We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

פרוטוקולים לכל במחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים בבית המשוכלל והנדיר de המרכז - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. קציר עכבר קורנית עבור הכנת הרתי פרוסה השעיות תא בודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף זרימה למינרית, להצמיד בצד הגחון העכבר עד קרש החיתוך. תרסיס העכבר עם אתנול 70%. הסר אלכוהול עודף בטופחו עם גזה כדי למנוע אתנול מלהיכנס חלל בית החזה פגיעה ברקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור בבסיס של עצם החזה עם זוג מלקחיים ולעשות חתך דרך העור. הארך את החתך של העור כלפי מעלה לכל forelimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן קיצוץ נוסף בבסיס עצם החזה להפריד את הסרעפת מן הצלעות. ואז לחתוך בכל צד של כלוב הצלעות כלפי עצם הבריח. תהפוך את כלוב הצלעות מעל לכיוון הראש לחשוף את חלל בית החזה. שתי האונות שלהתימוס לשכב על החלק העליון של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רקמת חיבור סביב האונות הרתי באמצעות מלקחיים, מספרי מייקרו לנתיחה, ו / או במספריים מעוגלים חדים. השתמש זוג מלקחי קצה מעוקל בסדר להרים את האונות בודדות מתחת או באמצעות נותרי רקמת חיבור. הערה: אין לתפוס את התימוס ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האונות הרתי צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל PBS ומניחים בצד על הקרח עד הצורך. </li></ol> 2. והטבעה Agarose ו Vibratome חיתוך של הרתי אונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% פתרון agarose להטבעת ידי המסת 2 גרם agarose נקודת התכה נמוכה ב 50 מ&quot;ל סטרילי PBS ו במיקרוגל בעוצמה נמוכה עד agarose נמס לגמרי. מכסים הבקבוק בנייר כסף ומניחים אלומיניום באמבט מים ב 55 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה, להכין התקשורת RPMI להשלים-1640 המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS), 4 מ&quot;מ גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין 1x, ו -10 מיקרומטר2-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ&quot;ל להשלים התקשורת RPMI-1640 לכל היטב צלחת תרבית תאים 6 באר ומקום הכנס תרבית תאים בכל טוב. הגדר את הצלחת בצד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אמבט מי קרח עכור עם מים וקרח בתוך דלי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את כל רקמות החיבור שנותרו סביב כל האונה הרתי באמצעות מלקחיים טיפ נאה. האם זה בעוד האונה הרתי היא שקועה PBS בצלחת בתרבית רקמה, לאחר העביר לתוך ממחטת נייר לנגב ספוגת PBS, או תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose להתקרר מתחת ל -40 מעלות צלזיוס, כאשר הבקבוק הוא רק חם למגע, כדי למנוע התחממות יתר הרקמה. יוצקים את 4% מקורר agarose לתוך תבנית רקמה עד לגובה של ס&quot;מ 1 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להעביר את האונה הרתי בקפידה כדי רקמה לנגב ולגלגל אותו בעדינות כדי לייבש אותו מבלי לפגוע ברקמה. ודא כי הרקמה מתייבש לגמרי או שזה יהיה להחליק החוצה של agarose במהלך חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את האונה לתוך agarose ולמקם אותו או אופקית (כדי להגדיל את שטח הפנים של כל פרוסה) או אנכית (כדי להגדיל את מספר פרוסות) בתחתית התבנית. מניחים את התבנית במי קרח למשך 5-10 דקות, כדי לאפשר agarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את vibratome עבור חיתוך על ידי הרכבת מגש החיץ, להרכבת דיסק הדגימה, והחדרת להב vibratome. מניחים