Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

<ol>
	<li>Watzl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+trigger+a+killer:+modulation+of+natural+killer+cell+reactivity+on+many+levels.">How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels.</a> Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).</li><li>Khaznadar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+NK+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+at+Diagnosis+Are+Associated+with+Blast+Transcriptional+Signatures+of+Immune+Evasion.">Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion.</a> J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).</li><li>Pical-Izard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+natural+killer+cells+in+HLA-matched+HSCT+after+reduced-intensity+conditioning:+impact+on+clinical+outcome.">Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).</li><li>Ahlenstiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+changes+in+natural+killer+cell+function+indicate+virologic+response+to+interferon+therapy+for+hepatitis+C.">Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).</li><li>Porrata, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lymphocyte+recovery+predicts+superior+survival+after+autologous+stem+cell+transplantation+in+non-Hodgkin+lymphoma:+a+prospective+study.">Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).</li><li>Silva, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+NK-cell+exhaustion+in+advanced+melanoma+by+Tim-3+blockade.">Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade.</a> Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).</li><li>Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Natural"+killer+cells+in+the+mouse.+I.+Cytotoxic+cells+with+specificity+for+mouse+Moloney+leukemia+cells.+Specificity+and+distribution+according+to+genotype.">"Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype.</a> Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Mariani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+production+by+natural+killer+cells+from+nonagenarians.">Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians.</a> Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).</li><li>Reefman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+secretion+is+distinct+from+secretion+of+cytotoxic+granules+in+NK+cells.">Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells.</a> J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).</li><li>Jacobs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Subgroups,+Phenotype,+and+Functions+After+Autologous+Stem+Cell+Transplantation.">NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation.</a> Front. Immunol. 6, 583 (2015).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li><li>Theorell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+viable+quantification+of+inside-out+signals+for+LFA-1+activation+in+human+cytotoxic+lymphocytes+by+flow+cytometry.">Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).</li><li>Brander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+NK+cell-mediated+cytotoxicity+by+exposure+to+ammonium+chloride.">Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).</li><li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+NK+cells+from+human+blood+with+the+RosetteSep+kit+from+StemCell+technologies.">Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies.</a> J Vis Exp. (8), e326 (2007).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).</li><li>Baginska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+degradation+by+autophagy+decreases+tumor+cell+susceptibility+to+natural+killer-mediated+lysis+under+hypoxia.">Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serglycin+determines+secretory+granule+repertoire+and+regulates+NK+cell+and+CTL+cytotoxicity.">Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity.</a> FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).</li><li>Sch&#246;nberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+clonal+analysis+of+NK+cell+effector+functions+by+multi-parameter+flow+cytometry.">Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).</li><li>Bj&#246;rkstr&#246;m, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+NKG2A,+KIR,+and+CD57+define+a+process+of+CD56dim+NK-cell+differentiation+uncoupled+from+NK-cell+education.">Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education.