הכותבים הם מאוד אסיר תודה ליוסף מנצ&#39;יני (לשעבר עם GE Healthcare), פאבל Czudec, תומאס קייג (מוגבל Malvern מכשירים) עבור תפקידם ההתקנה וההדרכה על קלורימטר סריקת הפרש, Sasmit Deshmukh וובסטר Magcalas לדיונים שלהם.

1. כלי Start-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את קלורימטר הסריקה דיפרנציאלי להגביר את הלחץ בתאים לדכא רתיחה של הדגימות וכן למנוע היווצרות בועות בטמפרטורות גבוהות. זו מושגת בדרך כלל על ידי אספקת חנקן לתוך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם החומר המהווים של התא (למשל, טנטלום, זהב, פלטינה, וכו &#39;), לכוון את הלחץ של אספקת גז חנקן על פי הלחץ המומלץ על ידי היצרן כדי למנוע נזק לתא. לדוגמה, להגדיר את הלחץ של אספקת גז חנקן עד 45 psi עבור המכשיר בשימוש לפתח הליך זה, ואת הלחץ מעל 80 psi עלולה לגרום נזק לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי כל מאגרי חומר ניקוי מלאים עד הנפח הנדרש. חומרי ניקוי נדרשו לכלול חומרי ניקוי ומים לשטוף ולנקות את התא בהתאמה אחרי כל סיבוב מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה של התא מחזיק מדגםלערך מתאים, רצוי 5 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על שלמות המדגם לפני להתנסות. </li></ol> לדוגמא כנה 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze מדגם נגד החיץ אשר ישמש כנקודת ההתייחסות לצורך הניסוי. לחלופין, חיץ elution שנאספו על השלב האחרון של טיהור חלבונים (elution טור כלומר) ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של מדגם החלבון בשיטת קביעת ריכוז החלבון המתאימה ביותר כגון שיטת Kjedahl 33 או לורי שיטה 34. לשם השוואה אובייקטיבית של תוצאות, השתמש באותה השיטה בעקביות באותו המחקר. טווח הריכוז הנדרש עשוי להשתנות בהתאם לדגם של המכשיר. עבור המכשיר בשימוש בפרוטוקול זה, טווח עבודה עדיפה הוא 0.5 - 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה למאגר מדגם ועיון בריק להיפטר microbubbles שיכולים לגרום נפח inaccurACY. שלב זה ניתן לדלג על מודלים קלורימטר חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micropipette וטיפים סטרילי בתוך ארון biocontainment זרימה למינרית, טען את דגימות למאגר שלהם בזוגות לתוך 96 צלחות גם תואם עם המכשיר. מלא את שני הזוגות הראשונים של בארות עם חיץ ושני הזוגות האחרונים עם מים למאגר החיץ וסריקת המים בהתאמה. סריקות-חיץ חיץ לאמת את התאמתו של המכשיר לפני לדגום מדידה (הערכה כלומר טעות מכשור) וכן להקים בסיס; בעוד סריקות מים מנוהלות לנקות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת 96-היטב עם סרט אטים, ולהבטיח כי הבארות נסגרות כמו שצריך לפני שלקחת את הצלחת מתוך קבינט הבטיחות הביולוגי כדי למנוע זיהום מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת בתא מחזיק המדגם בכיוון הנכון. </li></ol> 3. הגדרת פרמטר הניסיון הערה: בהתאם instrumentation, ניתן לטעון דגימות לתוך התא באופן ידני או באמצעות מזרק, או באופן אוטומטי באמצעות autosampler. במקרה זה (כלומר הגדרה תעשייתית), גידול autosampler משמש כדי לחסוך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הרכישה, הזן את המידע המדגם לפי סדר הצלחת הועמסה כאמור בסעיף 2.4. זן ריכוזים אם זמין, אחרת, זן ערכי ריכוז לתוך תוכנת ניתוח לפני ניתוח נתונים (סעיף 4.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות המבטיח ניקוי של תאים עם חומר ניקוי לפני כל סריקה מדגם, אשר צריכה להיות מלווה בצעדים לשטוף במים מרובים כדי להבטיח שאין שאריות דטרגנט נותר בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית של הניסוי ל -20 מעלות צלזיוס, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לידע הקודם של המדגם. עבור חלבונים ידועים, טמפרטורת התחלה שנקבעה מראש ניתן להשתמש, בעוד טמפרטורת התחלה נמוכה יכולה להיות מיושמת על דגימות ידועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה הסופיתהניסוי, למשל 100 ° C. הטמפרטורה הסופית עשויה להשתנות בהתאם על ידע קודם של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הסריקה של הניסוי, למשל 60 ° C / שעה, המהווה את קצב הסריקה הטיפוסי. עם זאת, קצב סריקה עשוי להשתנות תלוי בידע מוקדם של המדגם, למשל 90 ° C / שעה, או 120 ° C / שעה. מומלץ לסרוק דגימות ידועות בשיעורי סריקה שונים כדי להעריך את קינטיקה של התגלגלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות סריקה חוזרות לחקור את ההפיכות של תרמית התגלגלות. השתלשלות חלבון נחשבת הפיכה אם אנתלפיה שהתקבל עבור הסריקה השנייה הוא לפחות 80% מהשווי האנתלפיה עבור הסריקה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבעו את טרמוסטט שלאחר הניסוי עד 10 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות התאים של קלורימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי פרמטרי הגדרת הניסוי נכונים לפני ביצוע הניסוי. אם הכל במקום, להתחיל בניסוי. </li></ol> 4. נתוניםalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזור נתונים גולמיים מהניסוי ובחר מדגם אחד בכל פעם לניתוח. סריקת התייחסות לחסר, חיץ כלומר, מן הסריקה המדגמת. הערה: חיסור הפניה מתבצע באופן אוטומטי על ידי דגמים חדשים של מכשירי DSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן ערך ריכוז מדגם אם זה הושמט כאמור בסעיף 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ולחסר הבסיס מן thermogram רכשה לתת דין וחשבון על הבדלים ביכולות החום של מדינות שקופל ונפתח של חלבון אשר נגרמת על ידי חשיפה של קבוצות הידרופובי למים על התגלגלות. לינארי או הולם עקום מעוקב ניתן ליישם בהתאם לצורה של פרופיל DSC למדגם. לקבלת עקביות, אותו סוג של התאמה צריך לשמש במהלך מחקר, מחקר יציבות בזמן אמת למשל. צעד זה נדרש כדי לעבד את העקומה לשילוב השיא להשיג אנתלפיה של מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אינטגרציה שיא באמצעות שאינו ליניארי לפחות בכושר מרובע. בהתבסס על המוצריידע ליישם שתי מדינות לשני עמים או מודל הלא שתי מדינות לשני עמים. שתי מדינות לשני עמי מודל יכול לשמש עבור מעברים תרמיים שיתופיים אחת, ועבור חלבונים לא-מוכרים, להחיל מודל מדינה ללא ושתיים עד ידע מוצר נוסף זמין. במידת צורך, להתאים עקומה הולמת באמצעות הפונקציה ההולמת העקומה איטרטיבי של של התוכנה והציוד עד שיגיעו השווי צ&#39;י המרובע נשאר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאות שהתקבלו יציג את הערכים עבור נקודת האמצע של טמפרטורות המעבר (TM), אנתלפיה קלוריות (ΔH), ו אנתלפיה van&#39;t הוף (ΔH VH) של המדגם. </li></ol>

