המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר בוריס Reizis מהמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה לדיונים מועילים. כמו כן, אנו מבקשים להודות ד&quot;ר מרגרט Bynoe, ד&quot;ר רודמן Getchell ו Deequa Mahamed מהמחלקה למיקרוביולוגיה ולאימונולוגיה במכללה לרפואה וטרינרית באוניברסיטת קורנל לקבלת סיוע טכני עם cytometry זרימה הואנג לו סיוע עם עריכת וידאו. המחברים גם רוצה להודות לחברי דוהמל ו וייס מעבדות לבדיקה ביקורתית הייצור שלהם כתב היד הוידאו, וסטפני Yazinski מן המעבדה וייס הרבייה genotyping p53 - / - עכברים. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קורנל מוסדיים ועדת שימוש. מחקר זה מומן בחלקו על ידי קרנות הניתנים על ידי משרד החקלאות האמריקני, מחקר שיתופית המדינה, החינוך, שירות ההדרכה והמקצוע, בריאות בעלי חיים ועל תוכנית המחקר מחלות (עד GED ו RSW) ו-NIH מענקים R03 HD058220 ו R01CA108773 (עד RSW). הסרטון הופק באמצעות in-house מתקני ידי אנשי ממעבדות דוהמל &amp; וייס.

