The authors are grateful to Dr. Thomas Rademacher and Ibrahim Al Amedi for cultivating the plants used in this study. We would like to thank Dr. Richard M. Twyman for his assistance with editing the manuscript. This work was in part funded by the European Research Council Advanced Grant "Future-Pharma", proposal number 269110, the Fraunhofer Zukunftsstiftung (Future Foundation), the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

<ol>
	<li>Wilhelm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Heat Capacities: Liquids, Solutions and Vapours. , 516 (2010).</li><li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermography+to+explore+plant-environment+interactions.">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> J. Exp. Bot. 64, 3937-3949 (2013).</li><li>Jayalakshmy, M. S., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+Properties+of+Plant+Leaves+and+Their+Influence+on+the+Environment+Temperature.">Thermophysical Properties of Plant Leaves and Their Influence on the Environment Temperature.</a> International Journal of Thermophysics. 31, 2295-2304 (2010).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+strategies+in+plant+molecular+farming.">Process development strategies in plant molecular farming.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).</li><li>Schuster, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+cuticular+transpiration+barriers+in+a+desert+plant+at+controlling+water+loss+at+high+temperatures.">Effectiveness of cuticular transpiration barriers in a desert plant at controlling water loss at high temperatures.</a> AoB PLANTS. 8, (2016).</li><li>Parker, W. J., Jenkins, R. J., Abbott, G. L., Butler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Method+of+Determining+Thermal+Diffusivity,+Heat+Capacity,+and+Thermal+Conductivity.">Flash Method of Determining Thermal Diffusivity, Heat Capacity, and Thermal Conductivity.</a> J Appl Phys. 32, 1679-1684 (1961).</li><li>Hays, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thermal+conductivity+of+leaves.">The thermal conductivity of leaves.</a> Planta. 125, 281-287 (1975).</li><li>Menzel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+blanching+reduces+the+host+cell+protein+content+and+substantially+enhances+the+recovery+and+stability+of+two+plant+derived+malaria+vaccine+candidates.">Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates.</a> Front. Plant Sci. , (2015).</li><li>Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blanching+intact+leaves+or+heat+precipitation+in+an+agitated+vessel+or+heat+exchanger+removes+host+cell+proteins+from+tobacco+extracts.">Blanching intact leaves or heat precipitation in an agitated vessel or heat exchanger removes host cell proteins from tobacco extracts.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Beiss, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-precipitation+allows+the+efficient+purification+of+a+functional+plant-derived+malaria+transmission-blocking+vaccine+candidate+fusion+protein.">Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein.</a> Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).</li><li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., T&#246;dter, N., Wehner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+thermal+properties+of+leaves+by+non-invasive+contact+free+laser+probing.">Determination of the thermal properties of leaves by non-invasive contact free laser probing.</a> J. Biotechnol. 217, 100-108 (2016).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numeric+simulation+can+be+used+to+predict+heat+transfer+during+the+blanching+of+leaves+and+intact.">Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact.</a> Biochem. Eng. J. , (2015).</li><li>Hedlund, H., Johansson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+capacity+of+birch+determined+by+calorimetry:+implications+for+the+state+of+water+in+plants.">Heat capacity of birch determined by calorimetry: implications for the state of water in plants.</a> Thermochim Acta. 349, 79-88 (2000).</li><li>Chandrakanthi, M., Mehrotra, A. K., Hettiaratchi, J. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+conductivity+of+leaf+compost+used+in+biofilters:+An+experimental+and+theoretical+investigation.">Thermal conductivity of leaf compost used in biofilters: An experimental and theoretical investigation.</a> Environ. Pollut. 136, 167-174 (2005).</li><li>Larcher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. , (2003).</li><li>Cowen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-ray+burst's+enduring+fireball.">A gamma-ray burst's enduring fireball.</a> Science News. 152, 197 (1997).</li><li>Jones, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+infrared+imaging+of+crop+canopies+for+the+remote+diagnosis+and+quantification+of+plant+responses+to+water+stress+in+the+field.">Thermal infrared imaging of crop canopies for the remote diagnosis and quantification of plant responses to water stress in the field.</a> Funct. Plant Biol. 36, 978-989 (2009).</li><li>Defraeye, T., Verboven, P., Ho, Q. T., Nicolai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convective+heat+and+mass+exchange+predictions+at+leaf+surfaces:+Applications,+methods+and+perspectives.">Convective heat and mass exchange predictions at leaf surfaces: Applications, methods and perspectives.</a> Comput. Electron. Agric. 96, 180-201 (2013).</li><li>Arndt, S. K., Irawan, A., Sanders, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+water+fraction+and+rehydration+techniques+introduce+significant+errors+in+measurements+of+relative+water+content+and+osmotic+potential+in+plant+leaves.">Apoplastic water fraction and rehydration techniques introduce significant errors in measurements of relative water content and osmotic potential in plant leaves.</a> Physiol. Plant. 155, 355-368 (2015).</li><li>Jones, H. G., Schofield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+and+other+remote+sensing+of+plant+stress.">Thermal and other remote sensing of plant stress.</a> General and Applied Plant Physiology. 34, 19-32 (2008).</li><li>Jones, H. G., Archer, N., Rotenberg, E., Casa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+measurement+for+plant+ecophysiology.">Radiation measurement for plant ecophysiology.</a> J. Exp. Bot. 54, 879-889 (2003).</li><li>Dupont, C., Chiriac, R., Gauthier, G., Toche, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+capacity+measurements+of+various+biomass+types+and+pyrolysis+residues.">Heat capacity measurements of various biomass types and pyrolysis residues.</a> Fuel. 115, 644-651 (2014).</li><li>Chaerle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-sensor+plant+imaging:+Towards+the+development+of+a+stress-catalogue.">Multi-sensor plant imaging: Towards the development of a stress-catalogue.</a> Biotechnol. J. 4, 1152-1167 (2009).</li><li>Hackl, H., Baresel, J. P., Mistele, B., Hu, Y., Schmidhalter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Plant+Temperatures+as+Measured+by+Thermal+Imaging+and+Infrared+Thermometry.">A Comparison of Plant Temperatures as Measured by Thermal Imaging and Infrared Thermometry.</a> J. Agron. Crop. Sci. , 415-429 (2012).</li><li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+winter+wheat+leaves+for+detection+and+differentiation+of+diseases+and+insects.">Spectral analysis of winter wheat leaves for detection and differentiation of diseases and insects.</a> Field Crops Res. 156, 199-207 (2014).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

