We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

כל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית קרן המחקר של סינסינטי הילדים. לצורך המחקר, בתאי גזע hematopoietic בודדו ממח העצם של עכברים מולדים C57Bl / 6 בגילים 2 - 4 חודשים. מיון תאים באמצעות FACS לאחר צביעה של BM עם מקבלי משטח שונים כולל Lineage, c-Kit, SCA-1, FLT3 ו- CD34 שימש לטיהור HSC מבוסס על Lin- SCA-1 + c-kit + FLT3 - CD34 - gating אסטרטגיה כמו פרוטוקול סטנדרטי תיאר לפני 8. זהירות: כימיקלים רעילים מספר מאוד משמשים במהלך הליך זה. אלו הם רעילים משאיפת ומגע עור. יש ללבוש כפפות וביגוד מגן. לעבוד במנדף תוך כדי עבודה עם כימיקלים אלה. 1. תאים, קיבוע, מכתים טרום הטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין 10,000 בתאי גזע hematopoietic (באמצעות לין - SCA-1 <sup&gt; + c-kit + FLT3 - CD34 - gating האסטרטגיה; LT-HSC אוכלוסייה) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 600 μl השונה של Iscove הבינוני של Dulbecco (IMDM) עם 10% בסרום שור עוברי באמצעות FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה HSCs מיון XG ב 1000 במשך 10 דקות בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge באמצעות צנטריפוגות עם דליים התנופה-אאוט. הסר בינוני על ידי שאיפה עדינה ולהשאיר 200 בינוני μl של צינורות בכל שלב. בשלב זה, התא הגלול אינו נראה בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 0.2 מ&quot;ל של תמיסת מקבע 2x בטמפרטורת החדר (RT) במשך שעה 1 1,9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון מקבע טרי לפני השימוש. בשעה 1x, הפתרון מורכב glutaraldehyde paraformaldehyde 3% ו -2.5% במאגר M 0.1 cacodylate. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות עם דליים-אאוט התנופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylateבאמצעות צנטריפוגה ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים קבוע על ידי הוספת 200 μl של 2 פתרון מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של כחול אוונס במאגר cacodylate דגירה במשך 20 דקות ב RT. התא יהיה בצבע כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים 3 פעמים עם 600 μl של 0.1 מ &#39;צנטריפוגה באמצעות חיץ cacodylate ולהשאיר חיץ 200 μl בצינור בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התאים 200 חיץ μl ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 0.5 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 10 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. הסר חוצץ בעדינות מבלי להפריע גלולה תא זעיר נראה כעת, ולהשאיר חיץ 50 μl בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 מ&quot;ג התכה נמוכה agarose עד 5 מ&quot;ל של 0.1 M חיץ cacodylate בצינור 15 מ&quot;ל פתרון agarose 4%. ממיסים את agarose על ידי העברת צינור למים רותחים בתוך בקבוק זכוכית 100 מ&quot;ל ולשמור פושרים עד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 4% התכה נמוכה מומס agarose ב 0.1 M cacodylate חיץ ההשעיה תא צינור 0.5 מ&quot;ל ומיד צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 30 ° C באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אישור תאים pelleted בתחתית הצינור 0.5 מ&quot;ל לתוך agarose חצי מוצק לאחר צנטריפוגה, מיד להעביר את הצינור עד 4 מעלות צלזיוס או קרח למשך 20 דקות כדי לחזק את agarose. שלב זה הוא קריטי מאוד, כמו תא גלול גלוי קטן תוצאות שלב זה מקבץ טוב של תאים מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה מהצינור על צלחת פלסטיק 35 מ&quot;מ פטרי המכילה חיץ באמצעות 3,10 מחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את agarose הקרושה המכיל את התא גלולה לתוך חתיכה אחת של כ 1 - 2 מ&quot;מ עם אזמל. מעבירים את פיסת agarose המכיל גלולה לתא צינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 - 3 פעמים באמצעות 600 μl של חיץ 0.1 M cacodylate ידי הוספה והסרה של חיץ באמצעות פיפטה ללא צנטריפוגה. השתמש חתיכת agarose זה המכיל את התא גלול עבור לשלב הבא. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני המעבר לשלב הבא. </li></ol> 2. Osmification, התייבשות, והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ cacodylate מהצינור 1.5 מ&quot;ל עם תא גלולה המכילה באמצעות agarose טפטפת. להוסיף 1.0 מ&quot;ל של 1% אוסמיום ארבע-חמצני (OSO 4) פתרון במנדף, דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 600 μl של 0.1 מ &#39;cacodylate חיץ ולהעביר את המדגם כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ&quot;ל עם מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את המדגם עבור התייבשות, חדירה והטבעה לתוך שרף (למשל, LX-112) עם שינויים סידוריים של הפתרונים הבאים לפי צלחת גם 6. הזז את פיסת agarose תא גלול באמצעות מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 25% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 50% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם ב 75%<html> אתנול ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 95% ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול 100% ב RT במשך 15 דקות, פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (3: 1) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 1) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם באתנול: שרף (1: 3) ב RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המדגם שרף טהור ב RT במשך 60 דקות, פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם לתחתית תבנית גומי בצורת קצה הפירמידה באמצעות מלקחיים בזהירות ולהוסיף שרף טהור יותר על גבי המדגם למלא את התבנית. דגירת המדגם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות עבור פילמור שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר הפירמידה שרפה polymerized מהתבניות על ידי סיבוב עובש הגומי. אשכול שחור קטן של תאים צריך להיות גלוי בפירמידת שרף polymerized, כפי שתואר קודם לכן 7. צרף הפירמידה שרף polymerized על גליל הרכבה באמצעות cyanoacrylate. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. חתך במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את בלוק הפירמידה עם סכין גילוח וסכין יהלומים לאחר הרכבת הבלוק על-microtome אולטרה. ליצור צורה טרפזית רחבה קצרה עם החלק העליון והחלק התחתון של מקבילי בלוק זה לזה, ועם צדדים זוויתי באופן שווה. צורה זו של הפירמידה מסייעת עבור חתך סדרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן, לקצץ את הבלוק סביב התא גלול עם סכין היהלום ולהסיר את חלקי הפלסטיק סביב יצירת agarose תא הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 1 מיקרומטר חלקים באמצעות-microtome אולטרה. הזז את 1 מיקרומטר חלקים מהסירה למים לשקופית זכוכית באמצעות כלי עפעף ו כלי לולאת מתכת כפי שדווח בעבר 7. העברת חלקים בשקופיות ומגלשות העברת הצלחת החמה (37 מעלות צלזיוס) במשך ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של תמיסת toluidine הכחולה בסעיפים באמצעות מזרק מצויד 0.22 מיקרומטר מסנן דגירה במשך 3 דקות. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים let בסעיפים לייבוש. בדוק עם מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים סעיפים דקים (70 - 100 ננומטר) באמצעות סכין יהלום. זז 2 - 3 חלקים על רשתות 200-רשת מהסירה למים בכלי זכוכית פטרי באמצעות כלי עפעף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה רשתות עם קטעים על צלחת חמה ב 30 מעלות צלזיוס לייבוש חלקים למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הרשתות עם טיפות של אצטט uranyl 1% ב RT במשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. הכתם עם ריינולדס להוביל ציטראט, ב RT במשך 5 דקות ולשטוף במים מזוקקים 6 - 8 פעמים. מעביר את צלחת זכוכית פטרי המכילה את הרשתות על צלחת חמה ב 37 מעלות צלזיוס לייבוש חלקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים, ב 80 kV 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