חתיכת סרט במעבדה על הדיסק הדגימה. לעקר את סביבת העבודה נקייה, התאספו עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose מבצרת, להפוך את התבנית ולחץ בעדינות במרכזה לשחרר את האונה מוטבע agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין חד לחתוך את agarose העודף סביב האונה עוזב ~ 2 מ&quot;מ של agarose בכל צד ו ~ 0.5 סנטימטר בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure כל בלוק agarose עם טיפת דבק רקמות חתיכת סרט על דיסק הדגימה. יכול להיות דבוק בלוקים מרובים בקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את wi להב vibratome<html> th העליון של הבלוק agarose. מלאו את מגש חיץ עם PBS סטרילי עד הבלוק הלהב agarose (ים) שקועים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הרקמה מוטבע agarose להשיג פרוסות בעובי של 400-500 מיקרומטר. הגדר את vibratome כדי 0.225 מ&quot;מ / מהירות שניות, 100 הרץ תדיר, ו -5 ° זווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית והתכופפה לאסוף את הפרוסות הרתי לתוך צלחת בתרבית רקמה המכילה PBS סטרילית כפי שהם נחתכים. מחק את הפרוסה הראשונה והאחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלת 4X. בחר את הפרוסות עם רקמת הרתי שלמה סביב agarose (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפרוסות לצלחת מוכנה בשלב 2.3 באמצעות קצה פיפטה כדי להחליק את פרוסת הרתי בעדינות מן המרית מכופף על כנס תרבית תאים. כל כנס יכול להכיל ~ 3 פרוסות. ודא פרוסות לא נוגעים זה בזה או הקירות להכניס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד הצורך. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הכנת thymocytes עבור שכיסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד האונות הרתי כמתואר בסעיף 1. לנתק את האונות באופן ידני כדי לעשות השעיה תא בודד באמצעות מטחנת 15 מעוקר מ&quot;ל רקמות מלא 5 מ&quot;ל של PBS סטרילי המכיל 2% FBS. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה 1x ACK (0.15 M NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ Na 2 EDTA) בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות עד lyse בתאי הדם האדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את צינור עד 15 מ&quot;ל עם PBS המכיל 2% FBS. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10 מ&quot;ל של PBS המכיל 2% FBS ולהעביר התאים דרך מסנן רשת 255 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend התא גלולה ב PBS המכיל 2% FBS בכל concentration של 1 x 10 7 תאים לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווית התאים עם צבעים סלולריים כמו אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) על פי פרוטוקולים של יצרן אם לא באמצעות thymocytes מעכברים להביע סמני congenic או כתבי ניאון מקודד גנטי להבחין מתאי אנדוגני פרוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי של התאים שכותרתו, resuspend התא גלולה ב מדיה מלאה RPMI-1640 ב 1-3 x 10 6 תאים לכל 15 μl. </li></ol> 4. שכיסה thymocytes על פרוסות הרתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה כדי לשאוב כל נוזל המקיף את הפרוסות הרתי על ההוספה. הערה: תשמרי על עצמך כדי למנוע נזק agarose. אם agarose פגום, thymocytes המעולף לא לצרף אל פני השטח פרוסה כתוצאה מאובדן מתח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי לגעת פרוסה עם קצה פיפטה, כיסוי 15 μl של thymocytes מוכן בסעיף 3 על כל פרוסה הרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת PLAטה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לאפשר לתאים לנדוד אל פרוסות הרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות, לשטוף את פרוסות הרתי 3 פעמים עם 1 מ&quot;ל PBS להסיר thymocytes מעולף עודף שעדיין לא עברו לתוך הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד שהפרוסות הרתי מוכנות להיות שנקטף, בדרך כלל 1-72 שעות תלויות בניסוי. </li></ol> 5. דיסוציאציה של הרתי פרוסות cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינור microcentrifuge עבור כל פרוסה על ידי הוספת 150 μl של PBS המכיל 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 2% FBS כדי להכניס את בתרבית רקמה עם פרוסות הרתי ומערבבים בעדינות עם מרית כפוף לנתק את פרוסות מפני השטח של להכניס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפרוסה מן הכנס אל צינור microcentrifuge בעזרת מרית מכופפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לשבש את הפרוסה באמצעות עלי מדגם צינור microcentrifuge. להוסיף 150 μl של PBS המכיל 2% FBS לנפח סופי 300μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הרקמה ניתקה דרך פילטר 40 מיקרומטר לתוך צינור microcentrifuge חדש. התאים המסוננים מוכנים להיות מוכתם עבור ניתוח התזרים cytometric 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן תאים בשנית לפני העברת על cytometer זרימה כדי להבטיח כי כל agarose מוסר ואינו לסתום את זרימת cytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את התאים על cytometer זרימה ולנתח נתונים כפי שתואר קודם לכן 40. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי ותוצאות נציג מבחר חיובי ושלילי היעיל של הגבלה אני בכיתת MHC מראש מבחר המעולף thymocytes המהונדס TCR ידי cytometry זרימה. מערכת זו נוצל בעבר בהצלחה דומה לתמוך סלקציה חיובית של הכיתה MHC II-מוגבל CD4 + T תאים thymocytes העקורים מראש מבחר 32, ו, בנוכחות אנטיגן אגוניסט, סלקציה שלילית ופיתוח reg הרתי T 11,12, 36,38,39,43,44. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד בחירה הרתי בנוכחות או בהעדר מעכבים, פפטידים מוגדרים, כמו גם של thymocytes או אוכלוסיות תאי סטרומה מהונדסים גנטי. פרוסות הרתי הן גם נתונים על שכבת העל של אוכלוסיות תאים אחרות מאשר תת thymocyte. לדוגמא, הוצג לאחרונה כי תאי דנדריטים מעולפים על פרוסות הרתי להעביר ביעילות לתוך הרקמה ויכול לתמוך selectio השליליתn ו- T reg פיתוח 39,43. מחקרים שנערכו עד כה, משתמשים עקורים טרום בחירה או thymocytes הכולל ללמוד מבחר חיובי ושלילי. למרות ההתפתחות של תאי T יכולה להמשיך לפחות 4 ימים פרוסים הרתי, אם מעוניין בייזום ניסויים עם אוכלוסיית אב קודם לכן, זה צריך להילקח בחשבון כי מגבלה של מערכת זו היא כי איכות הפרוסות הרתי מתחילה לרדת לאחר 1-2 ימים בתרבות בשל מוות של תאים וחוסר קרום אוטם. הפרוטוקול המתואר במסמך זה יכול לשמש גם ליצירת פרוסות מרקמות הרתי אדם עם שינויים עדינים. לפני מוטבע agarose, רקמות הרתי אדם צריכות לחתוך לרסיסים, פחות או יותר בגודל של אונה הרתי עכבר בוגר. יש לציין, דגימות הרתי האדם עשירים רקמת חיבור, ו, ביחס התימוס Murine, זה יותר קשה להכין פרוסות באיכות טובה. מניסיוננו, העובר ולא אנושי בילודרקמת הרתי היא תורמת יותר להכנת פרוסה. הוכח כי תת thymocyte אנושיים לבצע לוקליזציה כהלכה משני פרוסות הרתי האדם והעכבר 37. מבחר הרתי של תת thymocyte אדם מעולף, עם זאת, טרם דווחו במודל פרוסה הרתי. היעילות של סלקציה חיובית מאוכלוסיית polyclonal נמוכה, זאת בשל השיעור הנמוך (~ 0.5-2%) של thymocytes המעולף של הפרוסה