<ol>
	<li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+techniques:+applications+in+biology+and+nanoscience.">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li><li>Watson, E. S., O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+microcalorimeter.">Differential microcalorimeter.</a> Patent. , (1966).</li><li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Analysis+of+a+Temperature-Controlled+Scanning+Calorimeter.">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li><li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Specific+Heat+Functions+by+Differential+Scanning+Calorimetry.">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li><li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. 6, 7-33 (1975).</li><li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiabatic+differential+microcalorimeter.">Adiabatic differential microcalorimeter.</a> &#1040;&#1076;&#1080;&#1072;&#1073;&#1072;&#1090;&#1080;&#1095;&#1077;&#1089;&#1082;&#1080;&#1081; &#1076;&#1080;&#1092;&#1092;&#1077;&#1088;&#1077;&#1085;&#1094;&#1080;&#1072;&#1083;&#1100;&#1085;&#1099;&#1081; &#1084;&#1080;&#1082;&#1088;&#1086;&#1082;&#1072;&#1083;&#1086;&#1088;&#1080;&#1084;&#1077;&#1090;&#1088;. , (1970).</li><li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen,+isolated+from+transplantable+tumor.">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), 212-214 (1968).</li><li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , 171-173 (1973).</li><li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+and+changes+in+various+physic-chemical+properties+of+macromolecules+and+supramolecular+structures.">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), 782-799 (1987).</li><li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures.">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li><li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins.">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li><li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+applications+of+differential+scanning+calorimetry.">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li><li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation.">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li><li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen,+ribonuclease+and+myoglobin.">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li><li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure:+a+calorimetric+study.">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li><li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins.">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li><li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+structural+changes+in+bacteriophage+T4+tail+proteins.">The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins.</a> Biofizika. 33, 954-961 (1988).</li><li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations.">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li><li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a., Shnyrov, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetric+investigation+of+phosphatidyl+choline+from+membranes+of+marine+invertebrates.">Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates.</a> J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li><li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating.">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li><li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualification+of+a+differential+scanning+calorimetry+method+for+biophysical+characterization+of+monoclonal+antibodies+and+protein+vaccine+antigens.">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li><li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, (2005).</li><li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter.">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li><li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry.">Differential scanning calorimetry.</a> Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).</li><li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins.">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li><li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor.">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li><li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone.">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li><li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+calorimetric+and+van't+hoff+enthalpies+for+evaluation+of+protein+transition+states.">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li><li>Privalov, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+proteins+and+their+complexes.">Microcalorimetry of proteins and their complexes.</a> Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).</li><li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interpretation+of+Protein+Structure+Through+Relationship+of+Melting+Point+(Tm)+and+Enthalpy+of+Unfolding+(&#916;HU).">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (&#916;HU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+testing+of+new+drug+substances+and+products.">Stability testing of new drug substances and products.</a> Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), (2003).</li><li>Kjeldahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neue+Methode+zur+Bestimmung+des+Stickstoffs+in+organischen+K&#246;rpern+(New+method+for+the+determination+of+nitrogen+in+organic+substances).">Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen K&#246;rpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances).</a> Zeitschrift f&#252;r analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>H&#214;hne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differential Scanning Calorimetry. , (2003).</li><li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermodynamic+definition+of+protein+domains.">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li><li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+drug+stability:+a+formulation+challenge.">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li><li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability.">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li><li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry:+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions.">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li><li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicity,+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins.">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li><li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact.">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li><li>Freire, E., Sch&#214;n, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics.">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li><li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins:+qualification+of+DSC.">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li></ol>