שיטה זו מאפשרת ניתוח TEM על מספרים סלולריים נמוכים, באמצעות אוונס מכתים כחול agarose ההטבעה למקם תא גלול זעיר במהלך ההתייבשות, הטבעת השרף ו חתך תהליכים. חשוב לציין, היא שומרת צבירי תאים יחד ושומרת על אולטרה-מבנה התא, אשר רצוי לבחון מספר תאי כימות של נתונים. <p class="jove_content" sty...

Ultra-מבניים תת-אברון הפרטים של תאים נחשפו בעיקר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) מחקרים מרקמות או כדורי תא 1,2. חתיכות מוצקות של רקמות יכולות בקלות להיות מנוצלות ללימודים במיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, TEM מנתח 1,3 על תאים בתרחיף להישאר מאתגר להצריך מספרים סלולריים גבוהים, כלומר, מיליוני תאים. בגלל זה, ניתוחים אולטרה-מבניים של אוכלוסיות תאי נדירות השעיה, למשל, בתאי גזע hematopoietic (HSCs), אינם להעריך בקלות. ניסיונות מרובים עבור ניתוח TEM ממדגמים נדירים תוך שימוש בגישות cytospin או בשכבה מצליחים לקבל נתונים כמותיים משמעותי ממספר מצומצם של תאים. לכן, הדרישה של מספר תאים גבוהים מגבילה את השימוש של כלי רב עצמה זה כדי להבין את פרטי ultrastructural subcellular של אוכלוסיות תאים נדירות. מגבלת מפתח ללימודי TEM עם מספר מצומצם של תאs השעיה הוא הלוקליזציה של התאים לעיבוד ולכן, מחקרי TEM מתאי מוגבל עם מידות קטנות במיוחד להישאר מאתגר. מספר גישות חלופיות אומצו כדי להתמודד עם מגבלה זו: ארגון ה- BSA / bisacrylamide (BSA-BA) פילמור בתיווך של השעיה התא, צביעת תאים עם צבע כדי לגרום להם גלוי על תמיכה סרט דק כולל coverslips, ו TEM מנתח מן ההכנות cytospin 4-6. עם זאת, הצלחה מוגבלת מאוד הושגה, כמו מעט מאוד תאים נמצאו בסעיפים לאחר חתך אולטרה. האתגר המרכזי של לזיהוי תאים דלילים נמשך משום monolayer התא אינה נראית בעיקר ג&#39;ל הקרושה עבור חתך. יתר על כן, הכנת cytospin של תאים עשויה לשנות הארגון הסלולר שלהם בשל הפצת תא ואת השבריריות של מבנה התא. לפיכך, חסרונות הגלומים אלה מתחייבים גישה חדשנית לבצע מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות עם יותרעֲקֵבִיוּת. כדי להתגבר על בעיה זו, שתארנו רומן ושיטת הכנת מדגם חלופי מחקרי TEM מן אוכלוסיות תאים נדירות 7. כאן אנו מדווחים פרוטוקול הכנת מדגם יעיל לבצע TEM מ דגימות ביולוגיות נדירות עם תוצאות איכותיות וכמותיות עקביות. כתמי כחולי אוונס בוצעו לאחר הקיבוע למקם תא גלול זעיר מתאי מספר נמוך, כלומר, 10,000 מח עצם גזע hematopoietic ו ובתאים שאחרת נותרו בלתי נראה, לבין הגלולה הייתה מוטבעת לתוך agarose לפני תהליכי הטמעת התייבשות שרף. שיטה זו אשכולות התאים יחד ומאפשר ניתוח יעיל של ultrastructure וארגון subcellular של תאי גזע hematopoietic (מזוהה לין - SCA-1 + c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC), 0.2 נדיר - האוכלוסייה 0.5% התא במח העצם. פרו ניסיוני זהtocol יכול להיות שימושי כדי לבצע מחקרים אולטרה-מבניים להשיג תוצאות כמותיות על אוכלוסיות נדירות רבות אבל מאוד חשובות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">15713</td>
			<td style="width:440px;">CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td>16350</td>
			<td>CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Cacodyladate buffer&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">12300</td>
			<td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4&#176;C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evans Blue&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">E-2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:113px;">A-5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Osmium tetraoxide&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">19130</td>
			<td>1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LX-112 Embedding Kits (LADD&#174;)</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21340</td>
			<td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NMA (Nadic methyl anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21310</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Uranyl acetate (EM Stain I)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">8072820</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ATCC</td>
			<td style="width:113px;">30-2005</td>
			<td>composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramid tip mold&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cylinders</td>
			<td style="width:216px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-microtome&#160;</td>
			<td style="width:216px;">(Leica EM UC7)</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">200 mesh grids (nikil)</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">G-200 Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi model H-7650&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Image capture engine software</td>
			<td>AMT-600&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">72588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials&#160;</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>03-337-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eyelash tool</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Loop tool&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) ניתן פרטים על ארגון ultrastructure הסלולר. עם זאת, ניתוח TEM של אוכלוסיות תאים נדירות, במיוחד התאים בתרחיף כמו בתאי גזע hematopoietic (HSCs), נשאר מוגבל בשל הדרישה של מספר תאים גבוה במהלך הכנת המדגם. ישנן כמה גישות cytospin או בשכבה לניתוח TEM ממדגמים נדירים, אבל הגישות האלה לא מצליחות לקבל נתונים כמותיים משמעותיים מהמספר המצומצם של תאים. הנה, גישה חלופית ורומן להכנת מדגם במחקרי TEM מתוארת על אוכלוסיות תאים נדירות המאפשרות ניתוח כמוני. מספר תאים נמוך יחסית, כלומר, 10,000 HSCs, שימש בהצלחה לניתוח TEM לעומת מיליוני תאים המשמשים בדרך כלל ללימודי TEM. בפרט, מכתים אוונס הכחול בוצע לאחר paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) קיבעון לדמיין את pel התא הזעירבואו, אשר הקלו מוטבע agarose. אשכולות של תאים רבים נצפו בסעיפים דקים. היו תאי מורפולוגיה השתמרה היטב, ואת הפרטים אולטרה-המבניים של המיטוכונדריה המורכב וכמה Golgi נראו. פרוטוקול יעיל, קל לשחזור זו מאפשר הכנת מדגם ממספר תא נמוך וניתן להשתמש בו לצורך ניתוח TEM איכותי וכמותיים על אוכלוסיות תאים נדירות מ דגימות ביולוגיות מוגבלות.

