We would like to thank Dr. Lei Chen (Icahn School of Medicine at Mount Sinai, NY) who first established the use of this model in our laboratory, and to Dr. Gretchen Wolff (German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany) for disseminating the technique in our laboratory. Supported in part by HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569, and NSC 2015/17/B/NZ7/02985.

הנהלים מעורבים בפרוטוקול הבא אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדיים מיאמי ועדת שימוש (IACUC). בנוסף, כל ההליכים מתנהלים במתקנים שאושרו על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה (AAALAC). 1. הכנת עכברים לכירורגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם isoflurane מעורבב עם חמצן, באמצעות מערכת הרדמת מעבדה. השתמש isoflurane בשעה מוגדר בין 4-5% ותזרים חמצן 2 ליטר / דקה על מכונת המסחרי (ראה לוח חומרים). מעבירים את החיה על פני השטח ניתוח, תחת סטראו, ולקיים הרדמה באמצעות חרטומו (להשתמש isoflurane הגדרת 1.5 - תזרים 2.5 וחמצן ב 2 ליטר / דקה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח שמירה על קצב עכבר הנשימה הוא סביב 1 - 2 נשימה / sec בלי להתנשף. בנוסף, להבטיח כי בעל החיים לא להפגין תגובה לגירוי שפם הדוושה reflex (קמצוץ הבוהן). צג הנשימה שיעור ומאמץ במהלך הניתוח, לפחות כל 5 דקות. עקוב ספציפי מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש והנחיות וטרינרים לניטור הרדמה מכרסמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ירידה של חומר סיכה עיניים על כל עין באמצעות ספוגית סטרילית על מנת למנוע יובש. מנהל של אנטי דלקתי משכך כאבים כדי להקל נוחות מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם החיה שוכבת על גבה, לשמור על הרדמה באמצעות חרטומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אזור הצוואר של החיה על ידי מנגב את האזור שלוש פעמים עם 70% ו chlorhexidine אתנול. לגלח את אזור הניתוח של החיה באמצעות סכין גילוח (כמפורט להלן). </li></ol> 2. דיסקציה של עורק התרדמה המשותף (CCA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההליך המיקרו-כירורגיה כולו תחת סטראו. בעזרת מספריים כירורגיים מלקחיים לבצע חתך קו האמצע רדוד בצוואר, מלמעלה עצם החזה אל מתחת ל tהוא הלסת (כ -3 עד 4 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחי שומן בקפידה נפרד ורקמות חיבור לחשוף את קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כרית (חפץ עגול, כ -0.5 ס&quot;מ קוטר) על החלק האחורי של הצוואר של העכבר כדי להאריך את הצוואר, עוד חשיפת האזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הרקמות או באמצעות מפשק רקמות או ווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצד שמאל של החיה של קנה הנשימה, בזהירות למרוט לגזרים את רקמת החיבור לחשוף את המרכז לאמנות עכשווית שמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להסיר את כל רקמת החיבור בזהירות לחשוף הסתעפות המרכז לאמנות העכשווית, והתחילה הוא עורקי הראש חיצוניים ופנימיים. </li></ol> 3. הכנה של CCA עבור עירוי ואלכוהול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס שני מגזרי ניילון תפר (כ 1 סנטימטר כל אחת) תחת עורק ראשי חיצוני (ECA), באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח פקעת קבעה בנקודה הגבוהה ביותר האפשרית של ECA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית של ECA, מיד מעל הסתעפות המרכז לאמנות עכשווית, מקוםקשר נשלף. קשר זה צריך להיות משוחרר לעומת הקשר העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את CCA באמצעות קליפ כלי, בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את עורק התרדמה הפנימי (רשפ&quot;ת) באמצעות קליפ כלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים האביב microdissection באמצעות לבצע חתך קטן ECA (כ -2 מ&quot;מ), בין שני הקשרים. </li></ol> 4. עירוי ואלכוהול באמצעות הרשפ&quot;ת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מערכת אינפוזיה. צרף 6 אינץ &#39;של צינור נימים (מידות אידיאלית: 2.5 מ&quot;מ x 1.2 מ&quot;מ) כדי מזרק טוברקולין המכיל 250 μl של החומר להיות חדור (תרופות, פתוגנים, שלפוחית ​​תאית, בין יתר) והכנס את קצה הנימים בעדינות לתוך החתך מבוצע בשלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להחליק במורד הנימים עד שהוא מגיע נקודת אמצע בין ההסתעפות ואת הקליפ סגירת CCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבול את קשר ECA הנמוך. ודא כי הקשר הוא רופף מספיק כדי לאפשר נזילות נימים חזקות מספיק כדי למנוע דולףז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קליפ מן ICA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפעיל לחץ על בוכנת מזרק עירוי החומר המאפשר בכ 10 μl לשנייה. </li></ol> 5. נהלי אינפוזיה הודעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קליפ בחזרה על ICA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות את צינור נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבול את קשר ECA הנמוך לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קליפים מתוך הרשפ&quot;ת ובין CCA. </li></ol> סגירת חתך 6. שלאחר ניתוח טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור ווים מפשקים או רקמות כרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור תפר נקי באמצעות תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת החתך באמצעות ניילון תפר / מחט מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהל אנטי דלקתי משכך כאבים כדי להקל אי נוחות לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חיה בכלוב מונח על כרית חימום לפחות התאוששות 1 hr וצג. </li></ol>