כל הכותבים הם עובדים ב סאנופי פסטר. העבודה מומנה על ידי סנופי פסטר, ודמי פרסום מאמר וידאו זה שולמו על ידי סאנופי פסטר. יש המחברים שום נטיות רלוונטיות או מעורבות פיננסית עם כל ארגון או גוף שיש לו סכסוך כספי עם הנושא או חומרים דנו בכתב היד. אלה כוללים תעסוקה, חברות ייעוץ, בעלות מניות או אופציות, או תמלוגים. אין סיוע בכתב נוצל בייצור של כתב היד הזה.

הליך זה כבר שולב בהצלחת חבילות בדיקת אפיון שונות, כוללים מחקרי יציבות השוואת מוצר 21. במחקרי יציבות בזמן אמת, DSC משמש כדי לפקח T מ, כמו גם להעריך את F א הביולוגי לאורך זמן כדי לקבוע את חיי המדף שלהם. באשר השוואת מוצר, הוא משמש כדי להעריך את ההשפעה של תהליך ושינוי מתקן וכן השפעת צעדי ייצור מפתח על קונפורמציה המבני של המון מיוצר. זה בדרך כלל כולל ההשוואה הישירה של ΔH של הרבה מיוצר למוצר הפנית כאזור המוצר האידיאלי. בנוסף, DSC הוכיחה להיות כלי אנליטי שימושי ללימודי ניסוח מוצר 37. ה- T מ &#39;של חלבון מאגרים שונים בריכוזים שונים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הניסוח כי ומציע את היציבות ביותרהחלבון. כדי להבטיח את האמינות של השיטה הזאת ואת האובייקטיביות של תוצאותיה, חשוב לשמור פרמטרי בדיקה עקביים מהריצה לרוץ בתוך אותו המחקר (למשל, מחקר ניסוח חיסון). עם זאת, ההליך יכול להיות שונה כדי להכיל הבדלים בתכונות הפיזיות של חלבונים שונים. דוגמא שינוי שניתן לעשות היא לשנות את קצב הסריקה של הניסוי 38, 39. חלבונים כי היו מועדים אגרגטים להרכיב כאשר מחומם נבחנו בקצב סריקה מהיר יותר (למשל, 120 ° C / שעה), כדי למנוע את התרומה של אגרגטים לפרופיל המעבר התרמי, כמו גם סתימה בנימי קלורימטר. ראוי לציין כי סריקת קצב יכול להשפיע על תוצאות ניסוי DSC 38. התרחבותה של שיא מעבר התרמית נצפתה עם הגדלת שיעורי סריקה בחלק פרוחלבונים; עם זאת, T מ &#39;נשאר קבוע למדי 38. יתר על כן, צעדי דיאליזת degassing להכנת מדגם הם גם מאוד קריטיים עבור תוצאות מדויקות 31. דיאליזה מבטיחה כי ההבדל היחיד בהרכב המדגם למאגר הוא החלבון; וכך, כל עודף החום נספג על ידי המדגם ניתן לייחס קיבולת החום של החלבון. Degassing מבטיחה ניתוח נפח מדויק, כמו אקסטרפולציה של פרמטר תרמודינמי מניחה שאירוע ההתגלגלות מתרחש תחת נפח קבוע ולחץ 31. החלק לחץ מתמיד של ההנחה היא מוסברת על ידי שמירת לחץ החנקן של מערכת כאמור בסעיף 1.1 של ההליך. בהשוואה לשיטות אחרות של בקביעת יציבותה של תצורות חלבון כגון מעגלי dichroism (CD) פלואורסצנטי Spectroscopies, DSC מציעה מספר יתרונות בתוך comהגדרה מסחרית לרבות חיסכון בעלויות ובזמן. ראשית, העיצוב adiabatic של קלורימטר סריקה ההפרש מאפשרת מדידה של יציבות תרמית עם דיוק טמפרטורה טובה יותר לעומת מדידות עם מכשור עבור דיסקים CD ו הקרינה Spectroscopies 6. שנית, בניגוד CD, את הדיוק של נתוני DSC אינו תלוי helicity של החלבון 39, 40; עם זאת, CD מספק מידע נוסף על ההתגלגלות של המבנה מהשני, אשר יהיה חינם אל DSC 41. בנוסף, שמירת לחץ קבוע של מערכת DSC מאפשר לבדיקה עם טווח רחב של טמפרטורות ללא רותחים המדגם; וכך, מגוון רחב של חלבונים ניתן לבדוק על ידי DSC. בעוד DSC היא גישה מהירה יחסית וישירה כדי לקבוע את יציבות התרמית של תרופות ביולוגיות, זה לא בלי מגבלות. ראשית, הבסיסקו צעד חיסור מציג צורה כלשהי של חוסר עקביות אנושית לתוך ניתוח נתונים הגולמי; וכך, וריאציות בתוצאות ניתן להבחין בין משתמשים שונים. שנית, calorimeters סריקת ההפרש יש מגבלות ריכוז מינימאליות אשר עלול להיות קשה להשיג בקנה מידת ייצור בתפזורת. שלישית, ΔH של denaturation תרמית ההפיכה אינו מוחלט; מה שמרמז על כך נגזר ΔG (אינדיקטור של יציבות חלבון) בתרחישים דומים יכול להיות מטעה. יתר על כן, השיטה מתאימה ביותר דגימות מטוהרות. נוכחות של זיהומים עשויה גם לגרום שינוי T מ אם קיימת אינטראקציה עם החלבון תחת חקירה, או המראה של מעברי תרמית חדשים אם אין אינטראקציה. במקרה כל תכונות נוספות אלה על thermograms ניתן לייחס בטעות דגימות, ובכך להשפיע על הפרשנות של התוצאות. למרות מגבלות אלה, DSC נשאר שיטה אמינה שיכולה לספק מידע מפורט על התרמודינמית החלבון ה התגלגלות תהליך אם מיושם כהלכה 42. לסיכום, DSC מציע יתרון משמעותי ככלי הודעה קונפורמציה למוצרי חיסון הביניים שלהם. שני הפרמטרים, T מ &#39;ΔH, שנאספו עבור מערך של הרבה של אותו מוצר יכול להיות הבסיס האמפירי, שניתן להשתמש בהם כדי לבחון את ההשפעה של שינויים בתהליך, ניסוח, ותנאי אחסון על מבנה שלישוני ויציבות של חלבון אנטיגנים נגיפיים 21, 43.