המגע ללא, שיטת מדידה בלתי הרסניות שתוארו לעיל ניתן להשתמש כדי לקבוע ג p, s ו- ʎ באופן סימולטני לשחזור. חישוב ʎ בפרט תלוי כמה פרמטרים רגישים שגיאים. אף על פי כן, ההשפעה של שגיאות אלה הייתה גם ליניארי או תת-מידתי, ואת המקדם שונה עבור כל הפרמטרים נמצאו פחות מ -10%. למרות השיטה יכולה אפוא להיחשב חזק, כמה שיפורים טכניים יכולים להתבצע כדי להפחית את המקורות הנותרים של שגיאה. הרכבה מדגם לתוך המכלול הייתה מאתגרת מבחינה טכנית בגלל משטח עלה שטוח עדיף למדידה אבל המדגם טבעי יש משטח גלי. בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות תכנון בעל מדגם ייעודי בגיאומטריות מותאמות בדיוק המדגם עלה, למשל, עובי עלה ורוחב, מהדק את המדגם מעדיףאורינטציה מסוגלת. גישה זו היה לבצע את המדידות יותר לשחזור, אך תפגע הטבע מגע ללא המדידה בגלל הקשר ההדוק בין המדגם בעל יידרשו למשוך את הדירה עלה לפני השטח. היתרונות של שימוש בסוג זה של בעל ולכן יהיו תלויים בהקשר של המדידה, כלומר, אם אופי הדיוק או מגע ללא המדידה הוא חשוב ביותר. לעומת זאת, שיקולים אלה לא ייתכן שיהיה צורך בכלל עבור עלים עם משטח שטוח מטבעו, למשל, אורז מינים קרובים. מעבר חום בהסעה עקב תנועת האוויר בסביבה של המדגם צריך להישמר עד למינימום במהלך המדידות כי זה מאוד משפיע על חישוב של שני ג p, s ו- ʎ 18. המנגנון ולכן צריך להיות ממוקם הרחק זרמי אוויר שנוצרו על ידי מערכות מיזוג אוויר, רדיאטורים או ציוד אחר, כגון מחשב עםמאווררים נפרדים. זה חשוב גם בגלל שינויים בתוכן מי ביחס של העלים 19 שעשויים להתרחש לפני או במהלך המדידה עקב התאדות, אשר יכול להיות מוגבר על ידי תנועות באוויר 20, לא היוו במודל. לכן, מדידות, במיוחד עם דפים מנותקים, צריכות להתבצע במהירות כמתואר בסעיף בפרוטוקול כדי למנוע שגיאות במהלך רכישת נתונים. בעתיד, את ההשפעות של אידוי על המדידה עשויות להיות מופחתות או להימנע אם המדידה מתבצעת בתא מדידה מצורף חלקית לפחות עם בקרת לחות מיושמת. הדיוק של ג p, s וערכי ʎ ניתן להגדיל על ידי מדידת הפרמטרים המשמשים במשוואות המקבילות ליתר דיוק. במקרה של ג p, s פרמטרים אלה הם כוח לייזר, מדגם טמפרטורה מקסימלית הסביבה נפח, כלומר, המוצר של lasאה נקודה באזור ועובי, וצפיפות מדגם (משוואה 8). הפרמטרים שני האחרונים צריכים להיקבע ניסויים המלווים את המדידה בפועל ואמינותן יכולה להשתפר אם מספר משכפל ביולוגי נציג נבדק. עם זאת, גם כאשר מדידת חיוג מד פשוט שמשה, הבדל עובי עלה לעומת ניתוח מיקרוסקופי היה רק 11%, אשר השפיעו על הערכים מחושבים עבור ג p, s ו- ʎ ידי באותה המידה. לעומת זאת, הטמפרטורות וכוח לייזר יכול להיות במעקב לאורך המדידה. הדיוק של ג p, s יכול להשתפר אם נתונים אלה באינטרנט משמשים במקום ערכים קבועים עבור כוח ליזר טמפרטורת הסביבה, ואת הנתונים נאספים באמצעות חיישנים מכוילים היטב. שיקולים אלה חלים גם על ʎ, אבל הסביבה וטמפרטורות מדגם הם הפרמטרים החשובים ביותר, כי הן ישפיעו על השווי המחושב על ידי כוח של ארבעה. החישוב הנוכחי של ʎ התבסס על מספר הנחות לגבי העברת הסעה חומה קרינת תרמית. לדוגמה, emissivity (ε) מקדם מעבר חום בהסעה (ח) לא נמדדו או מחושב במפורש השיטה המוצגת לעיל, אך הופקו מפרסומים קודמים 18,21. הדיוק של ʎ יכול אפוא להיות משופרת על ידי קביעת פרמטרים שני אלה תחת תנאי המדידה בפועל. עם זאת, תוך שימוש בנתוני ספרות לחישובים זאת הניב ערכים ʎ שהיו בטווח נקבע באופן ניסיוני עבור מיני צמחים אחרים שעבורם תכונות דומות ניתן לצפות בשל הגזע שלהם למיני ניקוטיאנה והפיסיולוגיה שלהם, כלומר, צמחים עשבוניים 3. גם אם את הערכים עבור ε ו- h היו מגוונים על המכלול שדווח בעבר עבור ערכים אלה צמחים, למשל, 0.93-0.98 עבור ε 21, והשפיעו על הערך הסופי של ʎ היו &lt;10% ובכך בתוך השונות הטבעיות שנצפו כאן. השיטה המוצגת לעיל הייתה לא רק מסוגלת לקבוע את תכונות תרמיות של עלים שלמים ללא פגע ודפים מנותקים, אבל זה גם זיהה סוגים שונים של ניזק חמור יותר הציג במכוון לפני המדידה. לכן, סוגים שונים של דגימות עלים ניתן להבחין בקלות, מתן כלי להסיר, לפני הניתוח, דגימות עניות כל שיניב נתונים באיכות נמוכה. תכונה זו יכולה לשמש עבור בקרת איכות כאשר ניטור חומרים ביולוגיים, למשל, דגימות אי עמידה מפרטת במונחים של ג p, s ו- ʎ יכול להיות שלילי מעיבוד נוסף. זה יהיה נכס בהקשר של תהליכי פיקוח הדוק כגון חקלאות מולקולרית 4. יתרונותיה של שיטה חדשה זו בהשוואה לאחריםבספרות נמנתה טיפול מדגם המהיר, הכנה מינימאלית, מדידה בו זמנית מגע ללא ולא הרסני של ג p, s ו- ʎ, והשימוש בציוד משותף שניתן למצוא במעבדות אופטיות רבות. זה יקל יישומים רחבים יותר של השיטה בהשוואה לאלו הדורשים התקנים מיוחדים ויקרים כגון calorimeters סריקת הפרש. יתר על כן, calorimetry דורש קשר ישיר עם מדגם 22 כך קיים סיכון של נזק, ואת השיטה הוא מוגבל בדרך כלל למדידת קיבולת חום סגולי 22. בניגוד לכך, בעוד הדמית תרמית יכול לזהות נימק או שינויים פיסיים עלים או צמחים כולו באופן מגע ללא 23, זה גם דורש ניתוח תמונה מורכב התקנים מיוחדים מוקדשים 24 עלולים להיות להתגבר בעתיד על ידי מצלמות IR זולות וחזקות יותר אשר נלווה התקנים היקפיים. ניתוח ספקטרלי עוד קשר-frשיטת EE לניתוח תוכן מים ורמות כלורופיל 25, אבל זה עדיין לא נעשה שימוש כדי לקבוע את קיבולת חום סגולית ו / או מוליכות תרמית. גישת המדידה דיווחה בזאת היא שיטה חזקה כדי לקבוע את תכונות תרמיות של עלי צמח עם עלויות השקעה נמוכות פי מדידה קצרה. הוא שימש בהצלחה לקבוע ג p, s ו- ʎ ב tabacum נ ו נ benthamiana, שני מינים שרלוונטיות בתחום חקלאות מולקולרית 4. הערכים חושב עבור שני הפרמטרים בהתבסס על פרופילי טמפרטורת עלה היו בהסכם טוב עם אלו שדווחו בעבר עבור מיני צמחים אחרים 3. השיטה היא בלתי הרסני, קשר ללא, ואינו דורשת הכנת מדגם מורכבת, מתן יתרונות על פני כל השיטות החלופיות הנוכחיות לניתוח תכונות תרמיות. העיצוב הפשוט יכול גם להקל על הפיתוח של הל ידמכשירי ד כדי להגביר את הגמישות.