</a> Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).</li><li>Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+requirement+for+induction+of+natural+cytotoxicity+and+intersection+of+activation+signals+by+inhibitory+receptors.">Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors.</a> Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).</li><li>Cooper, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells:+a+unique+innate+immunoregulatory+role+for+the+CD56(bright)+subset.">Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset.</a> Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).</li><li>Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+NK-cell+cytokine+and+chemokine+production+by+target+cell+recognition.">Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition.</a> Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).</li><li>Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Checkpoint+Blockade+in+Cancer+Therapy.">Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).</li><li>Glienke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+applications+of+CAR-expressing+natural+killer+cells.">Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells.</a> Front Pharmacol. 6, 21 (2015).</li><li>Curran, K. J., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy.</a> J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).</li><li>Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Immunotherapy:+Current+Status.">Lymphoma Immunotherapy: Current Status.</a> Front. Immunol. 6, 448 (2015).</li><li>Laprevotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+IL-8+acts+as+a+CD16+co-activator+for+natural+killer-mediated+anti-CD20+B+cell+depletion+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).</li><li>Maloney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDEC-C2B8+(Rituximab)+anti-CD20+monoclonal+antibody+therapy+in+patients+with+relapsed+low-grade+non-Hodgkin's+lymphoma.">IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma.</a> Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).</li><li>Salles, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+study+results+of+the+type+II+glycoengineered+humanized+anti-CD20+monoclonal+antibody+obinutuzumab+(GA101)+in+B-cell+lymphoma+patients.">Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients.</a> Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).</li><li>Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR/HLA+interactions+negatively+affect+rituximab-+but+not+GA101+(obinutuzumab)-induced+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).</li><li>Hsu, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunostimulatory+effect+of+lenalidomide+on+NK-cell+function+is+profoundly+inhibited+by+concurrent+dexamethasone+therapy.">The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy.</a> Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).</li><li>Salih, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BCR/ABL-inhibitors+imatinib,+nilotinib+and+dasatinib+differentially+affect+NK+cell+reactivity.">The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity.</a> Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).</li><li>Benson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+1+trial+of+the+anti-KIR+antibody+IPH2101+in+patients+with+relapsed/refractory+multiple+myeloma.">A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma.</a> Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).</li><li>Vey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+1+trial+of+the+anti-inhibitory+KIR+mAb+IPH2101+for+AML+in+complete+remission.">A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission.</a> Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).</li><li>Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-directed+therapies:+moving+from+unexpected+results+to+successful+strategies.">Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies.</a> Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה המתוארת היא גישה קלה, מהירה ואמינה ללמוד פונקציות תא NK מדגימה דם שלם של תורמים או מטופלים בריאים. שיטה זו מציעה את היתרון הגדול לטהר תאי NK ישירות מדם כולו, הימנעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות זמן רבה, שהיא חובה עבור שיטות טיהור רבות אחרות 15. יתר על כן, זה דורש גודל מדגם קטן יותר בהשוואה &quot;קלסי&quot; בידוד תא NK / שיטות עשר, מה שהופך אותו חלופה מתאימה עבור דגימות של מטופלי ילדים ו / או חיסון לקוי. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להשיג ערכי בסיס של-vivo לשעבר פונקציות תא NK, אבל זה גם מאפשר תרבות NK נוספת ורחבה, להיות בדרך זו משלימה עם שיטות אחרות המתוארות 8 בעבר. אף על פי כן כמה צעדים קריטיים צריכים להילקח בחשבון. מאז assay מבוסס על חוּץ מכתים נוגדן תאי, חשוב לקבוע את אופטימלית ווrking ריכוז עבור כל נוגדן הראשון. במיוחד עבור המכתים התאי, הערכה זהירה של נוגדנים המשמשים מומלצת מאוד. גישה טובה היא לבדוק סדרת דילול של הנוגדן משמש (למשל, 1: 100 עד 1: 12.5) ב השעית תא מגורה עם או בלי PMA / ionomycin. החלתי מאותו מועד, היחס של אירועים חיוביים בין דגימות מגורות ובטל מגורה מחושב זמם. דילול הנוגדן עם יחס שינוי לקפל החיובי הגבוה ביותר (אות הרקע הטוב ביותר היחס) אמור לשמש עבור ניסויים נוספים 16. יתר על כן, השימוש של בקרות כמו פקדי isotype- ו FMO יכול להוכיח להיות יסודי במיוחד עבור מכתים תאי על מנת שער כראוי על אוכלוסיות תאים החיוביות. עם זאת, ישנן מספר מגבלות חשובות של השיטה המתוארת. הביטוי CD107a הוא סמן degranulation ולכן בעקיפין רק מצביע cytotoxicity תא NK. cytotoxicity תא NKnd קיבולת degranulation יכול להיות שונה. Up-רגולציה של מסלול autophagy בתוצאות תאים סרטניים השפלת ב granzyme מופרש ומפחית מוות של תאים על האינטראקציה תא NK 17. אפוא DCM נוסף (למשל, בקע caspase 3) עשוי להתווסף ללוח המכתים כדי לעקוב אחר המתרחש בתא הנידון למוות בתוך תאי היעד 18. בנוסף, cytotoxicity תא NK מושפע כמות חלבונים ציטוטוקסיות בתוך הגרגרים שלהם (למשל, perforin, ב granzyme), אשר ניתן לכמת ידי מכתים תאי 19,20. יתר על כן, ישנן אפשרויות שונות כדי לשנות את הפרוטוקול. במקום תאי NK מבודד, תאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs) יכול לשמש. למרות שאחד מהם חייב להיות מודע לכך את המספר הסלולרי NK המוחלט בקרב אוכלוסיית PBMC שונה בין תורמים שונים ואף בין דגימות הנגזרות מאותו התורם בנקודות זמן שונה. תא NK degranulation תלויה מאוד על E: היחס T. על מנת להשוות פונקציות תא NK בין תורמים שונים או בנקודות זמן שונות, מספר תא NK המוחלט בקרב אוכלוסיית PBMC אמור לשמש להקים E קבוע: יחס T בכל הניסויים. אם פונקציות תא NK מנוטרים בנקודות זמן שונות בתוך אותו התורם, PBMCs אפשר להקפיא הניתוח יכול להיעשות בבת אחת ולתמיד בנקודות זמן שונות על מנת להפחית וריאציות בין-ניסיוני 11. מאז מכתים לוחות עם עד 18 צבעים אפשריים, ניתוח של פונקציות תא NK ניתן להרחיב פרט הרבה יותר. באמצעות סמנים משטח נוספים לרבות CD57, NKG2A ואת הקולטנים הרוצח דמוי תא אימונוגלובולינים (KIRs), תת תא NK נוספים ניתן לזהות. משכילי תאי NK להביע לפחות-KIR העצמי אחד degranulate חזקים על אינטראקציה עם תאי K562 מאשר תאי NK חסר השכלה. לעומת זאת, CD57 הבדיל יותר + CD56 + </sup&gt; תאי NK מייצרים IFN-γ פחות על IL-12 ו- IL-15 גירוי לעומת CD57 הבדיל פחות - CD56 + NK 21 תאים. בנוסף, סמנים אחרים של תפקוד התא NK ניתן לפנות. LFA-1 הוא מולקולה חשובה הידבקות תא NK ובאו לידי ביטוי הקונפורמציה שלו פתוח על הפעלת תא NK. זה מה שנקרא &quot;מבפנים החוצה אות&quot; מהווה סמן הפעיל תא NK מוקדם 22. לבסוף, הגירויים עבור פונקציות תא בדיקות NK ניתן לשנות גם כן. מניסיוננו טרי מבודדים תאי NK רק degranulate גרוע על האינטראקציה תא K562 אם לא ציטוקינים מתווספים. באמצעות PBMCs טרי מבודד ללא תוספת ציטוקינים נוספת לעקוף את הבעיה, בגלל ההשפעה של תאי עובר אורח. יתר על כן, ייצור ציטוקינים, במיוחד IFN-γ ו- TNF-α, יכול להיות יזם על IL-12 ו- IL-18 גירוי 23. ייצור IFN-γ בתוך תת תא NK עשוי להשתנות תלוי,g על הגירוי בשימוש (cytokine- לעומת גירוי נגרמת יעד) 24. בנוסף, במקום להשתמש K562 תאים כמו תאי יעד, תאי גידול ראשוניים נגזרו חולי גידול יכולים לשמש כדי לבדוק פונקציות תא NK כנגד תאים סרטניים עצמיים לפני או במהלך טיפולים חיסוניים-ויסות (למשל, טיפול נוגדן חד שבטיות או תרופות-modulatory החיסונית (IMiDs)). בתוך בשנים האחרונות, בתחום האימונותרפיה כבר המתפתח במהירות באישור הקליני של מעכבי מחסום חיסוניים (למשל, ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 וניסויים מוצלחים באמצעות קולטן אנטיגן chimeric מהונדס גנטי (CAR) -expressing תאי T וכן כתאי CAR-NK (הנסקרת תוך התייחסות 26), לטיפול בחולי גידול המטולוגיות 27. לכן חיסוני NK מבוססי תאים הוא מקבל יותר ויותר אל המוקד. נוגדנים נגד CD20 היו הצלחה גדולה מתכNT לימפומות ממאירות בתוך שני העשורים האחרונים 28. הרוב המכריע של תאי NK לבטא את CD16 קולטן Fc נמוך זיקה המאפשר לתאים לזהות ולהרוג תאים היעד שכותרתו נוגדנים (נוגדנים תלויי cytotoxicity הסלולר - ADCC). היכולת של הנוגדן להפעיל פונקציות תא NK ניתן לבדוק במבחנה באמצעות הפרוטוקול המתואר 29. Terszowski