סריקה calorimetry דיפרנציאלי (DSC) היא שיטה ניסיונית אשר מודד את ההבדל ישירות ספיגת אנרגיית חום המתרחשים קרוב משפחה מדגם עזר במהלך שינוי הטמפרטורה מוסדר 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10,, 11, 12. שבוצעה במשך קלורימטר סריקת הפרש, השיטה כרוכה החדרת אנרגית חום לתוך תא מדגם תא התייחסות בו זמנית תוך הגדלת הטמפרטורה זהה של התאים הם לאורך זמן 2, 13,14. בשל הבדל בהרכב המדגם ואת ההתייחסות, כמות האנרגיה שונה תידרש כדי להעלות את הטמפרטורה של התאים 2, 12, 13. לפיכך, כמות העולה על האנרגיה הנדרשת כדי לפצות על הבדלי הטמפרטורה בין התאים נמדד בקורלציה ישירות תכונות תרמודינמיות ספציפיים של המדגם 1, 3. ב -1960, MJ אוניל וא ווטסון של פרקין אלמר פתחו את קלורימטר סריקת ההפרש הראשון למדוד את זרימת החום של חומרים מוצקים 2, 3, 4. במקביל, PL Privalov ו- DR Monaseldze EL של המכון לפיזיקה, הרפובליקה של גאורגיה (ברית המועצות לשעבר) יצר קלורימטר adiabatic ההפרש ייחודי שיכול לשמש FOr ביוכימיים מחקר 5, 6. בהמשך לכך, צוות של Andronikashvili במכון לפיסיקה, הרפובליקה של גאורגיה, דיווח קיבולת החום של ביומולקולות כגון חלבונים סיביים כדוריים, DNA, RNA באמצעות DSC 7, 8, 9. מספר צוותים בראשות Sturtevant 10, 11, 12, ברנדט 13, ו Privalov 14, 15, 16 מתמקדת בפיתוח של תיאוריה ויישומים מעשיים של DSC לחקור את הפרטים התרמודינמית של התגלגלות חלבון. שווי DSC בלימוד מבנים מולקולריים גדולים כמו פאגים, הכלורופלסט, גבישים נוזליים פוספוליפידים, וחלבוני בשר גם דווח 17 </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC הפכה כעת שבשגרה במחקר של תרופות ופיתוח עבור הערכת יציבות תרמית של ביומולקולות, במיוחד חלבונים 1, 21, 22. זהו בעיקר בשל התקדמות מבחינת רגישות ואוטומציה של המכשור המשמש לביצוע הניסוי 23, 24. כאן, התוצאה הסופית של הניסוי DSC, כלומר, קיבול חום טוחנת כפונקציה של הטמפרטורה, משמש כדי להעריך את הפרמטרים הבאים התרמודינמית (שינוי קיבול חום (ΔCp), אנתלפיה (ΔH), האנטרופיה (ΔS) אנרגיה חופשית, ו גיבס (ΔG)) באמצעות המשוואה הבאה: eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="משוואה 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) איפה Cp נמדד קיבול חום; q הוא זרימת החום לתוך החומר למבחן; T 0 ו- T הם הטמפרטורות התחלתי וסופי של המעבר בהתאמה 22, 25. כמו כן ראוי לציין כי המשוואות לעיל חלות לחלבונים חד תחום שיכול לעבור מעבר של שתי מדינות והפיכות תרמית התגלגלות 22. ניתוח של חלבונים מורכבים יותר (למשל, חלבונים שאינם שתי מדינות לשני עמים, ו oligomers) hותעיף דווח על ידי ואח &#39;פריירה. 26; ג&#39;ונסון et al. 27; ו Kasimova et al. 28. על מנת לקבוע האם חלבון עובר המעבר של שתי מדינות או צורות ביניים במהלך denaturation תרמית, אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני (ΔH; התייחס גם קאל ΔH אנתלפיה קלוריות כמו) מושווה אנתלפיה נגזר באמצעות המשוואה van&#39;t הוף כדלקמן (גם המכונה אנתלפיה van&#39;t הוף; ΔH VH): <img alt="משוואה 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) איפה T מ &#39;היא הטמפרטורה האמצע של המעבר, R הוא קבוע הגזים האידיאלי (1.987 cal mol -1 K -1) ו- Y הוא חלק קטן מהאוכלוסייה חלבון במדינת פרש 16, 29. אםΔH VH שווה ΔH קאל; או ΔH VH / ΔH קאל שווה ל -1, אז החלבון עובר מעבר &quot;הכל או לא כלום&quot; (כלומר מעבר של שתי מדינות) 16, 25, 29. עם זאת, אם ΔH VH הוא פחות מ ΔH קאל; או ΔH VH / ΔH קאל הוא פחות מ 1, החלבון עובר מעבר הלא שתי מדינות לשני עמים 16, 25, 29. יחס ΔH VH / ΔH קאל גם תואם את חלקם של מבנה החלבון שנמס כיחידה שיתופית התרמודינמית או התחום 26. הפרמטרים התרמודינמית הנ&quot;ל כגון ΔG ו ΔH לספק מידע שימושי על יציבות התרמית של חלבונים, כולל תרופות ביולוגיות<html> 30. עם זאת, הדגש יהיה מונח על T מ &#39;ΔH בפרסום זה, כפי שהם על הערכים המדווחים עבור פרוטוקול זה. מ T היא טמפרטורת נקודת האמצע של המעבר, שבו המקופל והמדינות הפרשיות של החלבון הן בשיווי המשקל (כלומר, ΔG = 0) 25, 31. ככל T מ &#39;של חלבון, גבוה יותר יציבות תרמית שלה 31. ΔH תואמת את השטח מתחת לשיא (ים) של קיבול חום לעומת גרף טמפרטורה (הידוע גם בשם thermogram) שנוצר בסוף הניסוי DSC 16, 25. זוהי האנרגיה הנדרשת כדי לפגל חלבונים והוא יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי פעיל (א F) בניסוח חלבון (כלומר, חלקם של חלבונים עם קונפורמציה פעיל מדגם) באמצעות המשוואה הבאה: jove_content &quot;&gt; <img alt="משוואה 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) איפה ΔH הוא אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני של מדגם החלבון ו- Q הוא אנתלפיה שנקבע הפניה היטב מאופיינת או חלבון סטנדרטי 22. האמידה של F היא משמעותית לניטור היציבות בזמן האמת של מוצרים, כמו גם ביצוע מחקרי יציבות בתנאי קיצון כנדרשת בהנחיות ICH 32. גם השוואה של ΔH מספק מידע על הקומפקטיות של קונפורמציה מבנה שלישוני של חלבון 31. פרוטוקול זה מפרט נוהל להערכת יציבות התרמית של חלבונים בסביבה תעשייתית כבר נעשה שימוש נרחב לגיבוש חיסונים. הוא פותח באמצעות קלורימטר סריקת הפרש אוטומטי שיוצר f תוצאות לשחזוראו ריכוזי חלבון נמוך כמו 300 מיקרוגרם / מ&quot;ל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1375">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:331px;">Differential Scanning Calorimeter</td>
			<td style="width:188px;">Malvern Instruments Ltd</td>
			<td style="width:119px;">28428948 (Via GE Healthcare)</td>
			<td style="width:739px;">Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Contrad 100</td>
			<td style="width:188px;">Decon Laboratories Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1504</td>
			<td>Dilute with water to 20% before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500&#181;L Polypropylene round bottom 96 well plate</td>
			<td>Canadian Life Science</td>
			<td>ML072100</td>
			<td>Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">MicroCal ThermoVac&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Malvern Instruments Ltd</td>
			<td style="width:119px;">N/Ap</td>
			<td>provided with the Cap VP DSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td style="width:188px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">Logic+ - A2</td>
			<td>biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Slide-A-Lyzer dialysis cassette</td>
			<td style="width:188px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">66810 or 66380</td>
			<td>to equilibrate the sample and buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential scanning calorimetry &#8212; a method for assessing the thermal stability and conformation of protein antigen