1. Dissection של גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לנתיחה הגידול, מגבת נייר נקייה או לעטוף כירורגית הפנויה מונחת על כרית לנתיחה וריסס עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים עבור פרוטוקול זה מורדמים שגרתי עם CO 2. מניחים את העכבר מורדמים על כרית לנתיחה ולרסס את שני הצדדים של החיה עם אתנול. העכבר הוא מוחזק במקום על כרית לנתיחה באמצעות ארבעה או יותר סיכות לדחוף מוכנס דרך הרגליים ריססו ביסודיות עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העור מעל קו האמצע הוא חתך חיק לבסיס הראש באמצעות מספריים סטרילי, תוך הימנעות את השרירים הבסיסית וחודר לתוך החללים בגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן עם זוג חדש של מספריים סטרילית מלקחיים נזהר לא לפגוע באיברים פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל בית החזה על ידי הניתוח, להסיט את בית החזה כדי לחשוף את הגידול, בלי לפגוע בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הגידול מאיברים אחרים, להעביר חלק כ 40-50% של הגידול הכולל (בערך עד 1.5 X 0.8 X 0.8 ס&quot;מ) לתוך PBS קר כל הזמן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק הנותר של הגידול ניתן לשמור עבור מבחני אחרים necropsy המלא ניתן לבצע בשלב זה. </li></ol> 2. לימפומה culturing תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס הצינור המכיל את הגידול גזור עם אתנול 70% ולהעביר ארון biosafety. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות צלחת פטרי סטרילית 150 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פיסת הגידול לתוך צלחת פטרי על ידי שאיבה עדינה עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנד בשני מחטים סטריליים 18 מד מול הצד משופעים החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הגידול באמצעות מחטים כפופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת את המנה, הקש בעדינות מקום בזווית לאסוף את ההשעיה תא צד, תוך הימנעות חתיכות גדולות של הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את ההשעיה תא ולהעביר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל תוך הימנעות חתיכות גדולות של הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחת עם 10 מ&quot;ל של מדיום ולהעביר לתוך הצינור אותו תוך הימנעות חתיכות גדולות של הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה התא מורכב של לימפוציטים ותאי סטרומה בעדינות ולהעביר 5 מ&quot;ל לתוך בקבוקון T-25 רקמות תרבות 10 מ&quot;ל לתוך T-75 הבקבוקון בתרבית רקמה. בעדינות במערבולת צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ההשעיה תא שנותר לעשות 2, 4, 10,100 ו 1000 דילולים לקפל בנפח 2.5 הסופי מ&quot;ל (תאים culturing בצפיפויות שונות באמצעות מספר סוגים של כלי תרבות מגדיל את הסבירות של הקמת קו T-cell). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 2.0 מ&quot;ל של דילול כל לתוך בארות בודדים של צלחת 6 באר. מערבולת בעדינות את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 48 שעות באווירה humidified CO 2 באוויר. </li></ol> 3. האכלה תאים לימפומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות של דגירה, מוסיפים 5 מ&quot;ל של מדיום עד בקבוק T-25 ו 10 מ&quot;ל של בינוני עד בקבוק T-75 לאורך הקיר עם הפרעה מינימלית של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של המדיום היטב בכל צלחת 6-היטב לאורך הקיר עם הפרעה מינימלית של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים נוספים 72 ח </li></ol> 4. Passaging תאים לימפומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר ראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף היום החמישי של דגירה, התאים passaged ביחס 1:1, תוך שמירה על צלוחיות המקורי וצלחות (שמירה על צפיפות התאים בריכוז של כ mL / 3x106 במהלך המעברים first מקדמת הקמת מוצלח של קו תאים רציף). <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בקבוק T-25, להעביר 5 מ&quot;ל של השעיה התא לתוך בקבוק חדש המכיל 5 מ&quot;ל של מדיום. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום לתוך הבקבוק המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בקבוק T-75, להעביר 10 מ&quot;ל של השעיה התא לתוך בקבוק חדש המכיל 10 מ&quot;ל של מדיום. הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום לתוך הבקבוק המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צלחת 6-הבאר, העברת 2 מ&quot;ל של השעיה תא מבאר כל לתוך בארות המקביל צלחת חדשה המכילה 2 מ&quot;ל של המדיום היטב כל אחד. הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום לבאר כל הבארות המקורי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל צלוחיות וצלחות עבור תוספת 72 ח מניסיוננו שורות תאים ביותר מבוססים מן המעבר האלה, אחת לאחת התרבויות (נוכחות של אגרגטים תא חסיד רופף השעיה על תאים סטרומה המצורפת היא אינדיקציה מוקדמת של קו תא הוקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תרבויות עם פחות או תא אגרגטים לא חסיד רופף ההשעיה, להאכיל את צלוחיות או צלחות על ידי בקפידה החלפת כ -50% של המדיום כל 72 ח כדי למנוע הסרת תאים מן התרבות המקורית, כלי התרבות נשארים עומדים באין מפריע במשך דקות לפחות 5 לתת משקע התאים שבתחתית על ידי כוח הכבידה לפני השאיפה עדין של המדיום supernatant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על שורות תאים הוקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים הוקמה הם passaged לתוך צלוחיות וצלחות חדשות. עבור T-25 ו-T-75 צלוחיות, מוסיפים 5 מ&quot;ל של המקור אוקטע אחד ההשעיה לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום. במשך 6 צלחות היטב, להוסיף 3 מ&quot;ל של ההשעיה המקורית או מעבר לתא לתוך 7 מ&quot;ל של מדיום בבקבוק T-25. פיד ולשמור המקורי או מעבר תרבות אחת על ידי החלפת נפח הסיר עם המדיום תרבות טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעבר הוקם שורות תאים לתוך צלוחיות T-25 חדש. שורות תאים יש זמן הכפלה של 18-24 ח תרבויות מתוחזקים באופן שוטף על צפיפות של mL / 1-3x106 ו passaged כל 3 ימים. מוסיפים את נפח הנדרש של תרבות הקטע הקודם המדיום החדש לעשות עד 10 מ&quot;ל. פיד ולשמר את התרבות המקורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כמה פסקאות, הלא חסיד התאים יהיה לקיים את עצמי ללא בתאי סטרומה חסיד ויש עוד מספר קטן של תאים חסיד מתבצעות על עם כל קטע. מעבר לנקודה זו, התרבויות יכול להישמר בתרבות שאינם מטופלים רקמות T-25 צלוחיות. </li></ol></li></ol> 5. מקפיא שחזור שורות תאים לימפומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים מוקפאות במדיום מוכן טרי 1640 RPMI המכיל 20 FBS% ו 10% DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מתרבות שעות 48 הישן בבקבוק T-25 (כ 1.5x10 6 תאים / מ&quot;ל) הם centrifuged בסל&quot;ד 1500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת supernatant, התאים מחדש תלויה 2 מ&quot;ל של מדיום קופאת מקור. שני כרכים 1.0 מ&quot;ל של השעיה תא מהבקבוק כל ממוקמות בתוך מבחנות הקפאה, קפוא מיד -80 ° C, והועבר חנקן נוזלי למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם התאושש אחסון חנקן נוזלי על ידי הפשרה מהירה, ו resuspending מתוכן 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות טריים. לחלופין, תאים מופשרים טרי נשטפים פעם בינוני תרבות חמים כדי להסיר את DMSO לפני resuspending ב 10 מ&quot;ל של מדיום תרבות טריים. התאים בתרבית במשך שעות לפחות 72 לפני המעבר שלאחר מכן. </li></ol> 6. נציג תוצאות כספומט - / - T-cell קו זה פותח באמצעות פרוטוקול ייעודי DWJ-ATM-1 התאפיינה מכתים עם אנטי CD3-FITC, אנטי CD4-APC ואנטי CD8-PE ו cytometry זרימה ניתוח (Figure1). יותר מ -90% מתאי T היו CD3, CD4 ו - CD8 משולשת חיובית. <img src="/files/ftp_upload/2598/2598fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. אפיון קו T-cell פותח באמצעות פרוטוקול זה. שטח פני התא סמנים של כספומט הוקם - / - שורת תאים המיועדים DWJ-ATM-1 התאפיינו מכתים עם אנטי CD3-FITC, אנטי CD4-APC, אנטי CD8-PE ו cytometry ניתוח תזרים. בקצרה, 1x10 6 תאים טריים נשטפו פעם קר PBS (1500 סל&quot;ד / 5 דקות), וטופחו על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם 200 μL קוקטייל של נוגדנים (כל נוגדן בדילול 1:200 ב-PBS עם BSA 1%. תאים ניתן לבדוק מיד בעוד תאים קבוע טריים או קבוע לצורך ניתוח מאוחר יותר. ערוכים על ידי הוספת פורמלין שנאגרו נייטרלי בריכוז הסופי 4% (כרך / כרך) וטופחו על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, שנקטפו על ידי צנטריפוגה (1,500 סל&quot;ד / 5 דק &#39;) ו resuspended ב 200 μL של PBS עם BSA 1%. סך של 1 X 10 4 תאים נותחו באמצעות FACS BD Calibur מנתח ו CellQuest תוכנה (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה).