et al. &#39;ADCC תאי NK ניתח נגד קו תא B lymphoblastoid באמצעות נוגדנים נגד CD20 שונים שאושרו קלינית. בעוד ADCC המושרה על טיפול Rituximab (הראשונה שאושרה קלינית אנטי CD20 נוגדן 30) הושפע לרעה אינטראקציה KIR / HLA, השפעה זו לא נצפתה בעת שימוש obinutuzumab (נוגדן חד-שבטי CD20 glycoengineered סוג II רומן) 31, 32. יתר על כן, פונקציות תא NK מושפעות תרופות אנטי סרטניות רומן שונה כמו IMiD lenalidomide 33 ו-kinas טירוזין השונהמעכבי דואר (TKI) 34. כרגע מעכבי מחסום NK תאים ספציפיים נבדקים בניסויים קליניים. דוגמאות לכך הן השימוש בתרופות אנטי-KIR 35,36 או הנוגדנים נגד NKG2A (NCT02331875) וכן אגוניסטים הפעילו כמו נוגדן אנטי CD137 (NCT01775631; NCT02110082). חשוב לציין, העברת תא המאמצת NK שבוצעה במגוון מחלות ממאירות שונות עם תופעות קליניות מבטיח 37. במטרה לבחור את התורם הטוב ביותר, פונקציות תא NK כנגד הגידול של החולה עלולות להיבדק במבחנה באמצעות דגימות דם מתורמים תא פוטנציאל NK. לסיכום, הפרוטוקול המתואר נועד לנתח פונקציות תא NK מגוונות מתורמים או מטופלים בריאים. ניתן לנטר את התפקידים אמורים תת תא NK מגוון על גירויים שונים בנקודות זמן שנבחרו.

במסגרת ההרג הטבעי מערכת חיסון המולדת (NK) תאים לתרום קו ההגנה הראשון נגד שנדבק בנגיף או רע ומר טרנספורמציה תאים. מערכת של קולטנים מעכב והפעלה מאפשרת להם להבחין בין תאים בריאים טרנספורמציה ללא תחול אנטיגן לפני בניגוד לתאי T. לאחר מפגש תא המטרה תא NK לשחרר את התוכן של הגרגרים שלהם ציטוטוקסיות (למשל, perforin, granzymes) לתוך הסינפסה החיסונית להרוג היעד שלהם. יתר על כן, תאי NK מייצרים ומפרישים סוגים שונים של ציטוקינים (למשל, γ interferon-: IFN-γ; הגידול נמק-α גורם: TNF-α) וכמוקינים (למשל,-1β חלבון דלקתי מקרופאג: MIP-1β) על תא המטרה אינטראקציה או ציטוקינים גירוי 1. מספיק פונקציות תא NK כגון רעילות, chemokine וייצור ציטוקינים יש השפעה חשובה על גורל דיס מגווןמקל. חולי לוקמיה להראות גדל בשיעור ההתקפים אם הם מפגינים פרופיל תא NK פגום בעת האבחנה המורכב של ייצור IFN-γ מופחת התבטאות מופחתת של הפעלת 2 לקולטנים המצויים בתאי NK. התאוששות מוקדמת של מספרים הסלולריים NK ותפקוד כולל ייצור ציטוקינים על אינטראקצית תא המטרה קשורה להרע מופחת שיעור הישרדות משופר בחולים מקבל השתלת תאי גזע אלוגנאית 3. יתר על כן, על התחלת טיפול אינטרפרון בחולים שנדבקו בנגיף הפטיטיס C קיבולת degranulation של תאים היקפיים NK הוא חזק המגיבים מוקדם מאשר שלא הגיבו לטיפול 4. מספרי תא NK (&gt; 80 / μl) ביום 15 לאחר השתלת מח עצם אוטולוגית (autoSCT) בחולים הסובלים מלימפומה או מיאלומה נפוצה הם המנבאים התקדמות משופרת חופשית הכוללת הישרדות 5. בחולים מלנומה הביטוי של T-cell immunoglobulin- ו mucin-מושלם-containinמולקולת -3 G (TIM-3), חלבון חיסוני רגולציה על תאי NK, עולה בקנה אחד עם שלב מחלה והפרוגנוזה 6. מדעני פיקוח פונקציות תא NK לאורך העשורים האחרונים. הניתוח הראשוני של cytotoxicity תא NK כנגד תאים סרטניים ללא תחול לפני טופל באמצעות assay 51 Cr-שחרור 7. לאחרונה, מדענים פתחו שיטה שאינה רדיואקטיבי כדי להעריך את הרעילות של תאי NK המורחבים 8. ייצור ציטוקינים ו chemokine נבדק לעתים קרובות באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) טכניקות 9,10. במהלך העשורים האחרונים שיטות אלה כבר כהשלמת מבחני זרימה מבוססת cytometry. השימוש מעכבי תחבורת חלבון (לדוגמא, brefeldin ו monensin) ושיטות התא permeabilization בשילוב עם פרוטוקולים מכתימים קונבנציונלי שטח אפשר למדענים לחקור chemokine וייצור ציטוקינים ב הלימפה ספציפית שונהתת ocyte (למשל, T, B או תאי NK) 11. יתר על כן, מבחני cytometry מבוסס זרימה שונה פותחו כדי לפקח T ו- NK cytotoxicity תא. בשנת 2004 אלתר ואח. תאר את ביטוי השטח של החלבון ליזוזום הקשורים CD107a (Lamp1) על תאי NK על מפגש תא המטרה כסמן עבור degranulation של גרגרי ציטוטוקסיות 12. מאז מגוון רחב של fluorochromes השונה cytometers זרימת רב ​​ערוצית זמין בימינו, זה הפך להיות אפשרי לפקח בו זמנית פונקציות תא NK מגוונות (cytotoxicity, ציטוקינים וייצור chemokine) תת תאים שונים NK. זה הופך להיות חשוב במיוחד במצבים בהם גודל המדגם מוגבל, למשל, ב ביופסיות או דגימות דם של חולים הסובלים לויקופניה. כדי לבדוק פונקציות תא NK העולמיות, מבחני הזרימה השונה מבוסס cytometry ניתן לשלב ביעילות. Theorell et al. תאי NK מגורה מ heaתורמי lthy עם קו התאים הסרטניים K562 ונותח degranulation תא NK, ייצור אות ו chemokine מבפנים החוצה באמצעות זרימת cytometry 13. לאחרונה תת-קבוצות תא NK, פנוטיפים ופונקציות בחולי גידול בזמן autoSCT נותחו באמצעות לזרום מבחני cytometry מבוססים. זה הודגם כי תאי NK הצליחו degranulate ולייצר ציטוקינים / כמוקינים בעת ההכרה תאים סרטניים בנקודות מוקדם מאוד זמן אחרי autoSCT 11. הנה פרוטוקול מתואר להעריך פונקציות תא NK על אינטראקציה עם תאים סרטניים כוללים קיבולת degranulation, chemokine וייצור ציטוקינים באמצעות זרימה cytometry המבוסס assay זה עושה את זה ניתן לבצע מעקב אחר פונקציות תא NK תת שונים בו זמנית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 + glutamine</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">6187-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicilin/streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD Falcon Round Bottom Tube</td>