סריקת calorimetry דיפרנציאלי (DSC) הוא שיטה אנליטית אשר מודדת את קיבולת חום הטוחנת של דגימות כפונקציה של טמפרטורה. במקרה של דגימות חלבון, פרופילי DSC לספק מידע על יציבות תרמית, ובמידה מסוימת הוא מעין &quot;טביעת אצבע&quot; מבנית שיכול לשמש כדי להעריך קונפורמציה מבני. הדבר מתבצע באמצעות קלורימטר סריקת הפרש המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (נמסה בטמפרטורה; T מ &#39;) ואת האנרגיה הנדרשת כדי לשבש את יחסי הגומלין לייצוב המבנה השלישוני (אנתלפיה; ΔH) של חלבונים. נעשות השוואות בין הניסוחים כמו גם הרבה ייצור, והבדלי ערכים הנגזרים להצביע על הבדלים יציבים תרמית קונפורמציה מבני. נתונים הממחישים את שימוש DSC בסביבה תעשייתית עבור מחקרי יציבות, כמו גם ניטור צעדי ייצור עיקריים מופיעים הוכחה ליעילות של פרו זהtocol. לשם השוואה לשיטות אחרות להערכת יציבות התרמית של תצורות חלבון, DSC היא חסכונית, דורשת כמה צעדי הכנת מדגם, וגם מספקת פרופיל התרמודינמית מלא של תהליך התגלגלות החלבון.