עיבוד בקנה מידה גדול של חומרים ביולוגיים בדרך כלל דורש צעדים-טיפול בחום כמו פיסטור. ציוד תהליכים כאלה יכול להיות מתוכנן בצורה מדויקת יותר אם תכונות תרמיות של חומרים הביולוגיים מאופיינות היטב, כולל קיבולת החום הסגולית (ג, עמ &#39;הים) ו מוליכות תרמית (λ). פרמטרים אלה ניתן לקבוע בקלות לנוזלים, השעיות homogenates ידי calorimetry 1. עם זאת, פרמטרים כגון מדידה בדגימות מוצקות יכולים להיות עבודה אינטנסיבית, ולעתים קרובות דורשים מגע ישיר עם המדגם או אפילו חורבנה 2. לדוגמה, טכניקות photothermal דורשים מגע ישיר בין המדגם לבין גלאי 3. מגבלות אלו מקובלים במהלך עיבוד מזון, אך אינם עולים בקנה אחד עם תהליכי פיקוח הדוק כגון ייצור של חלבונים הביו-פרמצבטיקה בצמחים בהקשר של תרגול 4 ייצור נאותים. אניn בהקשר כזה, חזר (למשל, שבועי) ניטור של תכונות תרמיות שיידרש במהלך תקופת צמיחת שבעה שבועות עבור צמחים בודדים ככלי בקרת איכות. אם ניטור כזה ידרוש וצורכים עלו לכל מדידה, לא יהיה שום ביומסה עזבה לעבד בזמן הקציר. בנוסף, שימוש בחלקים עלה רק במקום יגרום ופצע למפעל ולהגדיל את הסיכון של נמק או זיהום הפתוגן, שוב מצמצמים את התשואה התהליך. הסבירות של זיהום הפתוגן עלולה להגביר גם אם שיטה עם מקשר ישיר המדגם תשמש, גרימת הסיכון שאירוע האצווה כולה של צמחים יכולה להידבק באמצעות מגע עם מכשיר חיישן מזוהם. יש היבטים בדומה להיחשב לניטור של הצמח מדגיש כמו בצורת, למשל, בהקשר ecophysiological. לדוגמא, אובדן מים מנוטר לעתים קרובות על ידי שינוי ביומסה הטרי, מחייבת Tre פולשניתatment של הצמחים תחת חקירה 5, למשל, לנתח עלה. במקום זאת, קביעת קיבולת החום הסגולית, אשר תלויה את תכולת המים מדגם, באופן בלתי פולשני כמו לתאר כאן, יכול לשמש כפרמטר פונדקאי עבור מצב הידרציה של צמחים. בשני התרחישים (ייצור תרופות ואקופיזיולוגיה), מדגיש מלאכותי המושרה על ידי שיטות מדידה הרסניות או פולשני יהיה מזיק כפי שהם יכולים לעוות את נתוני הניסוי. לכן, שדווחו בעבר שיטות פלאש 6 או את המיקום של דגימות בין צלחות כסף 7 אינן מתאימות תהליכי ניסויים כאלה, כי הם גם דורשים מקשר ישיר המדגם או הם הרסניים. פרמטרי ג p, s ו- λ צריכות להיקבע על מנת לעצב המכשור הטכנולוגי עבור צעד לבן שיכול לפשט טיהור מוצר ובכך להפחית את עלויות ייצור 8-10. ג השניp, s ו- λ כעת ניתן נחוש במהירות על ידי לייזר אינפרא אדום ליד מגע ללא שאינו הרסני (NIR) חיטוט בצורה עקבית לשחזור 11 ו שיטה חדשה זו יוסבר בהרחבה בהמשך. התוצאות שהתקבלו בשיטה זו נעשה שימוש מוצלח לדמות העברת החום עלי טבק 12, המאפשר את העיצוב של ציוד עיבוד מתאים ובחירת המתאימים פרמטרים כגון טמפרטורה הלבנה. השיטה קלה להקים (איור 1) ויש לו שני שלבים, מדידה וניתוח, שכל אחת מהן כולל שני שלבים עיקריים. בשלב המדידה, מדגם עלה מחומם ראשון באופן מקומי על ידי דופק ליזר קצר וטמפרטורת הדגימה המירבית היא רשמה. פרופיל הטמפרטורה של המדגם נרשם ואז למשך תקופה של 50 s. בשלב הניתוח, נכסים עלו כגון צפיפות (בקלות ובמדויק שקבעו measurem pycnometricאף אוזן גרון) משולב עם טמפרטורת הדגימה המירבית לחשב ג p, s. בשלב השני, פרופיל הטמפרטורה עלה משמש כקלט עבור משוואת מאזן אנרגיה, לוקח הולכה, הסעה וקרינה בחשבון, כדי לחשב λ. הוראות צעד-אחר-צעד מפורטות ניתנים באזור פרוטוקול והרחיב על תוכן הסרטון מלווה. מדידות אופייניות מכן מוצגות בסעיף התוצאות. לבסוף, את היתרונות ומגבלות של השיטה מודגשות בסעיף הדיון יחד עם שיפורי פוטנציאל ויישומים נוספים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54835/54835fig1.jpg" /> איור 1: מנגנון המשמש כדי לקבוע מאפיינים עלו תרמית. א. תצלום של המנגנון המדידה ששימשו לקביעת קיבולת חום סגולי מוליכות תרמית של leAves. ההתקנים ההיקפיים (המחשבים, אוסצילוסקופ) אינם מוצגים. B. ייצוג סכמטי של מנגנון המדידה. הליזר ואת הציוד מחובר מודגשים באדום, גלאי NIR למדידת טמפרטורה מוצגים סגול, מדגם העלה ירוק חיישן כוח פוטו-דיודה הוא כחול. ג. ציור של האלמנטים של ההתקנה המדידה עם אותו קוד הצבע כמו ב בר הגודל מצביע 0.1 מ &#39;. D. תמונת מסך הממחיש את האלמנטים המאפיינים את תוכנות שליטת ליזר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54835/54835fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1207">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">1&#34; tube</td>
			<td style="width:259px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:136px;">SM1L10E</td>
			<td style="width:403px;">Tube for fiber holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Agarose</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td>Agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Bi-Convex lense f=25.4</td>
			<td style="width:259px;">Thorlabs</td>
			<td>LB1761</td>
			<td>Lense</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:411px;">Digital Handheld Optical&#160;Power and Energy Meter Console</td>