הרתי, זה עלול להיות קשה להעריך במספרים קטנים כאלה של תאים שנבחרו באופן חיובי. זה עשוי להיות אפשרי להציג transgene TCR אדם ובתאי תא אנושיים T לפני כיסוי על פרוסות הרתי אנושיות כדי להגביר את יעילות סלקציה חיובית. זה גם אינו מונע את האפשרות לעקוב אחרי תזוזות אוכלוסיות תאי T האנדוגניים קיומו או אי קיומו של פפטידים אקסוגניים או אוכלוסיות תאים אחרות ומעכבים של אותות TCR, בין יתר. פרוטוקול זה יכול להיות גם מודעapted להדמיה של הגירה thymocyte, אותות TCR, אינטראקציות הסלולר 12,32-38. עד לאחרונה, רוב המחקרים של התנהגות thymocyte באתרו היה מוגבל בקליפת המוח המוארך נמצא במיקום מרכזי התימוס, ממש מעבר לגבול של זיהוי על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. לעומת זאת, פרוסות הרתי לספק את היתרון הייחודי שיש להם את הפרוסות הרתי שלמים אזורים קורטיקליים מדולריים ועל פני השטח הפרוסים מאפשר גישה ישירה אל הלשד ידי הדמית שני פוטונים. בנוסף, פרוסות הרתי ועליהן תאים שכותרתו עם צבעי אינדיקטור בסידן כגון Indol יכולות לשמש כדי לפקח על אותות TCR באמצעות רמות סידן cytosolic כאינדיקטור אותות TCR הקשורים מבחר חיובי ושלילי על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים 11,32,36, 38,39,44. כדי להכין את הדגימות במיקרוסקופ, הפרוסות ניתן להשתמש ישירות לאחר שלב 4.5 של הפרוטוקול. במקרה זה, יש להקפיד לבחור סמני ניאון מתאימים suitable הדמיה. תרבויות איבר הפרוסה הרתי הן כלים מצוינים ללמוד היבטים שונים של עכבר ופיתוח תא T האנושי באתרו. עם זאת, יישום מוצלח של טכניקה זו דורש תשומת לב מיוחדת שלבים קריטיים בפרוטוקול. כדי למקסם את מספר פרוסות הרתי שהושגו בניסויים תפוקה גבוהה, הגיל של העכבר בשימוש חייב להילקח בחשבון כמו גודל של שינויים התימוס ברחבי זמן החיים של העכבר. אנו משתמשים בדרך כלל עכברים ישנים 4-8 בשבוע שיוצרים ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר. עם זאת, העובר, עכברים בילוד ומעלה thymi יכול תיאורטית לשמש כדי ליצור מספר מוגבל של פרוסות בהתאם לצרכים ניסיוניים של המשתמש. לקבלת פרוסות באיכות טובה, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי להסיר את כל רקמת חיבור המקיפה את האונות הרתי לפני מוטבע agarose. הנותרים רקמת חיבור לא לחתוך ביעילות על ידי להב vibratome במהלך חיתוך ויכול להזיק הרתיאונות ופרוסות שהתקבלו. חלק הארי של רקמת חיבור להסירו במהלך מסיק התימוס (שלב 1.5) ומאפשר האונות יוסרה חלל בית החזה ללא מניפולציה משמעותית של הרקמה עצם. לאחר לבודד את האונות, להסיר בזהירות את כל רקמת החיבור שיורית כפי שמתואר בשלב 2.5. בנוסף, שמירה על שלמות agarose סביב הרקמות המוטבעות הכרחית עבור שכיסה thymocytes ביעילות על פני השטח הפרוסים. לכן, חשוב לבדוק הן את הפרוסה התימוס ואת agarose שמסביב בעת בחירת פרוסות הרתי לשימוש בניסוי. Vibratome הוא בדרך כלל ממוקם מחוץ למכסה המנוע בתרבית רקמה, מעלה את הסיכון הפוטנציאלי של זיהום. ניקוי vibratome ביסודיות בין הניסויים וריסוס העבודה באזור vibratome עם אתנול 70% לפני חיתוך יכול להגביל את פוטנציאל זיהום. כמו כן, חשוב להשתמש PBS סטרילי לצעדים 2.13 ו 2.15 כאמור ב protocol. לבסוף, הוא גם חיוני להבחין thymocytes מעולף הנודדים אל הרקמות מתאי כי הם אנדוגני התימוס. זו יכולה להיות מושגת על ידי סימון תאים ועליהן צבעי ניאון כאמור בשלב 3.7. לחלופין, thymocytes מעכברים להביע סמני congenic או כתבי ניאון מקודד גנטי ניתן להשתמש 45,46. באופן כללי, לעומת זאת, פרוסות הרתי קלות לתפעל ואפשר להתאימו לצרכי הניסוי הספציפיים של המשתמש, תמיכת תחולתה רחבה כי החלו רק כדי להיחקר.