<ol>
	<li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research.">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).</li><li>Frisella, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+recombinant+adeno-associated+virus+improves+cognitive+function+in+a+murine+model+of+mucopolysaccharidosis+type+VII.">Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII.</a> Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).</li><li>Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+growth+and+angiogenesis+around+cortical+stroke.">Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke.</a> Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).</li><li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+methotrexate+to+epidermal+growth+factor+receptor-positive+brain+tumors+by+means+of+cetuximab+(IMC-C225)+dendrimer+bioconjugates.">Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates.</a> Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).</li><li>Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+ischemic+mouse+brain+induced+by+stem+cell-derived+brain+implants.">Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).</li><li>Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+biochemical+analysis+of+carrier-mediated+efflux+of+drugs+through+the+blood-brain+and+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+importance+in+the+drug+delivery+to+the+brain.">Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain.</a> J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+and+gene+delivery+to+the+brain:+the+vascular+route.">Drug and gene delivery to the brain: the vascular route.</a> Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).</li><li>Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrous+cycle+influences+organ-specific+metastasis+of+B16F10+melanoma+cells.">Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells.</a> Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).</li><li>Huang, R. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+targeted+to+the+brain+using+a+transferrin-conjugated+polyethyleneglycol-modified+polyamidoamine+dendrimer.">Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer.</a> FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).</li><li>Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracarotid+delivery+of+oncolytic+HSV+vector+G47Delta+to+metastatic+breast+cancer+in+the+brain.">Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain.</a> Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system.">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).</li><li>Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+Selenium+Supplementation+Modulates+Growth+of+Brain+Metastatic+Tumors+and+Changes+the+Expression+of+Adhesion+Molecules+in+Brain+Microvessels.">Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels.</a> Biol Trace Elem Res. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

המיקרו-כירורגיה העירוי המתואר כאן כבר הוכיח את עצמו מאוד מוצלח ומספק חומרים אקסוגניים של תכונות ביולוגיות שונות לתוך מערכת העצבים המרכזי, מניעת הפצה רצויה בכל הגוף 1, 12. שיבוש של מחסום דם מוח הוא מאפיין פתולוגי של מחלות כמה הקשורות במערכת העצבים המרכזית; ולכן בהערכת היחסים של חומרים אקסוגניים עם המחסום שבין הדם למוח היא בעלת חשיבות ועניין עיקריים. מודל ניתוח זה מוצג גורם טראומה מוגבלת לבעלי החיים והיא קשורה עם תמותה 1 נמוכה מאוד, 12. זאת ועוד, הנוהל אינו מפריע לתפקוד מערכת העצבים המרכזי או זרימת דם במוח 1, 12. ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא לבצע את החתך הנכון ECA, אשר צריך להרשות רקהחדרת צינור הנימים. חתך רחב יותר יגרום דליפה של החומר להיות חדורה, המחייב עוד ניתוח ECA באתר ההפך. כדי למנוע מצב זה, צינורות הנימים צריכים להיות בקוטר גדול יותר לחתוך, ואת צריך להיות גם קצה חד על מנת להקל את הכניסה דרך העורק. בהיבט הטכני, כוח אדם מאומן היטב הוא מסוגל לבצע את הניתוח הזה תוך 20 דקות. המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו היא האפשרות של עירוי רק פעם אחת דרך אותו ICA. למסירת חומר חזרה לתוך מערכת העצבים המרכזי, כלי microport צריך לשמש ו תואר בעבר 1 טכניקת .the המתוארת כאן יש הפוטנציאל לסייע במחקרים על אינטראקציות חיוביות ושליליות חדשים בתוך BBB, כמו גם לספק פתוגנים תרופות, וסוכנים פיסיולוגיים לתוך המוח.