פרוטוקול יעיל ועקבי להכנת מדגם לבצע ניתוח TEM ממספר נמוך של תאים מתואר. מכתים שלאחר קיבוע עם אוונס כחול העברת התאים צינור 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge עזר להמחיש את התא גלולה זעירה 7. Osmification עם אוסמיום ארבע-חמצני ב agarose הביא לגילוי קל של התא גלולה כהה במהלך ה?...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis at JoVE.com

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

Video: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides vital information on bone turnover or bone formation and resorption. This has tremendous importance in a variety of clinical and research applications. It yields beautiful images1 and allows for techniques such as fluorochrome assessment and histomorphometry2. Fluorochrome analysis is a technique where fluorescent dyes that bind to calcium are injected at a particular time point, which allows for quantification of the amount of mineralisation at that given time. Histomorphometry is a process of bone quantification at the microscopic level. 
Performing undecalcified bone histology is technically challenging, particularly with large size specimens. It requires variations in technique from those used in standard paraffin embedded histology. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them. Specimen preparation, fixation and processing are achieved with a manner similar to other soft tissues, however due to the density and lower permeability of bone considerably longer fixation and processing times are required, often taking several weeks. Embedding is achieved using a supporting medium with similar or equal hardness and density to the bone such as methacrylate- based resins, but unlike paraffin infiltration and embedding, this is an irreversible step. Sectioning can be achieved by grinding which produces a thicker section, which is optimal for studies such as fluorochrome analysis. This is best achieved using a diamond blade on a macrotome. Alternatively, thinner sections can be produced for light microscopy and this is achieved using a sledge microtome with a very sharp blade. The sledge microtome provides the additional strength and stability required for large, hard blocks. Resin embedded sections can be stained with a variety of stains, which are demonstrated.

Undecalcified bone histology provides important information for a variety of clinical and research applications. It is technically challenging, particularly with large size specimens. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them.

עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

הכנת הדוגמא מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח פרוטאומיקס של עינית Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...