הנתונים הגולמיים מרוב ניסויי DSC מוצגים בתור שטף חום לעומת גרף טמפרטורה, כמו קלורימטר למעשה מודד את הפער בשיעור של זרימת חום לתוך התמיסה מדגם חיץ 35. לכן, אם שני התאים (כלומר תאי מדגם הפניה) מכילים פתרונות זהים במהלך ניסוי, את הנתונים הגולמיים מן הסריקה צריכים להיות קו ישר בלי שום שיאים נצפים. כל שיא נצפה ניתן לייחס טעות מדידה (פגום למשל או מזוהם תאים), וזאת הסיבה פועלת סריקות חיץ לפני לדגום ניתוח הוא מבחן התאמת מערכת נאות. איור 1 מדגים את התוצאה של סריקת חיץ אופיינית המציין כי קלורימטר היה במצב עבודה טוב לפני לדגום ניתוח. איור 2 מציג את הנתונים הגולמיים עבור ניסוי DSC שבוצעו על diffהמון erent של שתי דגימות חלבון. כפי שנרמז קודם לכן, הפסגות ציינו הם הבדלי שטף החום על מדגם המאגרים שלהם. הבדלים בריכוז מדגם יכולים לגרום וריאציות קיבול חום שרשם קלורימטר; עם זאת, הווריאציות הללו הן מנורמלות במהלך ניתוח מדגם כאמור בסעיף 4.2 של ההליך. ריכוזים גבוהים יותר גם יכולים לחשוף תחומי התרמודינמית נוספים לא תורם המעבר בריכוזים נמוכים. בנוסף, כל מעבר מייצג תחום התרמודינמית שעשויה לכלול תחומים מבניים אחד או יותר של החלבון 36. במקרה זה, החלבון 1 יש שלושה תחומים מבניים שנמסים בשיתוף פעולה. איור 3 מציג את התוצאות שנוצרו מהניתוח של הנתונים הגולמיים עבור חלבון 1 ו -2 מוצגים באיור 2, כלומר, לאחר חיסור בסיס וסיבי עקומת איטרטיביtting. Thermograms וכתוצאה מכך כבר מנורמל לסריקת שיעור (מתבצע באופן אוטומטי על ידי אלגוריתם שנקבע מראש בתוכנת הניתוח) וריכוז; ובכך, הצגת התוצאות של ניסוי קיבול חום השוואה מול גרפי טמפרטורה. תוכנת הניתוח משתמשת בנתוני קיבולת החום לעומת גרפי טמפרטורה, כגון T מ &#39;ΔCp, לגזור פרמטרים תרמודינמיים אחרים באמצעות וריאציות של המשוואות שניתנו לעיל תלוי cooperativity של חלבון התגלגלות. כאשר בודקים דגימות ידועות, הגדרת טווח הטמפרטורה המתאימה הוא חיוני. אחרת, thermograms שלם עלול לגרום, כפי שמודגם באיור 4. למרות T מטר מ- פרופילים כאלה ניתן לגזור, ΔH לא ניתן לקבוע במדויק. לכן, המדגם חייב להערכה מחדש עם טווח טמפרטורות גדול יותר כדי ללכוד את המעבר התרמי לחלוטין. כמה חלבונים גם מחדשטופס adily אגרגטים לאחר denaturation המלא, ותוצאה הוא קיבול חום שלאחר מעבר הגדלה: לעתים קרובות זה נראה כמו thermogram שלם כפי שמודגם באיור 2B. עם זאת, retesting עם טמפרטורה סופית גבוהה יכול לעזור לאשר אם יש התרחשות של מעבר קונפורמציה באותו האזור של thermogram או שזה רק האפקט קליט החום של אגרגטים חלבון. יציבות תרמית היא אחת התכונות הפיסיקליות המשמעותיות ביותר של חלבונים ומוצרים מבוססי חלבון בענף 37. בתחום התרופות, הוא משמש כדי לקבוע את היציבות של התרופות הביולוגיות בתנאים שונים, כולל כריות ניסוח וגורמים סביבתיים כגון לחות וטמפרטורה. כמו כן הוא משמש כדי לפקח צעד ייצור מפתח (למשל, טיהור רעלים) על מנת להבטיח עקביות קונפורמציה בין המון ייצור. <strong<html> &gt; דמוי 5 ו -6 להמחיש את שימוש DSC לבחון את ההשפעות של תנאים דטוקסיפיקציה ומחסני כימיקלי בהתאמה על יציבות קונפורמציה מבנית של שני חלבונים שונים. ההבדלים המשמעותיים ב TM ו ΔH להצביע על שינויי קונפורמציה ושפלת חלבון בהתאמה. בנוסף, אובדן המעבר השלישי באיור 6 נוסף ממחיש את השפלתה של תחום אשר אושר על ידי ירידה במשקל מולקולרי כאשר הדגימות נותחו באמצעות כרומטוגרפיה בגודל הדרה עם פיזור אור רב-זווית (SEC-יונקים) ( מידע לא מוצג). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> איור 1: סורק הצפה. דמיון השיפוע של כל סריקה ללא פסגות נצפות מציין כי המכשיר נמצא במצב עבודה טוב שנוצר תוצאות לשחזור.