This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. דור של שורות תאי יציבות המבטאות את החלבון של ריבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת על ידי הוספת FCS מומת חום ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין למסחרי Dulbecco&#39;s זמין השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת Glutamax-אני, פירובט, ו -4.5 ג &#39;/ D-גלוקוז L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח HEK293 תאים בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. תת לטפח תאים בכל יום שלישי. הסר את המדיה וresuspend התאים 15 מיליליטר תקשורת טרי. פיפטה 1 מיליליטר לתוך בקבוק 2 תאים חדש 75 סנטימטרים תרבות ולהוסיף 14 מיליליטר תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע HEK293 בצלחת 6-גם בצפיפות של 2 x 10 5 תאים לכל היטב דגירה במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection משתמש בפרוטוקול המסופק על ידי היצרן של מגיב transfection. Transfect תאים עם pEGFP-C2 או pEGFP-C2-CaeB באמצעות מגיב transfection. לפני שימוש, לחמם את reag transfectionאף אוזן גרון והתקשורת הנדרשת לRT. השתמש יחס 3: 1 של מגיב transfection ל- DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפירוט, פיפטה 1.5 μl של מגיב transfection ישירות לתוך 50 μl של מדיום סרום ללא DMEM. ליצירה מורכבת, פיפטה 0.5 מיקרוגרם של ה- GFP DNA קידוד או GFP-CaeB לתערובת המכיל מגיב transfection דגירה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect תאים על ידי הוספת תערובת התגובה באופן טיפה חכמה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 24 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 מ&quot;ג / מיליליטר geneticin לבחירה של שיבוטים GFP חיובי על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 ימים, בודד תאים בודדים על ידי cytometry זרימת מיון בצלחת 96-היטב מחסה בינונית וsupernatant HEK293 ביחס של 1: 1. צור supernatant HEK293 מתאי ומחוברות HEK293 תרבותיים שcentrifuged במשך 15 דקות ב4966 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, להחליף בינוני תרבות עם מדיום המכיל 1.50; מ&quot;ג / מיליליטר geneticin. שינוי תקשורת פעם בשבוע. אם התאים בצורת monolayer ומחוברות, להעביר אותם לצלחת 24 גם. תת לטפח תאים פעמיים בשבוע ביחס של 1: 5 במדיה המכיל 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר geneticin. לבסוף, לנתח את אחוז תאי GFP החיובי על ידי ניתוח immunoblot וcytometry זרימה. </li></ol> 2. ניתוח של שורות תאי יציבות על ידי ניתוח immunoblot <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כ 4 x 10 4 תאים לדגימה על 12% ג&#39;ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג&#39;לי במערכת ג&#39;ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש SD חוצה כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 4 μl של נוגדן-GFP אנטי ב 4 מיליליטר של MPT דגירה קרומי O / N ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרומים עם 0.8 μl של נוגדנים משני peroxidase מצומדות חזרת ב 4 מיליליטר של MPT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב2.6) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון. </li></ol> 3. לנתח את התאים באמצעות Cytometer זרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בPBS. השתמש HEK293 תאים כביקורת שלילית להתאים קדימה scatter (FSC) וצד