			<td style="width:259px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:136px;">PM100D</td>
			<td>Console for thermal surface absorber sensor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Digital Phosphor Oscilloscope&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Tektronix</td>
			<td style="width:136px;">DPO7104</td>
			<td>Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">DMR light microscope</td>
			<td style="width:259px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>Light microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:259px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">14-432-2</td>
			<td>Pycnometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:259px;">Kammlott</td>
			<td style="width:136px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fiber holder</td>
			<td style="width:259px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Fiber holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:259px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:136px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:259px;">n.a.</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:259px;">Grodan</td>
			<td style="width:136px;">102446</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Infrared Detector Optris CT</td>
			<td style="width:259px;">Optris</td>
			<td style="width:136px;">OPTCTLT15</td>
			<td>Infrared detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Infrared Detector Software Compact Connect</td>
			<td style="width:259px;">Optris</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>Control software for infrared detector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:259px;">PerkinElmer</td>
			<td>L1050</td>
			<td>UV/VIS Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:411px;">Laser 400&#956;m, 1550nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module</td>
			<td style="width:259px;">DILAS</td>
			<td style="width:136px;">M1F-SS2.1</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Laser cover&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Amtron</td>
			<td style="width:136px;">LM200</td>
			<td>Laser Cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Laser Driver&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Amtron</td>
			<td style="width:136px;">CS 408</td>
			<td>Laser Driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:259px;">Osram</td>
			<td style="width:136px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Photodiode sensor&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:136px;">PDA20H-EC</td>
			<td>Power sensor for transmission measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Precision weight Ohaus Analytical Plus</td>
			<td style="width:259px;">Ohaus</td>
			<td style="width:136px;">80251552</td>
			<td>Precision weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sample frame</td>
			<td style="width:259px;">Fraunhofer ILT</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>Fixation of the leaf sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Software Pyro Control</td>
			<td style="width:259px;">Amtron</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>Laser Power Control Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Stainless-steel-holder</td>
			<td style="width:259px;">n.a.</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>Holder for measurement set-up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Teflon plates 2cm</td>
			<td style="width:259px;">Fraunhofer ILT</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>Teflon attenuation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Thermal surface absorber Power sensor</td>
			<td style="width:259px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:136px;">S314C</td>
			<td>Sensor for laser power measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Vibratome</td>
			<td style="width:259px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">1491200S001</td>
			<td>Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Zoc/Pro 6.51&#160;</td>
			<td style="width:259px;">EmTec Innovative Software</td>
			<td style="width:136px;">n.a.</td>
			<td>Laser Control Software&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid laser probing method facilitates the non-invasive and contact-free determination of leaf thermal properties