//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> איור 2: נתונים גולמיים שנאספו מניסויי DSC. גרפים אלה הם ייצוגים טובים של נתונים לא המוסברים (גלם) שנרכשו לאחר ריצות ניסיון (קרי בטרם חיסור עקום בסיס הולם). כל שורה מייצגת הרבה ייצור. חלבון 2 נוטה לצבור יותר בקלות על חימום, וכתוצאה מכך עלייה בקיבולת חום מעל 100 מעלות צלזיוס באזור-המעבר פוסט של thermogram. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; איור 3: נתח נתוני DSC. גרפים אלה הם ייצוגים טובים של נתוני DSC נתחו (כלומר, לאחר חיסור מחקר ולאחר עקומה הולמת). הקו הכחול מייצג את thermogram לאחר חיסור בסיס, ואילו הקו האדום מייצג את העקומה עם בכושר הטוב ביותר אל thermogram. (א) T מ &#39;ΔH עבור חלבון 1 לדוגמא # 12 הם 80.16 ° C ו- 1.69 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ב) מ T ו ΔH עבור חלבון 1 לדוגמא # 13 הם 80.15 ° C ו- 1.71 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ג) T מ &#39;ΔH עבור חלבון 2 לדוגמא # 21 הם 75.01 ° C ו- 4.08 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ד) מ T ו ΔH עבור חלבון 2 לדוגמא # 22 הם 75.67 ° C ו- 4.22 x 10 6 cal / mol בהתאמה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי</a>לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> איור 4: Thermogram Incomplete. נתונים גולמיים לאסוף עבור חלבון 1 ונותח טווח טמפרטורות לקוי. הטמפרטורה הסופית של הניסוי נקבע ל -90 מעלות צלזיוס אשר לא להתאים את פרופיל המעבר כולו של חלבון לעומת הניסוי עבור איור 2 א אשר נקבע ל -120 מעלות צלזיוס. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> איור 5: ניתחו נתונים מראה את ההשפעה של ניקוי רעלים כימיים על מבנה שלישוני של חלבון 1. (א) חלבון 1 הוא רעלן קונפורמציה המקורית שלו ואת חהS M T שלה ב 56.84 מעלות צלזיוס, ΔH ב 2.57 x 10 5 cal / mol. (ב) טופס detoxified של חלבון 1 (toxoid כלומר) יש T מ וערכים ΔH של 81.01 ° C ו- 1.89 x 10 6 cal / mol בהתאמה. לפיכך, ניתן להסיק כי צעד הגמילה הציג צורה כלשהי של וריאציה על קונפורמציה המבני של חלבוני 1 אשר מקנה יציבות רבה יותר (מ T גבוה) בצורת detoxified שלה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> איור 6: נתח נתונים מראים את ההשפעה של תנאי אחסון על הקונפורמציה של חלבון 3. גרפים אלו ממחישים את ההשפעה של טמפרטורת אחסון (2 - 8 ° C) על יציבות מבנה שליישונים של פרוחלבון 3 למעלה מ -30 שבועות. T מ וערכים ΔH עבור חלבון 3 בבית (א) 8 וה ה -38 בשבוע (B) של אחסון ניתנים בטבלה 1 להלן. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לִטעוֹם </td><td> Tm 1 (° C) </td><td> ΔH 1 (cal / mol) </td><td> Tm 2 (מעלות צלזיוס) </td><td> ΔH 2 (cal / mol) </td><td> Tm 3 (° C) </td><td> ΔH 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> חלבון 3 מאוחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 8 שבועות </td><td> 61.91 </td><td> 1.71 x 10 5 </td><td> 75.54 </td><td> 2.17 x 10 5 </td><td> 90.29 </td><td> 4.17 x 10 5 </td></tr><tr><tד&gt; חלבון 3 מאוחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 38 שבועות </td><td> 61.87 </td><td> 1.66 x 10 5 </td><td> 75.18 </td><td> 1.46 x 10 5 </td><td> 90.22 </td><td> 5.76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: TM ו ΔH ערכים עבור חלבון 3 בבית שבוע 8 וה ה -38 של אחסון של 2 - 8 מעלות צלזיוס. למרות ערכי m T בשתי נקודות הזמן דומים, ההבדל בערכי ΔH מציין כי המבנה שליישונים של חלבון 3 נפגם כדי כך בחלוף 30 שבועות בתנאי האחסון שצוין.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Scanning Calorimetry Ã¢â‚¬â€ A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen at JoVE.com