פיזור (SSC), כך שהתאים בקנה מידה. צייר שער על תאי חיים על ידי נטרול כפילויות תא, אגרגטים ופסולת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הצינור מכפיל רווח (PMT), כך שהתאים בלא כתם הם בשמאל הקיצוני של ההיסטוגרמה לערוץ FL1 (לייזר ארגון 488 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את עוצמת הקרינה של HEK293-GFP וHEK293-GFP-CaeB תאים לפתוח את היסטוגרמה של ערוץ FL1 ולרכוש 10,000 אירועים באוכלוסייה המגודר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS המסחרי. </li></ol> 4. Transfection של שורת תאים יציבה עם מערכת וקטור ביטוי העין מתנהלת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע HEK293 להביע ביציבות GFP או GFP-CaeB בצלחת 12 גם בצפיפות של 1 x 10 5 תאים / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זריעה 19 שעות, שיתוף transfect התאים עם פלסמיד הרגולטור ופלסמיד תגובה או Bax קידוד או caspase הופעל 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף transfect HEK293 התאים יציביםעם של פלסמיד רגולטור pWHE125-P 100 ng (איור 2) ושל פלסמידים תגובת pWHE655-hBax או pWHE655-revCasp3 (איור 3) ו -0.4 μl של polyethylenimine 100 ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA ומגיב transfection polyethylenimine כל 75 μl של מדיום Opti- ממ דגירה דקות בדיוק 5 ב RT. ליצירה מורכבת, דגירה שני התערובות יחד במשך 15 דקות ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הירידה מבחינת פתרון polyethylenimine / DNA לתאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li></ol> 5. אינדוקציה של אפופטוזיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 שעות לאחר transfection, לגרום לביטוי של החלבונים פרו-אפופטוטיים על ידי תוספת של דוקסיציקלין / מיליליטר 1 מיקרוגרם למדיום התרבות. דגירה תאים במשך 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li></ol> 6. ניתוח של התא המארח אפופטוזיס על ידי ניתוח immunoblot <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תאים לפני שעותarvesting תחת מיקרוסקופ האור כדי לבדוק לזירוז מוות של תאים. תאים אפופטוטיים הם detectible על ידי הנוכחות של גופים אפופטוטיים המקיפים את התא למות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף את התאים דבקו פעם עם PBS החם. Resuspend התאים של חיץ מדגם Laemmli 2x, חום 100 μl במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כ 4 x 10 4 תאים לדגימה על 12% ג&#39;ל SDS-עמוד. בנוסף, עומס 6 μl של סולם חלבון מסחרי כסמן משקל מולקולרי. הפעל ג&#39;לי במערכת ג&#39;ל אלקטרופורזה תחת מתח קבוע של 180 V דקות 45-60 עם חיץ פועל 1x Laemmli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים למחוק על ממברנות PVDF (גודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר) במתח קבוע של 16 V עבור 60 דקות באמצעות תא העברה חצי יבש חוצה הכתם SD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרומי בלוק ב 10 מיליליטר של חלב ללא שומן יבש 5% ב- PBS / Tween% 0.05 20 (MPT) במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 4 μl של נוגדן פולי-ביקע אנטי פולימראז ADP-ribose (PARP) ב 4 מיליליטר של MPT דגירה O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שלושה שלבי כביסה 10 דקות עם 10 מיליליטר של PBS / 0.05% Tween 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרומים עם 0.8 נוגדני μl חזרת peroxidase מצומדות משניים