			<td style="width:135px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td style="width:167px;">heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T-flask</td>
			<td style="width:135px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">690195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">K562 tumor cell line</td>
			<td style="width:135px;">DSMZ GmbH</td>
			<td style="width:119px;">ACC 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td style="width:135px;">made in house</td>
			<td style="width:119px;">/</td>
			<td style="width:167px;">components are listed in the text</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Distilled water: Ampuwa Sp&#252;ll&#246;sung 1000ml Plastipur</td>
			<td style="width:135px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:119px;">1088813</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megafuge 40R Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td style="width:119px;">/</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EDTA blood collector tubes</td>
			<td style="width:135px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">386453</td>
			<td style="width:167px;">S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematopoietic media (XVIVO)</td>
			<td>Lonza Group Ltd</td>
			<td style="width:119px;">BE04-743Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">human serum</td>
			<td style="width:135px;">DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M&#160;</td>
			<td style="width:119px;">/</td>
			<td style="width:167px;">healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Neubauer-improved counting chamber, bright line</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">0640030/ 1110000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">trypan blue solution (0,4%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3% acetic acid with methylene blue</td>
			<td style="width:135px;">Stemcell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">351177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">08591-1ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">524400-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ionomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">PromoKine</td>
			<td style="width:119px;">PK-CA577-1566-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">interleukin 15 (IL-15)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proleukin S (IL-2)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Novartis Pharma</td>
			<td style="width:119px;">730523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">554724</td>
			<td style="width:167px;">This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:135px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">UN2209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">saponin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flow cytometer: Canto10C</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FlowJo</td>
			<td style="width:135px;">TreeStar Inc.</td>
			<td style="width:119px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graph Pad</td>
			<td style="width:135px;">Graph Pad Inc.</td>
			<td style="width:119px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACSxpress Separator</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td style="width:119px;">130-098-308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACSxpress NK isolation kit</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td style="width:119px;">130-098-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td style="width:119px;">130-098-196</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACSmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD3 APC</td>
			<td style="width:135px;">Biolegend</td>