<ol>
	<li>Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm-deficient+mice:+a+paradigm+of+ataxia+telangiectasia.">Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.</a> Cell. 86, 159-171 (1996).</li><li>Elson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+defects+in+ataxia-telangiectasia+protein-deficient+mice.">Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).</li><li>Kuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Atm-/-+thymic+lymphoma+cell+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+by+dexamethasone.">Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).</li><li>Browne, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+a+catalytic+antioxidant+corrects+the+neurobehavioral+defect+in+ataxia-telangiectasia+mice.">Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice.</a> Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).</li><li>Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spectrum+analysis+in+p53-mutant+mice.">Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.</a> Curr Biol. 4, 1-7 (1994).</li><li>Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+T+cell+leukemia+cell+lines+established+from+SCL/LMO1+double+transgenic+mice.">Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice.</a> Leukemia. 15, 141-147 (2001).</li><li>Sharma, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+contributes+to+mouse+T-cell+leukemia+by+directly+inducing+the+expression+of+c-myc.">Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc.</a> Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).</li><li>Maser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers.">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447, 966-971 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בפרוטוקול זה, אנו מספקים נהלים מפורט להקמת Murine T-cell הקווים משני גנוטיפים עכבר שונים; כספומט - / - [FVB/N- כספומט tm1Led / J] ו - p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . באמצעות פרוטוקול זה, סך של 6 (מתוך 7 ניסיונות) כספומט - / - ושלושה (מתוך 5 ניסיונות) p53 - / - Murine T-cell קווי הוקמו במעבדה שלנו. נתונים נציג הוכחת כי שורת תאים DWJ-ATM-1, כספומט - / - שורת תאים מורכב האוכלוסייה תא שבו יותר מ 90% של תאים לבטא CD3, CD4 ו - CD8 סמנים משטח לאשר קו המשובטים תא T יכול להיות הוקם באמצעות פרוטוקול שלנו. פיתוח של T-cell קווי Murine דווחה 3,6,7, אך פרוטוקולים מפורטים להקמת שורות אלו לא תוארו עד כה. אמנם רק שני גנוטיפים עכבר שימשו הגזירה של T-cell קווי Murine במעבדה שלנו, אנו מאמינים כי נהלים אלו חלים על מגוון רחב של T-cell לימפומה ספונטנית למצוא זנים אחרים של עכברים כמו קראס פגום, אחרים בפוטנציה בעלי חיים מינים. Murine T-cell קווים יש יישומים פוטנציאליים בהבנת שאלות בסיסיות באימונולוגיה ואונקולוגיה. נכון לעכשיו, אנו משתמשים אלו שורות תאים במחקרים שנועדו לאפיין מארח הפתוגן אינטראקציות genotoxin-Induced cytotoxicity כולל מנגנונים של תא מעצר מחזור אפופטוזיס. בהתחשב בכך Murine T-cell קווי לשתף שינויים גנומיים כגון מחיקות של PTEN ו FBXW7 במשותף עם חריף תא T לוקמיה לימפובלסטית אדם ו לימפומה, הם גם מתאים במיוחד למחקר סרטן וביולוגיה 8, וייתכן יישומים נוספים עבור מראש המהירה קליניים יעילות הסינון של מערכת החיסון ועל תרופות כימותרפיות סרטן במבחנה. או לא שורות תאים אלה יכולים להיות מופצים in vivo בעכברים או syngeneic או immunocompromised טרם נקבע. בניגוד פרוטוקולים קודמים בהם הקמת המוצלחת של קו T-cell לקח עד שלושה חודשים 6, שורות תאים שפותחו באמצעות פרוטוקול הנוכחי הוקמו בתוך חודש (בין הקטע 2-8). מצאנו כי נוכחות של אגרגטים תא חסיד באופן רופף על תאים סטרומה המצורפת היא אינדיקציה מוקדמת קריטית של קו תא הוקמה. על מנת לאפשר Murine מתאי T להפיץ ללא הגבלת זמן, מצאנו גם כי חשוב להשאיר את התא הראשוני אגרגטים חסיד רופף באין מפריע במהלך ההאכלות. בנוסף, שמירה על צפיפות התאים בריכוז של כ 3x10 mL / 6 במהלך המעברים ראשונות, אך מקדמת הקמת המוצלחת של קו תאים רציף. מניסיוננו, תאים culturing בצפיפויות שונות באמצעות מספר סוגים של כלי תרבות מגדיל את הסבירות של הקמת קו T-cell. רוב T-cell קווי הוקמו מ-T-75 צלוחיות או 6 צלחות גם 10 או 100 דילולים לקפל אשר מתאימות כ 1x10 1x10 7 או 6 תאים / מ&quot;ל. פרוטוקול הקודם מומלץ תאים culturing ב 5 x 10 6, 1 x10 7, ו 2 x 10 7 תאים לכל היטב היטב 6 צלחות האכלה לאחר 7 ימים (7). הבחנו כי האכלה תרבויות ראשונית 48 שעות 72 שעות ומעבר לאחר מכן, ביום 5 הוא אופטימלי. מחכה כבר לפני האכלה מעבר הראשון יגרום לתאים לאבד את יכולת הקיום שלהם להפסיק את חלוקתם. הפרמטר האחרון אשר מצאנו הוא קריטי ריבוי מוצלח של Murine T-תאים במבחנה הוא נוכחותם של FBS במדיום תרבות שיכולה לתמוך בצמיחת תאים מהירה. מגרשים שונים וספקים של FBS צריך להיות מוקרן לפני שיזם את הגזירה של T-cell קווי לזיהוי מגיב מתאים. אם Murine T-cell הקווים אינם זמינים עבור ההקרנה, תרבויות העיקרי של לימפוציטים הרתי להציב בארות צלחת 24 באר בריכוז של 6 1x10 לכל מ&quot;ל של מדיום מבחן המכיל concanavalin (1μg / mL) לעידוד צמיחה תאים מהירה היא נאותה. בנוכחות של מקור אופטימלי של FBS, את מספר התאים צריך להכפיל בכל 18-24 ח