מדוללים ב 4 MPT מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7) ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדנים מחויבים 30 דגירה דקות ב RT עם 7 מיליליטר מערבי כתם Stripping מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלושה שוטף עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7), לחקור את הקרומים עם 4 μl של נוגדן אנטי אקטין ב 4 מיליליטר של MPT O / N ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלושה שלבי כביסה עם MPT (כפי שמתואר ב6.7), דגירה הקרומים עם 0.8 μl של הונוגדנים משני peroxidase מצומדות rseradish מדולל ב 4 מיליליטר של MPT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה שעה 1 ב RT, לשטוף ממברנות שלוש פעמים עם PBS / 0.05% Tween 20 (כפי שמתואר ב6.7 ולזהות פעילות peroxidase חזרת עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. החל ציוד סטנדרטי לפיתוח סרט לדמיין להקות חלבון. הערה: כל שלבי הדגירה בוצעו על שייקר צלחת בפעם והטמפרטורה המצוינת. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

חיידקים פתוגניים רבים נמל מערכות הפרשה להפריש או translocate חלבוני מפעיל חיידקים לתוך התא המארח. יש חלבוני מפעיל אלה את היכולת לווסת את התהליכים ומסלולים בתא המארח, ומאפשר לחיידקים לשרוד ולשכפל בתוך הנישה תאית שלהם. הבנת הפעילות ביוכימית והמנגנונים המולקולריים של חלבוני מפעיל תעזור להבנה טובה יותר של פתוגניות ועשויה לעזור לפתח כלים טיפוליים חדשים כדי להילחם במחלה. יתר על כן, כפי שחלבוני מפעיל לעתים קרובות להפעיל את תפקידם על ידי חיקוי פעולות תא מארח, הם יכולים לשמש גם כדי ללמוד עוד על הביולוגיה של תאים האיקריוטים 1. עם זאת, לומד את הפעילות הביוכימית של חלבון מפעיל בודד הוכיח להיות מסובך מכמה סיבות: 1) יתירות פונקציונלית בין חלבוני מפעיל, 2) תקנה הזמנית של אירוסין של חלבוני מפעיל, ו -3) effecחלבון טור עובד בהקשר עם חלבון מפעיל אחר, להפריע לתפקודו. לכן, הפעילות של חלבון מפעיל נלמדת בדרך כלל על ידי מחקרי ביטוי יתר. למרבה הצער, השימוש בביטוי יתר של החלבון חולף מפעיל יש גם כמה חסרונות. כך, יכולים להיות מועסקים מבחני ניתוח תא בודד בלבד, והפעילות של חלבון מפעיל לא ניתן לנתח אם הפעילות של חלבון מפעיל תלויה בפעילות של חלבון מפעיל אחר. כדי להתגבר לפחות החסרון הראשון, ניתן להשתמש בשורות תאי יציבות. במקרה הביטוי של חלבון מפעיל הוא רעיל לתא, זה לא מתאים. בתרחיש זה, ניתן להקים שורות תאי יציבות ומתנהלות באמצעות מערכת דומה לזו שאנו מתארים כאן לביטוי חולף של חלבונים וישכנע אפופטוזיס (ראה להלן). עם זאת, התוצאות שלנו (איור 5) מראות כי הביטוי של CaeB מגן על תאים מעוברים אפופטוזיס, ולכן לארעיל. יש כמה אפשרויות בלנתח שבצעד בתוך המפל אפופטוטיים CaeB מפריע לאינדוקצית אפופטוזיס. אפשרות אחת היא לקבוע את השותף המחייב התא המארח של CaeB. עם זאת, זה מאוד מאתגר וזיהוי של השותף מחייב אולי לא יעזרו להסביר את נקודת פעולה של CaeB בתוך המפל אפופטוטיים. אפשרות נוספת היא להשתמש מעוררי אפופטוזיס שונים, אבל CaeB מעכב אינדוקציה אפופטוזיס על ידי שני מעוררי אפופטוזיס שונים, UV-אור וstaurosporine 7, מצביע על כך שגישה זו עשויה גם לא להוביל לזיהוי של נקודת פעולה של CaeB. אפשרות נוספת בלצמצם את נקודת פעולה של CaeB, שנוצל כאן, היא להשתמש במערכת שבה מפל אפופטוזיס איתות יכול להיגרם בשלבים מוגדרים. במקרה ביטוי של חלבון מפעיל החיידקים שנבחר כחלבון של עניין כבר מפריע לפיזיולוגיה של תא, expreיכול גם להיות ממוקם ssion תחת