צמחים יכולים לייצר חומרים יקרי ערך כגון מטבוליטים משניים וחלבונים רקומביננטיים. הטיהור של האחרון מביומסה צמח יכולה להיות יעילה על ידי טיפול בחום (לבן). מנגנון לבן יכול להיות מתוכנן בצורה מדויקת יותר אם תכונות תרמיות של העלים ידועות לפרטיהם, כלומר, את היכולת החומה הסגולית ומוליכות תרמית. מדידת הנכסים אלה היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית, ובדרך כלל דורשת שיטות פולשניות כי פנו המדגם ישירות. זה יכול להפחית את תשואת המוצר ועלול להיות בקנה אחד עם דרישות בלימה, למשל, בהקשר של ייצור נאות. כדי לטפל בבעיות אלה, שיטה לא פולשנית, ללא קשר פותחה הקובע את קיבולת חום סגולי מוליכות תרמית של עלה צמח שלמים כדקה. השיטה כרוכה ביישום דופק לייזר קצר של אורך מוגדר ועוצמת אל אזור קטן שלמדגם עלה, גרימת עלייה בטמפרטורה זו נמדדת באמצעות חיישן אינפרא אדום קרוב. גידול הטמפרטורה משולב עם תכונות עלה ידועות (עובי וצפיפות) כדי לקבוע את קיבולת החום הסגולית. מוליכות התרמית ואז מחושבת על בסיס הפרופיל של הירידה בטמפרטורה עוקבת לוקחות קרינת תרמית מעבר חום בהסעה בחשבון. החישובים הקשורים היבטים קריטיים של טיפול מדגם נדונים.