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלי קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection משטח המורכב של גוש קצף מכוסה בנייר אלומיניום וסיכות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני זוגות מספריים סטרילית מלקחיים קטנים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי 150 2 מ&quot;מ צלחת פטרי (תרמו פישר סיינטיפיק, Waltham, MA,. חתול # 08-757-13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי 18 מד מחטים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ל חרוטי צינורות (קורנינג בע&quot;מ, קורנינג NY: חתול # 430829) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% שנאגרו פורמלין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות רקמות צלוחיות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T-25 (TPP, Trasadingen, שוויץ, חתול # 90025) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T-75 (TPP, Trasadingen, שוויץ, חתול # 90075) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גם צלחות (קורנינג בע&quot;מ, קורנינג NY: חתול # 3506) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים pH 7.2 (PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בינוני <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI 1640 עם 25 HEPES מ&quot;מ, 200 מ&quot;מ L-גלוטמין (Lonza, Walkersville, MD, חתול # 12-115F) בתוספת הבאות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 10% מומת (56 ° C, 30 דקות) בסרום שור העובר (FBS; Hyclone, לוגן, יוטה; חתול # SH30088.03) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% פניצילין וסטרפטומיצין (Mediatech, Manassas, VA; חתול # 30-002-CI) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% חומצות אמינו חיוניות (Mediatech; חתול # 25-025-CI) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 55 מ&quot;מ 2β-mercaptoethanol (Sigma, סנט לואיס, מיזורי, חתול # M752) </li></ul></li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דימתיל sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA, חתול # 317275) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים (eBioScience, סן דייגו, קליפורניה) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטי CD3-FITC (קט # 11-0031-85) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטי CD4-APC (קט # 17-0041-83) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטי CD8-PE (קט # 12-081-85) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שור בסרום אלבומין (BSA, החיים טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק;. חתול # 11018-017) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Concanavalin (חתול Sigma # C5275) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.8 הקפאת צלוחיות מ&quot;ל (Nunc, רוסקילדה, דנמרק, חתול # 368632) </li></ul>