			<td>300412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD3 V450</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>560366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD14 PerCP</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td>130-094-969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD14 V450</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD16 PE</td>
			<td style="width:135px;">Biolegend</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD16 PerCP</td>
			<td style="width:135px;">Biolegend</td>
			<td>302029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD19 PE-Cy7</td>
			<td style="width:135px;">Biolegend</td>
			<td>302216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD19 V450</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>560353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD45 BV510</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>563204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD56 FITC</td>
			<td style="width:135px;">Biolegend</td>
			<td>345811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human CD107a PE</td>
			<td style="width:135px;">Biolegend</td>
			<td>328608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human IFN-&#947; AF-647</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>557729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-human MIP-1&#946; APC-H7</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>561280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie Violet Fixable Viability Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423113</td>
			<td>fixable dead cell marker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based assay for the monitoring of nk cell functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

<html> האסטרטגיה gating לניתוח degranulation, ציטוקינים ו chemokine הייצור של האוכלוסייה התא כולו NK ושלושה תת תא NK שונים הם באיור 1. תוצאות נציג התורם אחד בריא הם באיור 2. תאי NK ללא כל גירוי הפיק לא IFN-γ ולא MIP-1β ולא הביע CD107a על פני השטח שלהם (איור 2 א). בניגוד לכך, תאי NK מגורים עם תאים סרטניים וציטוקינים מיוצרים כמויות משמעותיות של-γ IFN התאי-1β MIP. יתר על כן, למעלה מ -20% מהם degranulated על אינטראקצית תאים סרטניים שמציינת להביע CD107a על פני השטח שלהם (איור 2 ג). PMA וגירוי ionomycin שימשו כביקורת (איור 2 ב). <html> e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54,615 / 54615fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1:. Gating אסטרטגיה שערים לאחר הם זממו. ראשית, פסולת מודרים בתוך FSC-A / SSC-עלילה. ואז לימפוציטים מזוהים כפילויות מודרים באמצעות שני מגרשים עם SSC-A / SSC-H ו- FSC-A / FSC-H. לאחר מכן, שער לרבות כל CD45 + תאים ולמעט כל המתים, CD3 +, CD14 + ו- CD19 + תאים מוגדר על ידי התוויית ערוץ CD45 / דאמפ. לאחר מכן, תאי NK מזוהים על ידי gating על תאי CD56 +. עלילה עם CD56 / CD16 יכול לשמש כדי לזהות את תת תא NK הראשי. לבסוף, בקרב אוכלוסיית התא כולו NK, סמנים פונקציונליים מזוהים על ידי התוויית CD56 לעומת CD107a, IFN-γ ו MIP-1β, בהתאמה. ניתן לעשות זאת גם עבור כל סוגים שונים של תת תא NK. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54615/54615fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> s = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54615/54615fig2.jpg" /> איור 2:. תוצאות נציגה אחד תורם תא בריא NK באמצעות אסטרטגית gating המתוארת בתרשים 1, סמנים תפקודיים תא NK כמו CD107a (עבור degranulation), IFN-γ ו MIP-1β ניתן לזהות. העמודה השמאלית (א) מראה את התוצאות באמצעות תאי NK בהיעדר גירוי. העמודה האמצעית (ב) מדגימה את התוצאות בנוכחות של ionomycin PMA / בקרה החיובית. העמודה הימנית (C) מציגה תוצאות עבור תאי NK מגורים עם קו התאים הסרטניים K562 ובנוכחות של ציטוקינים אִי- 2 (100 U / ml) ו- IL-15 (10 ng / ml). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54615/54615fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ialt מ&quot;ג = &quot;טבלה 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54,615 / 54615table1.jpg&quot; /&gt; טבלה 1: נוגדנים לבדיקה טוהר. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/54615/54615table2.jpg" /> טבלה 2: נוגדנים מכתימים חוּץ ו תאי.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions at JoVE.com

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

flow-cytometry-based-assay-for-the-monitoring-of-nk-cell-functions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.7K Views.  Johann Wolfgang Goethe-University.  שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה. 

Video: Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...