מדידה ליף מאפיינים בשיטה המיקרוסקופית לעיל, עובי עלה של 0.22-0.29 × 10 - 3 מ &#39;נקבע לשני tabacum נ (0.25 ± 0.04 × 10 - 3 מ&#39;, n = 33) ו נ benthamiana (0.26 ± 0.02 × 10 - 3 מ &#39;, n = 24), שהוא גם בתוך 0.20-0.33 × 10 - מגוון מ 3 שדווח בעבר עבור העלים של מיני צמחים שונים 3. קביעת העובי עם מד-בחיוג ניב ערכי ~ 0.28 × 10 - 3 מ &#39;(n = 10), אשר היה בתוך סטיית תקן אחת של תוצאות מהמדידה המיקרוסקופית. לפיכך, המדידה-מד חיוג עשויה להיות מועדפת על פני השיטה המיקרוסקופית לקביעת עובי ביישומים שגרתית כפי שהייתה קל יותר ליישםאת התוצאות עבור ג p, s ו- ʎ סטו פחות מ -10% מן טכניקת עבודה אינטנסיבית יותר. צפיפות tabacum נ ועלים נ benthamiana היה 750 ± 10 ק&quot;ג מ &#39;- 3 (n = 20), אשר תואם את מ 631-918 ק&quot;ג - 3 טווח שדווח בעבר עבור עלים במינים אחרים 3. חישוב קיבולת החום הסגולי פרופילי טמפרטורה שנאספו עבור מיני ניקוטיאנה הראו עלייה מהירה לאורך הזמן של דופק הליזר עד (מקסימום T) טמפרטורה המקסימלית הושג בתוך פחות מ 1 s. אחרי הדופק, הטמפרטורה ירידה אקספוננציאלית עד שהגיע טמפרטורת הסביבה (T 0) (איור 3 א - ה). קיבולת החום הסגולית (ג p, s </sub&gt;) חושבה על פי משוואה 8 ערכים מניבים של 3661 ± 323 J ק&quot;ג -1 K -1 עבור tabacum נ ו 2,252 ± 285 J ק&quot;ג -1 K -1 עבור נ benthamiana. שתי הגדרות טיפוח משכים שמשו עבור כל מינים (ראה סעיף 1.2) אבל זה לא השפיע ג p, s (איור 4). עם זאת, ג עמ &#39;, ערכים של ירד באופן ליניארי מן הישן (למטה) כדי צעיר (למעלה) עלים (R 2 = 0.85) במקרה של tabacum נ (איור 4 א), אשר מתואמים לתוכן מים [GG -1 ביומסה] אשר אותו קבע כהפרש של ביומסה רטוב בעת הקציר ואת המסה לאחר דגירה 72 שעות ב 60 ° C 11. המתאם הזה בין תוכן מי קיבולת חום סגולי היה בהסכמה עם תצפיות קודמות על ידי 13 סופרים אחרים. מתאם הפוך נצפה benthamia ננה (R 2 = 0.79), כאשר הפער בין יכולות חום הסגוליות של עלים של דרגות שונות של בשלות (למטה = ישנות; עליונה = הצעיר) היו רק 13% לעומת 21% עבור tabacum נ. הבדל זה עשוי לנבוע מהעובדה התכולה מי עלים של נ benthamiana הוא כמעט קבוע על הדרגות השונות של התבגרות עלה 11. ניתוח רגישות גילה כי הבדלי p c, s היו יחסים לתנודות פרמטרי המידות במשוואה 8. השפעת כוח ליזר משתקף ומשודר היה תת-מידתי, כי הפרמטרים הללו לא היו גורמים בודדים במשוואה 7. לפיכך, השפעת שגיאות בשני הפרמטרים האלה היה קטן יותר מאשר אלה בגלל תנודות בשערי כוח לייזר או טמפרטורת הסביבה. באופן כללי, נחשבת המדידה להיות חזק כי כל הפרמטרים מעורבים בחישוב ג עמ &#39;, היה של קדםוריאציה של פחות מ -10% (איור 4C ו- D). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54835/54835fig4.jpg" /> איור 4: קיבולת חום סגולית וערכי מוליכות תרמית שנקבעו tabacum נ ו נ benthamiana. א. קיבולת חום סגולית מוליכות תרמית של tabacum נ משאיר על פי העמדה עלה על הצמח (למטה = עלים ישנים; באמצע = עלים בוגרים; עליון = עלים צעירים). כוכבים ומשולשים מצביעים צמחים שהיו 49 ו -56 ימים ההם, בהתאמה. B. קיבולת חום סגולית מוליכות תרמית של נ benthamiana עלים על פי העמדה עלה על הצמח. כוכבים ומשולשים מצביעים צמחים שעובדו בתוך phytotron או חממה, בהתאמה. ג. רגישות של ערכי קיבולת חום סגוליים לשינויים בפרמטרי הקלט. Triangles להראות ערכי קיבולת חום סגוליים הנובעים עלייה של 10% (אדומה, כלפי מעלה) או ירידה (כחולה, כלפי מטה) בפרמטרי מודל יחידים. D. רגישות של ערכי מוליכות תרמית לשינויים בפרמטרי הקלט. משולש לסמן ערכי מוליכות תרמית נעל הנובע עלייה של 10% (אדומה, כלפי מעלה) או ירידה (כחול, כלפי מטה) בפרמטרי מודל יחידים. ברים שגיאה ב A ו- B מציינים את סטיית התקן (n≥3), ואילו ב- C ו- D הם מייצגים את מגוון שלם של הערכים שהתקבלו במהלך ניתוח רגישות וריאציה 10%. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54835/54835fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> חישוב מוליכות תרמית מוליכות התרמית (ʎ) חושבו ומפרופילי הטמפרטורה על ידי מעריכיםהולם (איור 3) בשילוב עם משוואות עבור העברת חום מוליך הסעה וכן קרינה תרמית. משוואה 15 הניבה ערכים ממוצעים של 0.49 ± 0.13 J מ - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) עבור tabacum נ ו 0.41 ± 0.20 J מ - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) עבור נ benthamiana. לא היה מתאם בין ʎ וגיל צמח או הגדרת טיפוח, למרות קורלציה בין הגיל עלה ʎ נצפתה עבור נ benthamiana (איור 4B), מסכימה עם שדווחו בעבר הבדלים תלוי גיל מיני צמחים אחרים 14. כפי שציינו קודם לכן, תכולת המים הייתה סיבה סביר להבדל זה משום שהוא נמצא להיות הומוגנית על פני העלים של משתנים לפדיון של נ benthamiana. במקום זאת, אנו משערים כי שינויים lרקמת EAF, למשל, רכב דופן תא, היו אחראי תצפית זו על ידי שינוי תכונות העברת חום של העלה ובכך להשפיע על הערך של ʎ. קביעת ʎ הייתה רגישה לשינויים בטמפרטורת הסביבה. ניתוח רגישות גילה כי תנודות של ± 2.3 K שינו את הערך של ʎ ידי 64-125%. יש פי משוואה 15, טמפרטורת הסביבה השפעה על ידי כוח של ארבעה על קרינה תרמית ובכך משפיע באופן ישיר על שווי ʎ. הערכת מנגנון המדידה אפשר היה להגדיר את מכלול המדידה בתוך 3 שעות. ברגע זה יהיה מלא, הסטארט-אפ הזמן של המערכת הייתה כ 15 דקות לכל סדרת מדידה. מדידות יחידות נדרשו פחות מ -3 דקות, כולל הכנת מדגם מחזור המדידה כולו. ניתוח של זמן החשיפה לייזר חשף כיזמן חימום של 0.5 s הביאה לעלייה בטמפרטורה של 19.9 ± 4.3 ° C (n = 55) היה את הפשרה הטובה ביותר בין ΔT גבוהה (מושגת על ידי פעימות לייזר ארוך) נדרש עבור יחס אות לרעש טוב (SNR) ו ΔT נמוך (מושגת על ידי פעימות לייזר קצר) נדרש כדי למנוע נזק לרקמות. משכי דופק עוד מ -0.5 s הביא לאובדן של המוני מן המדגם, כנראה המשקף את התאדות של מים ו / או נזק לרקמה עלה ככל שהטמפרטורה מדגם הגיע עד 70 מעלות צלזיוס, ואילו 42.9 רק ± 4.2 ° C (n = 55) נצפו פעימות לייזר של 0.5. משכים של פחות מ -0.5 שניות, רעש הטמפרטורה של ± 0.31 K (סטיית תקן, n = 25) היווה יותר מ -5% של ΔT ועל כן חלק ניכר ΔT. לעומת זאת, ברמה של 0.5 s הרעש היוו רק 2.5% של האות ובכך נחשב זניח. בנוסף, הדגימות לא לחמם יותר מ ~ 45 ° C, שהואטמפרטורה שצמחי הטבק יכולים להיחשף גם ב טרופי טבעיות גידול תת-טרופי שהוא מזיק רק למינים צמחיים הנמצאים בבתי גידול הטונדרה 15. צפיפות הכוח של הלייזר היה 170 כ&quot;ס מ -2, ואילו קרינת השמש הטבעית היא בדרך כלל בטווח של 1.0-1.4 כ&quot;ס מ -2 16,17. עם זאת, בשל הזמן הקצר מאוד של הדופק, מנה אנרגיה גבוהה יותר זה היה כנראה לא לגרום נזק לרקמות עלה כפי שצוין על ידי ניתוח מיקרוסקופי שפורסם לאחרונה 11. נתוני הטמפרטורה המשמשים לחישוב ʎ הוגבלו ל -20 s הראשונית לאחר דופק הליזר כי רק בתקופה זו עשה את הרעש (± 0.31 K) מהווה פחות מ -5% של אות הטמפרטורה של המדגם ובכך נחשב זניח. כאשר נתוני הטמפרטורה מעבר למסגרת 20 הזמן שימשו, הערכים שחושב ʎ ירד (איור 3F). הסבר אפשרי היה כי חלק מההנחותעשה לחישוב ʎ לא הגישו בקשות ערכים נמוכים של ΔT. במיוחד, המונח המתאר קרינת תרמית ב -15 משוואה אולי הושפע כמו שהוא מושפע הכח הרביעי של טמפרטורה. כמו כן, באזור עלה סביב נקודת המדגם חשופה הליזר שאולי התחמם מעט ובכך אולי לא היה את גוף הקירור האידיאלי הניח במודל צמצום x ΔT היעיל ובסופו של דבר ʎ מחושב.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties at JoVE.com