T תאים להבדיל באמצעות סדרה של ביניים התפתחותיים התימוס במהלכן הם נתקלים בכמה מחסומים המבטיחים בדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי 1-3. סלקציה חיובית מקדמת את ההישרדות של thymocytes עם קולטנים של תאי T (TCR) מסוגלים להכיר, עם נמוך הזיקה מתונה, פפטיד שהציגו מולקולות מורכבות histocompatibility גדולות (MHC) על תאי אפיתל הרתי קליפת מוח (cTEC) 2,3. סלקציה שלילית ו- T רגולטוריים התפתחות התא (T reg) לתרום להקמת סובלנות עצמית באמצעות חיסול או הסטת thymocytes שמגיבים בחריפות-פפטיד עצמי שהציג MHC 2,4. בשלה CD4 + CD8 + חיובית כפולה (DP) thymocytes להביע TCRs שעוברים תהליך הבחירה להתמיין תת-אוכלוסיות של תאי T בוגרים, שרובם הם מהשורה MHC-מוגבל ואני ציטוטוקסיות CD8 +או בכיתת MHC II-מוגבל CD4 + עזר יחיד חיובי (SP) ותאי T, לפני היציאה התימוס כדי לבצע פעולות מפעיל באיברים הלימפה משני 1-3. מה שמוסיף למורכבות של פיתוח תאי T, ההגירה הדינמית ומפגשים הסלולר לפתח thymocytes ברחבי רשת תא סטרומה 5-9. בתאי סטרומה אלה ממלאים תפקידים ברורים בפיתוח thymocyte ומופצים באופן דיפרנציאלי בין האזורים קורטיקליים מדולריים הרתי שבו חיובי סלקציה שלילית להתרחש 10. למרות סלקציה חיובית מתרחשת בעיקר בקליפת המוח, יש ראיות מצטבר thymocytes העקור נודד אל הלשד ולהמשיך לדרוש אותות TCR לפני שהם להתמיין לתאי T בוגרים דבר המצביעים על כך הלשד עשוי לספק אותות נוספים הדרושים להשלמת מבחר חיובי שושלת בידול 11,12. נוסף,למרות נוכחותם של תאי אפיתל הרתי מדולרי מיוחדים (Mtec) מבטאים ו אנטיגנים הנוכחי מוגבל רקמות הקלת מחיקה של thymocytes אוטוריאקטיבים 13,14, חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בקליפה בתגובה הביע בכל מקום בגוף-פפטיד עצמי שהציג הדנדריטים תאים 15,16. לפיכך, מודלים מדויקים של פיתוח תאי T חייב לספק microenvironment הרתי מאורגן, עם קליפת המוח ללא פגע ואזורים מדולרי, המאפשר אינטראקציה בין thymocytes ותאי סטרומה, ותומך הגירה thymocyte כמו תאים אלה עוברים סלקציה חיובית ושלילית. כדי להשלים vivo לשעבר מנתח של thymocytes כאמצעי לימוד מבחר חיובי ושלילי, מספר במבחנה, באתרו, ו במודלי vivo של התפתחות תאי T פותח 17-22. זה כבר ידוע לשמצה קשה לשחזרבחירה במבחנה חיובית, אבל coculture של אוכלוסיות תא גזע או מבשרי תא T עם תאי סטרומה להביע ליגנד Notch, בעיקר OP9-DL1 / 4 תאים, יש לו את היכולת לתמוך במחויבות שושלת T ו סלקציה חיובית מוגבלת מה שהופך אותו לא יסולא בפז במודל חוץ גופייה כדי מחקר תאי T פיתוח 23-25. מגבלות של מערכת זו, עם זאת, כוללים את העובדה כי תאים אלה חסרים את מכונות עיבוד פפטיד ייחודי המצוי בתאי סטרומה הרתי ואת microenvironment הרתי תלת ממדי. למרות שלמעלה טכנית מסורבלת, באתרו במודלים vivo של מבחר הרתי יכול להתגבר על מחסומים הקשורים למערכות במבחנה. תרבויות איבר Reaggregate הרתי (RTOC) מכילים מוגדר תערובות של thymocytes ותאי סטרומה הרתי 18,26,27. reaggregates תא אפיתל הרתי אלה לשמור הביטוי שהייתי בכיתה MHC ו- II והוא יכול לתמוך developmeNT של שני תת התא הקונבנציונלי T, אך עדיין חסרת מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים. תרבות איבר הרתי עוברית (FTOC) היא מודל פופולרי של פיתוח תאי T שניתן זורע עם thymocytes באמצעות תרבות תליית טיפת אונות הרתי lymphodepleted או באמצעות זריקה של thymocytes לתוך lymphoreplete אונות הרתי ולתמוך בפיתוח יעיל של CD4 + ו- CD8 + T תאים לאורך זמן בתרבות 18,28-31. ב החניכה של התרבות של אונות הרתי העובר יש מחסור של mTECs, אך מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים עלולים לפתח לאורך