במודלים vivo של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות דורשים משלוח יעיל של חומרים אקסוגניים, כגון תרופות, פתוגנים, או exosomes, לתוך המוח. לכן, שיטת הצגה אידיאלית צריכה לגרום טראומה מינימאלית לבעל החיים, לשמור על שלמותה של הרשת העצבית, ולהשיג ריכוזי חומר גבוהים במוח 1. מספר שיטות כירורגיות של משלוח חומר מקומי תוארו, כולל תוך-נדן, תוך-מוחי, וזריקות תוך חדרים או שתלים 2, 3, 4, 5. גישות אלה, עם זאת, הנחשבים טראומטיות אל מערכת העצבים המרכזי, ולאפשר מתן בהיקפים נמוכים בלבד של החומר של עניין. יתר על כן, הוצע כי חומרים אקסוגניים ניתן להסיר במהירות על ידי הנוזל השדרתי 6 </sעד&gt;, ומגוון חדירה נמוך אל מוח parenchyma נצפה 7 כאשר הטכניקות הנ&quot;ל מועסקות. שיטות משלוח מערכתיות, כגון פה, ריאות, תת עורית, ומסלולים תוך ורידים, נמצאות בשימוש נפוצה יותר במודלים של בעלי חיים, אם כי הם מפגינים אפקטיביים נמוכים באספקת החומרים אל מערכת העצבים המרכזי, בשל הספיגה ידי גופים אחרים 8, 9. לכן, המסלולים האלה של משלוח דורשים מנות גבוהות של חומרים המנוהלים, מעלים את הסיכון של תופעות לוואי רעיל 10, 11. כאן אנו מתארים טכניקה המיקרו-כירורגיה עירוי עכבר, אשר למעשה מספקת חומרים ישירות לתוך המוח דרך עורק התרדמה הפנימי. בנוסף למיקוד המסירה של מערכת העצבים המרכזית, טכניקה זו אינה לעקוף מחסומים פיזיולוגי ולכן הוא רלוונטי מאוד Biologicaתהליכי l המעורבים הקטעים של רפויים או פתוגנים לתוך המוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="635">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Anesthesia instrument</td>
			<td style="width:149px;">Vetequip</td>
			<td align="right" style="width:119px;">901806</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">14558-09</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Surgical forceps straight tip</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">00108-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Surgical forceps angled tip</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">00109-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:119px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Nylon suture</td>
			<td style="width:149px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SUT-S 104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010&#8221; x 0.005&#8221; per ft.)&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MRE01050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Closing suture</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">95057-036</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:149px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td style="width:149px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">50-121-8005</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse microsurgery infusion technique for targeted substance delivery into the cns via the internal carotid artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