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

A method was developed to determine the specific heat capacity and thermal conductivity of leaf tissue by non-invasive, contact-free near infrared laser probing, which requires less than 1 min per sample.

ליזר מהיר גשוש שיטה מקלה על קביעת פולשני צור-חינם של תכונות תרמיות ליף

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

a-rapid-laser-probing-method-facilitates-non-invasive-contact-free

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K Views.  Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.. A method was developed to determine the specific heat capacity and thermal conductivity of leaf tissue by non-invasive, contact-free near infrared laser probing, which requires less than 1 min per sample.

Video: A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have highlighted complex mechanisms of glycogen metabolism, including the diel cycle of biosynthesis and catabolism, redox regulation, and the involvement of non-coding RNA. At the same time, efforts are being made to redirect carbon from glycogen to desirable products in genetically engineered cyanobacteria to enhance product yields. Several methods are used to determine the glycogen contents in cyanobacteria, with variable accuracies and technical complexities. Here, we provide a detailed protocol for the reliable determination of the glycogen content in cyanobacteria that can be performed in a standard life science laboratory. The protocol entails the selective precipitation of glycogen from the cell lysate and the enzymatic depolymerization of glycogen to generate glucose monomers, which are detected by a glucose oxidase-peroxidase (GOD-POD) enzyme coupled assay. The method has been applied to Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus sp. PCC 7002, two model cyanobacterial species that are widely used in metabolic engineering. Moreover, the method successfully showed differences in the glycogen contents between the wildtype and mutants defective in regulatory elements or glycogen biosynthetic genes.

Here, we present a reliable and easy assay to measure the glycogen content in cyanobacterial cells. The procedure entails precipitation, selectable depolymerization, and the detection of glucose residues. This method is suitable for both wildtype and genetically engineered strains and can facilitate the metabolic engineering of cyanobacteria.

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing plant metabolites because it provides molecular weights with high sensitivity and specificity. Leaf spray MS is an ambient ionization technique where plant tissue is used for direct chemical analysis via electrospray, eliminating chromatography from the process. This approach to sampling metabolites allows for a wide range of chemical classes to be detected simultaneously from intact plant tissues, minimizing the amount of sample preparation needed. When used with a high-resolution, accurate mass MS, leaf spray MS facilitates the rapid detection of metabolites of interest. It is also possible to collect tandem mass fragmentation data with this technique to facilitate a compound identification. The combination of accurate mass measurements and fragmentation is beneficial in confirming compound identities. The leaf spray MS technique requires only minor modifications to a nanospray ionization source and is a useful tool to further expand the capabilities of a mass spectrometer. Here, fresh leaf tissue from Sceletium tortuosum (Aizoaceae), a traditional medicinal plant from South Africa, is analyzed; numerous mesembrine alkaloids are detected with leaf spray MS.

Leaf spray mass spectrometry is a direct chemical analysis technique that minimizes the sample preparation and eliminates chromatography, allowing for the rapid detection of small molecules from plant tissues.

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling

Fragrances of many flower families have been sampled and the volatiles analyzed. Knowing the compounds that make up the fragrances can be an important step to conservation of flowers that are threatened or endangered. Because floral fragrance is critical for attracting pollinators, this method could be used to better understand or even enhance pollination. We present a protocol using a portable charcoal air filter and vacuum to collect floral fragrance volatiles, which are then analyzed by a GC-MS. By using this method, fragrance volatiles can be sampled using a non-destructive method with a machine that is easily transported. This methodology uses a rapid sampling procedure, cutting sampling time down from 2-3 hours to approximately 10 minutes. Using GC-MS, the fragrance compounds can be identified individually, based on authentic standards. The steps used for collecting fragrance and control data are presented, from material setup to collecting the data output.

Here, we present a protocol for collecting the floral fragrance volatiles from blooming flowers, using a non-destructive sampling procedure.

אוסף מהיר של ניחוח פרחוני וולאטילס באמצעות מרחב ראש שיטה איסוף נדיפות עבור GC-MS מדגם תרמי

Fragrances of many flower families have been sampled and the volatiles analyzed. Knowing the compounds that make up the fragrances can be an important ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...