זמן בהתאם לתנאים. שיקול חשוב הוא כי מודל זה עשוי לתמוך עוברי מועדף לעומת פיתוח תא הבוגר T. לבסוף, הזרקת intrathymic של מבשרי הרתי מוגדר בעכברים בוגרים הוא מאתגר מבחינה טכנית אך ברור מספקת סביבה לתמיכה פיתוח תאי T in vivo. אלו באתרו במודלים vivo הם לא כלים מצויניםo מחקר T תא הפיתוח והשימוש שלהם צריך להיחשב על בסיס ניסוי אחר ניסוי. פרוסות הרתי, לעומת זאת, צמחו לאחרונה כמודל צדדי, משלים ללמוד בחירה הרתי באתרו עם האפשרות להכיל ייחודי, מורכב, ובדרך כלל ניסויי תפוקה גבוהים יותר. פרוסות הרתי לשמור על השלמות של האזורים קורטיקליים מדולריים ולספק מסגרת של תאי סטרומה שתומכת גירת thymocyte במהלך פיתוח, כמו גם מבחר חיובי ושלילי יעיל 11,32-39. תת thymocyte הוסיף גבי פרוסות הרתי נודדים לתוך רקמות נישת microenvironmental המתאימה שלהם 34,37. Thymocytes המעולף ניתן להבחין בין תאי אנדוגני פרוסה הרתי באמצעות סמני congenic או תוויות ניאון והוא יכול להישמר בתרבות במשך כמה ימים. תרבויות organotypic פרוסה הרתי יכול לשמש כדי לחקור היבטים שוניםההתפתחות של תאי T כולל מבחר הרתי, התנהגות thymocyte (הגירה אינטראקציות הסלולר), ולוקליזציה thymocyte, בין היתר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר, את יכולת ההרחבה של ניסויים היא בדרך כלל גדולה יותר מאשר אחרים במודלים באתרו של מבחר הרתי. למרות הכנת פרוסות הרתי דורשת ציוד מיוחד, כגון vibratome, ואת זמן החיים של פרוסות הרתי בתרבות מוגבלת בשל אובדן של תאים לאורך זמן באמצעות מוות של תאים וחוסר קרום encapsulating, פרוסות הרתי לספק מודל מצוין לניתוח של מבחר הרתי של אוכלוסיות מסונכרנות של thymocytes בתוך microenvironment הרתי בוגר. כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי (כולל קצירת התימוס, הטבעת agarose של אונות התימוס vibratome חתך של הרקמות המוטבעות), בידוד שכיסה של thymocytes, הניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח התזרים cytometric.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

התמורה מבחר הרתי בתוך microenvironment הרתי ייחודי מאוד מאורגנת וכתוצאה מכך הדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי. מודלים חוץ גופית ללמוד מחויבות השושלת T ופיתוח סיפקו תובנות חשובות לגבי התהליך הזה. עם זאת, מערכות אלו חסרים את המילייה הרתי תלת ממדים המלאות נחוצה להתפתחות תאי T, ולכן הם קירובים שלמים של in vivo מבחר הרתי. כמה מן האתגרים הקשורים לפיתוח תא דוגמנות T ניתן להתגבר באמצעות במודלים באתרו המספקים microenvironment הרתי שלם שתומך מבחר הרתי מלא לפתח תאי T. תרבויות organotypic פרוסת הרתי משלימים קיימים טכניקות באתרו. פרוסות הרתי לשמור על שלמות של אזורים קורטיקליים מדולרי הרתי ולספק פלטפורמה ללמוד פיתוח של thymocytes כיסו של שלב התפתחותי מוגדר או של ג T אנדוגניאמות בתוך microenvironment הרתי בוגר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות לכל עכבר, פרוסות הרתי להציג יתרון ייחודי במונחים של מדרגיות לניסויי קצב העברת נתונים גבוהות. יתר על כן, הקלות היחסית ביצירת פרוסות הרתי ופוטנציאל כיסוי תת הרתי שונה או אוכלוסיות תאים אחרות מרקע גנטי מגוונים משפרת את הרבגוניות של שיטה זו. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי, בידוד כיסוי של thymocytes, ניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח תזרים cytometric. מערכת זו יכולה גם להיות מותאמת ללמוד פיתוח תאי T בלתי קונבנציונלי וכן לדמיין גירת thymocyte, אינטראקציות תא-סטרומה thymocyte, ואותות TCR הקשורים בחירה הרתי על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים.