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

differential-scanning-calorimetry-method-for-assessing-thermal

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Biochemistry

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

38.6K Views.  Sanofi Pasteur Limited.  סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון. 

Video: Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be streamlined by heat treatment (blanching). A blanching apparatus can be designed more precisely if the thermal properties of the leaves are known in detail, i.e., the specific heat capacity and thermal conductivity. The measurement of these properties is time consuming and labor intensive, and usually requires invasive methods that contact the sample directly. This can reduce the product yield and may be incompatible with containment requirements, e.g., in the context of good manufacturing practice. To address these issues, a non-invasive, contact-free method was developed that determines the specific heat capacity and thermal conductivity of an intact plant leaf in about one minute. The method involves the application of a short laser pulse of defined length and intensity to a small area of the leaf sample, causing a temperature increase that is measured using a near infrared sensor. The temperature increase is combined with known leaf properties (thickness and density) to determine the specific heat capacity. The thermal conductivity is then calculated based on the profile of the subsequent temperature decline, taking thermal radiation and convective heat transfer into account. The associated calculations and critical aspects of sample handling are discussed.

A method was developed to determine the specific heat capacity and thermal conductivity of leaf tissue by non-invasive, contact-free near infrared laser probing, which requires less than 1 min per sample.

ליזר מהיר גשוש שיטה מקלה על קביעת פולשני צור-חינם של תכונות תרמיות ליף

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To evaluate the potential biotechnical value of these proteins, the analysis of protein structures and functions is a central challenge in this program. The stability of protein sample is essential to provide meaningful assay results and increase the crystallizability of the targets. The thermal shift assay (TSA), a fluorescence-based technique, is established as a popular method for optimizing the conditions for protein stability in high-throughput. In TSAs, the employed fluorophores are extrinsic, environmentally-sensitive dyes. An alternative, similar technique is nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF), which relies on protein native fluorescence. We present here a novel osmolyte screen, a 96-condition screen of organic additives designed to guide crystallization trials through preliminary TSA experiments. Together with previously-developed pH and salt screens, the set of three screens provides a comprehensive analysis of protein stability in a wide range of buffer systems and additives. The utility of the screens is demonstrated in the TSA and nanoDSF analysis of lysozyme and Protein X, a target protein of the Virus-X project.

A protocol is presented to rapidly test the thermal stability of proteins in a variety of conditions through thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry. Buffer systems, salts and additives, together comprising three unique stability screens, are assayed with proteins to identify suitable buffers for functional and structural studies.

איך לייצב את חלבון: מסכי יציבות תרמית משמרת מבחני ו ננו דיפרנציאלית סריקה Fluorimetry בפרוייקט וירוס-X

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.