הטכניקה המיקרו-כירורגיה עירוי העכבר המתואר כאן הוא מאוד תכליתי ויש בו נעשה שימוש כדי לספק חומרים שונים ישירות לתוך המוח, כולל אספקה של תאים סרטניים במודל נציג של היווצרות גרורות במוח 1, 12. טכניקה זו מתאימה גם להעריך את ההיבטים פתולוגית של פתוגנים שונים במערכת העצבים המרכזית. במודל עכברים של הידבקות ב- HIV, ניתוח העירוי שמש להזריק חלקיקים נגיפיים ישירות לתוך CCA. מצאנו כי 7 ימים לאחר הניתוח, מערכת העצבים המרכזית הייתה חיובית ל- HIV על ידי PCR בזמן אמת. יתר על כן, הזיהום בחצי הכדור ipsilateral היה 6-10 מקפל גבוה יותר מאשר בחצי הכדור הנגדי (איור 2). גישה מתאימה נוספת של ניתוח אינפוזיה המתואר כאן היא לספק<html> שלפוחית ​​תאית (ECVs), בעיקר exosomes, לתוך מערכת העצבים המרכזי. איור 3 מציג את הנוכחות של CD63, סמן exosomes, שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) במוח ipsilateral של עכבר 24 שעות לאחר עירוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54804/54804fig1.jpg" /> איור 1: ייצוג סכמטי של עירוי דרך עורק התרדמה הפנימי. ב הכנס (א) ו- (ב) מתאר את הלוקליזציה של קשרים העליונים ותחתונים, בהתאמה; (ג) מייצג את החתך הקטן ECA, שדרכו צינור נימי מוכנס (קו אפור). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54804/54804fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> 4804fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2: HIV זיהוי על ידי PCR בזמן אמת אחרי עירוי ויראלי דרך עורק התרדמה הפנימי. ברים לציין רמות HIV DNA ממוצעות שנקטפו מעכברים 7 ימים שלאחר עירוי דרך עורק התרדמה הפנימי מהשמאל. ברי שגיאה מתארים סטיית התקן. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54804/54804fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54804/54804fig3.jpg" /> איור 3: Immunofluorescence של עכבר המוח סעיף המתאר GFP-tagged CD63, סמן Exosome, לאחר עירוי ECVs דרך עורק התרדמה הפנימי. דימוי הנציג מתאר microvessel במוח עכבר קשור ECVs להביע CD63 (ירוק). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.לקבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery at JoVE.com

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

טכניקה אינפוזיה Microsurgery עכבר למשלוח ואלכוהול ממוקד לתוך מערכת העצבים המרכזית<i&gt; דרך</i&gt; עורק התרדמה הפנימי

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

mouse-microsurgery-infusion-technique-for-targeted-substance-delivery

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

10.8K Views.  University of Miami. The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Video: Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and genetic mechanisms that contribute to hearing loss. Introduction of vectors into the inner ear must be done in a way that widely distributes the agent throughout the cochlea while minimizing injury to the existing structures. This manuscript describes a post-auricular surgical approach that can be used for mouse cochlear therapy using molecular, pharmacologic, and viral delivery to mice postnatal day 10 and older via the round window membrane (RWM). This surgical approach enables rapid and direct delivery into the scala tympani while minimizing blood loss and avoiding animal mortality. This technique involves negligible or no damage to essential structures of the inner and middle ear as well as neck muscles while wholly preserving hearing. To demonstrate the efficacy of this surgical technique, the vesicular glutamate transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) mice will be used as an example of a mouse model of congenital deafness that recovers hearing after delivery of VGLUT3 to the inner ear using an adeno-associated virus (AAV-1).

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Autonomous and Rechargeable Microneurostimulator Endoscopically Implantable into the Submucosa

Gastric dysmotility can be a sign of common diseases such as longstanding diabetes mellitus. It is known that the application of high-frequency low-energetic stimulation can help to effectively moderate and alleviate the symptoms of gastric dysmotility. The goal of the research was the development of a miniature, endoscopically implantable device to a submucosal pocket. The implantable device is a fully customized electronic package which was specifically designed for the purpose of experiments in the submucosa. The device is equipped with a lithium-ion battery which can be recharged wirelessly by receiving an incident magnetic field from the charging/transmitting coil. The uplink communication is achieved in a MedRadio band at 432 MHz. The device was endoscopically inserted into the submucosal pocket of a live domestic pig used as an in vivo model, specifically in the stomach antrum. The experiment confirmed that the designed device can be implanted into the submucosa and is capable of bidirectional communication. The device can perform bipolar stimulation of muscle tissue.

The application of high-frequency low-energetic stimulation can alleviate the symptoms of gastric dysmotility. In this research, a miniature, endoscopically implantable and wirelessly rechargeable device which is implanted into a submucosal pocket is presented. Successful both-way communication and stimulation control were achieved during an experiment on live pig.

Microneurostimulator האוטונומי, סוללה נטענת Endoscopically מושתלת לתוך Submucosa

Gastric dysmotility can be a sign of common diseases such as longstanding diabetes mellitus. It is known that the application of high-frequency ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

מסירת נוגדנים למוח מורנה באמצעות הסעה-משלוח משופר

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...