ניתוח תמיכת פרוסות הרתי של היבטים שונים של פיתוח תא T כגון מבחר חיובי ושלילי. עבור ניסויים מוצלחים, איכות הפרוסה הרתי היא בעל חשיבות עליונה. לפיכך, פרוסות הרתי צריך להיבדק כדי להבטיח את שלמות הרקמה הרתי וכי agarose סביב פרוסה הרתי הוא תמים (איור 1 א). מתח פנים אפשר להתפשר כאשר agarose פגום וגרם לצמצום משמעותי במספר thymocytes הנודדים אל הרקמות. לפיכך, פרוסות הרתי עם סימנים של נזק לרקמות או ניקס / דמעות agarose צריך להיות מושלך (איור 1B). עכברים מהונדסים TCR (TG) מועסק לעתים קרובות ללמוד בחירה הרתי בשל הביטוי של TCR מוגדר, פונקציונלי על פני השטח של כל thymocyte המגדיל את תדירות הסלקציה חיובית על polycאוכלוסיות lonal. כדי ללכוד כל שלב של סלקציה חיובית, טרום הבחירה thymocytes TG TCR יכול להיות מעולף על גבי פרוסות הרתי, לבין התפתחות בוגרת, CD4 + או CD8 + SP תאי T אחריו לאורך זמן על ידי זרימת cytometry 40. Thymocytes מבודד מהכיתה MHC I-מוגבל OT-I TCR TG Rag1 - / - β2m - / - עכברים נעצרים בשלב העקורים לפני הבחירה הרתי כתוצאה מהצורך של β2m לשייך ולייצב את הכיתה MHC לי שרשרת כבדה 41 , 42. כאשר מעולפים על גבי β2m - / - פרוסות הרתי, את thymocytes TG מראש מבחר OT-I TCR להישאר בשלב העקור, ואינו מייצר תאי CD8 + SP T משמעותיות (איור 2 א, משמאל). לעומת זאת, כאשר מעולף על פרוסות הרתי WT המכילות הליגנדים בחירת אנדוגני, היכולת של המודל הזה לתמוך סלקציה חיובית באה לידי ביטוי התפתחות תא CD8 + T ב 72 שעות (איור 2 א, מימין). quantification של התפתחות תא CD8 + T בתור מחוץ לקרוא של סלקציה חיובית מוצג באיור 2B. פרוסות הרתי יכולות לשמש גם כדי ללמוד סלקציה שלילית. חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בתגובה לאנטיגן בכל מקום 16. מודל סלקציה שלילית לאנטיגן בכל מקום, thymocytes סך OT-I TCR TG Rag1 - / - ו wild-type (WT) עכברים תויגו עם CFSE ו CTV, בהתאמה, ולאחר מכן מעורבב ביחס של 1: 1 והועבר פרוסות WT (איור 3 א). לאחר שטיפת את thymocytes עודף, פרוסות הרתי הונחו התקשורת להשלים RPMI-1640 עם או בלי 1 ננומטר של מאותו מקור, פפטיד אגוניסט של TCR OT-I, SIINFEKL (פפטיד OVA). כל כיתת MHC לי לבטא בתאים תציג את האנטיגן, דוגמנות הצגת אנטיגן הביע בכל מקום בגוף התימוס. לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, שיעור-OT אני TCR TG cells (% מתגוררים CFSE +) לתאים שליטה WT (% מתגוררים CTV +) הושווה על ידי cytometry זרימה (איור 3 ב). ירידה בחלקם היחסי של תאים TG OT-I TCR מייצג המחיקה של תאי TG OTI TCR בתגובה פפטיד OVA. חשוב לציין כי בשל ההטרוגניות בגודל של פרוסות הרתי וכן ערך בתא לפרוסות הרתי, אחד צריך לכלול ניתוח מתאים ובקרות פנימיות לנרמל למשתנים אלה. הנה, תאי WT מעורבבים עם OT-I TCR TG תאים ומצופים גבי פרוסות שמשו בקרה פנימית כמו אוכלוסייה זו לא צריכה להיות השפעה משמעותית על קיומו או אי קיומו של פפטיד OVA. היקף סלקציה שלילית של תאים TG OTI TCR היה לכמת מבוסס על פרופורציות ולא במספרים מוחלטים. ראשית, היחס בין OT-I TCR TG (% מתגוררים CFSE +) כדי WT (% מתגוררים CTV +) תאים על כל פרוסה הרתי WT בנוכחות<html> או אי קיומו של פפטיד OVA חושב. כל יחסים אלו חולקה מכן על ידי הממוצע של היחס בין OT-I TCR TG (% מתגוררים CFSE +) כדי WT (% מתגוררים CTV +) תאים על פרוסות WT בהעדר פפטיד OVA. בממוצע, 80% מכלל התאים TG OT-I TCR היו מתרוקנים בתגובה לאנטיגן בכל מקום, כפי שהוא מתואר באיור 3C. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54355/54355fig1.jpg" /> איור 1: נציג תמונות של פרוסות הרתי שהוכנו אונה הרתי מוטבעת אנכי. (א) פרוסה באיכות טובה עם רקמת מוטבע והסביבה agarose ללא פגע. (ב) פרוס איכות ירודה עם ניזק עקב קריעת הרקמות המוטבעות במהלך חיתוך. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54355/54355fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> ove_content &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54355/54355fig2.jpg" /> איור 2:. ניתוח תזרים cytometric של סלקציה חיובית בפרוסות הרתי OT-I TG Rag1 TCR - / - β2m - / - thymocytes תויגו עם CFSE והועבר הלא בחירת β2m - / - או בחירת פרוסות WT. לאחר 72 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, התפתחות התא CD8 + T נותח על ידי cytometry הזרימה. (א) נציג נתונים של שטח פני התא CD4 ו CD8 ביטוי על חי CFSE + TCRβ thymocytes גבוה מ β2m - / - ופרוסות WT. (ב) כימות של חית CFSE + TCRβ גבוהה התפתחות תא CD8 + T על פרוסות WT בהשוואה לקבוצת ביקורת הלא בחירה. כל נקודה מייצגת פרוסה הרתי הפרט לבין שורה מייצגת את הממוצע. (*** P &lt;0.001, t מזווג מבחן)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54355/54355fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח תזרים cytometric של סלקציה שלילית בפרוסות הרתי A 1:. יחס 1 של CFSE שכותרתו OT-I TCR TG Rag1 הכולל - / - ו שכותרתו CTV thymocytes WT היו מעולף על פרוסות WT בנוכחות או בהעדר OVA פפטיד, SIINFEKL. לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, את הפרופורציות היחסיות של תאים מעולפים נותחו על ידי cytometry זרימה. (א) סכימטי של ניסוי ההגדרה מראה כיסוי של CTV שכותרתו תאי WT (כחול) מעורבב 1: 1 עם שכותרתו CFSE תאי TG OT-I TCR (ירוק) על פרוסת הרתי WT בנוכחות או בהעדר של פפטיד OVA. (ב) נציג נתונים המתארים את שיעור חי CFSE + OT-ליתאי TG TCR ו CTV + WT תאי פרוסות הודגרו עם או בלי פפטיד OVA. (ג) נתונים היו מנורמל בין פרוסות, ואת המשקל היחסי של תאי TG CFSE חי + OT-I TCR לחיות תאי CTV + WT מוצג. ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. N = 3 עבור כל תנאי. (* p &lt;0.05, מבחן t מזווג). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54355/54355fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Views.  Hôpital Maisonneuve-Rosemont.  אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית. 

Video: Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג&#39;ל

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...