארים כאן שיטות לייצור היעילה שלהם בתאי חרקים שנדבקו ב-baculovirus. 

Video: Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...