derivation of thymic lymphoma t-cell lines from atm-/- and p53-/- mice

שורות תאים הוקמה הם כלי מחקר ביקורתי זה יכול להפחית את השימוש בחיות מעבדה במחקר. זנים מסוימים של עכברים מהונדסים גנטית, כמו כספומט - / - ו-p53 - / - בעקביות לפתח לימפומה הרתי מוקדם בחיים 1,2, וכך, יכול לשמש מקור אמין עבור הגזירה של T-cell קווי Murine. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לפיתוח הוקמה Murine T-cell קווי הרתי לימפומה ללא צורך להוסיף אינטרלויקינים כפי שמתואר בפרוטוקולים הקודמים 1,3. גידולים נבצרו מעכברים בגילאי שלושה עד שישה חודשים, על פי סימן מוקדם של גידולים גלוי מבוססת על התצפית של יציבה כפופה, עמל, נשימה הטיפוח עני מבזבז ב 1,4 זן רגיש. הקמנו בהצלחה מספר T-cell קווי באמצעות פרוטוקול זנים טהורים של ATM - / - [FVB/N- כספומט tm1Led / J] 2 ו - p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 עכברים. בנוסף, אנו מראים כי יותר מ -90% מהאוכלוסייה T-cell הוקמה מבטא CD3, CD4 ו - CD8. בהתאם שורות תאים הוקמה ביציבות, ה-T לתאים שנוצר באמצעות פרוטוקול הנוכחי כבר passaged במשך למעלה משנה.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice at JoVE.com

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

בסרטון הזה אנחנו מדגימים את פרוטוקול להקים הרתי עכבר לימפומה שורות תאים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, הקמנו בהצלחה מספר T-cell קווי ATM-/ - ו-p53-/ - עכברים עם לימפומה הרתי.

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

derivation-of-thymic-lymphoma-t-cell-lines-from-atm-and-p53-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

12.2K Views.  Cornell University. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את פרוטוקול להקים הרתי עכבר לימפומה שורות תאים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, הקמנו בהצלחה מספר T-cell קווי ATM-/ - ו-p53-/ - עכברים עם לימפומה הרתי.

Video: Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell repertoire. In vitro models to study T lineage commitment and development have provided valuable insights into this process. However, these systems lack the complete three-dimensional thymic milieu necessary for T cell development and, therefore, are incomplete approximations of in vivo thymic selection. Some of the challenges related to modeling T cell development can be overcome by using in situ models that provide an intact thymic microenvironment that fully supports thymic selection of developing T cells. Thymic slice organotypic cultures complement existing in situ techniques. Thymic slices preserve the integrity of the thymic cortical and medullary regions and provide a platform to study development of overlaid thymocytes of a defined developmental stage or of endogenous T cells within a mature thymic microenvironment. Given the ability to generate ~20 slices per mouse, thymic slices present a unique advantage in terms of scalability for high throughput experiments. Further, the relative ease in generating thymic slices and potential to overlay different thymic subsets or other cell populations from diverse genetic backgrounds enhances the versatility of this method. Here we describe a protocol for the preparation of thymic slices, isolation and overlay of thymocytes, and dissociation of thymic slices for flow cytometric analysis. This system can also be adapted to study non-conventional T cell development as well as visualize thymocyte migration, thymocyte-stromal cell interactions, and TCR signals associated with thymic selection by two-photon microscopy.

We describe the preparation of thymic slices that, in combination with flow cytometry, can be used to model positive and negative selection of developing T cells. Thymic slices can also be adapted for the in situ analysis of thymocyte migration, localization, and signaling via immunofluorescence and two-photon microscopy.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / - ו P53 - / - עכברים

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט^{- / - ו P53^{- / - עכברים}}