שליטה של מערכת ביטוי מושרה, למשל, כמו זה המשמש כדי לבטא את חלבון המטרה. לאחר מכן, ביטוי של שני החלבונים של עניין וחלבון המטרה יהיה במקביל מושרה כאשר יגנד מתווסף לתרבית התאים המאפשר לחוקר לעקוב אחר התאים להשפעות שונות על פיזיולוגיה של תא ואיתות תפוקת מערכת. ברור, המבטא חלבון של עניין ומנסה לזהות נקודת פעולה שלה במסלול תאיים ספציפי על ידי ביטוי מושרה של חלבוני מסלול שנבחרו עובד הכי טוב אם החלבון של עניין מפריע לפעילות הפיזיולוגית של המסלול שנבחר. במקרה זה, קריאת נתונים הוא פשוט חוסר אות בדרך כלל משויך למסלול, כגון מוות של תאים במקרה של איתות או הפעלה של שעתוק אפופטוטיים במקרה של איתות Wnt. בעיקרון, חלבונים המפעילים מסלול מסוים יכולים גם להיות נחקר עם לא זהype של מערכת assay. רק יש לו שיוקם באופן שונה, למשל, באמצעות ביטוי מושרה של sh / סי / מירנה נגד חלבון מסלול ובדיקה אם החלבון של עניין יכול להציל מסלול איתות. לחלופין, מעכבי מולקולה קטנים של חלבונים ספציפיים יכולים לשמש כדי להפריע הולכים אותות בתוך מסלול ולאחר מכן לבדוק הצלת מסלול על ידי ביטוי מושרה של חלבון של עניין. עם זאת, סוג זה של גישה יהיה ניסוי מאתגר יותר מאשר הפרוטוקול שהוצג לעיל. הבחירה של גן המטרה להיות נחקרו בassay ההתערבות היא, בעיקרון, פשוט. עדיף לבדוק כמה שיותר החלבונים במסלול האיתות נבחר ככל האפשר כדי לכוונן את זיהוי של החלבון של האתר של האינטרס של אינטראקציה עם המסלול. זה צריך להיעשות באופן חוזר ונשנה, כי זה לא תמיד אפשרי בניסוי או אפילו אפשרי לפקח על כל Interac הפוטנציאלשותפי tion בניסוי יחיד. לכן, דרך טובה ביותר הוא ראשון לבדוק כמה חלבונים במרווחים באופן שווה לכל אורך המסלול ולאחר מכן כדי לחדד את הניסוי באמצעות המידע שנצבר בסיבוב הראשון. במסלולי איתות, חלבונים רבים שונו לאחר translationally, בין אם על ידי שינוי קוולנטיים, כגון זרחון או sumoylation, או על ידי אירוע עיבוד, כגון מחשוף פרוטאוליטים. כתוצאה מכך, החלבון המתאים הוא או בקרקע מדינה או בצורה פעילה. אם אפשר, עדיף לבדוק את שני הצורות של החלבון משתי סיבות. אחת הוא שהצורה הופעלה מספקת אות גבוהה פלט 31, המציגה אתגר מחמיר יותר לחלבון של עניין. בהוכחה של עיקרון שלנו, למשל, איתות אפופטוטיים, caspase 3 מופעל על ידי מחשוף וdimerization פרוטאוליטים. אירוע הפעלה זו ניתן לדמות באופן מלאכותי על ידי ארגון מחדש את הגן הפרו-caspase לא מעובד. המקטע הקטן ממוקם באופן מלאכותימול המקטע הגדול ושניהם הצטרפו מקשר. זה נקרא &quot;caspase הפוך&quot; ומייצג את הצורה פעילה של האנזים כאשר הביע 35. הוא נבחר בשל הרמה גבוהה יותר של פעילות. הסיבה השנייה לחיטוט שניהם קרקע מדינה וצורות מופעלות של חלבון מסלול, משום שהיא מאפשרת לאדם להבחין אם החלבון של עניין מפריע להפעלה של חלבון המטרה, או אם היא פועלת במורד זרם של החלבון במסלול. במקרה הראשון, מוות של תאים יהיה עכבות אם טופס קרקע המדינה בא לידי ביטוי, אבל לא אם הצורה פעילה היא הווה. במקרה השני, לא חלבון יוביל לאפופטוזיס. לפיכך, בדיקת שני הצורות של חלבון מהונדס משפרת את הרזולוציה של המערכת האנליטית. שיבוט גן המטרה בוקטור הביטוי מושרה דורש כמה החלטות. ראשית, יהיה ביטוי של גן המטרה להתרחש רק זמני או שזה יותר טוב אם הווקטור הוא שלמשולב tably לתוך הגנום של התא המארח הקו? אם נדרש ביטוי חולף בלבד, וקטור פשוט כגון 24 pUHC13-3, המכיל מקדם ט-תלוי ואתר פולה, או וקטור דו-כיוונית כגון PBI-2 או PBI-3 36, ביטוי זוגות ששל הגן המעניין את הביטוי של גן כתב לניטור קל יותר של ביטוי גן המטרה, יהיה מספיק. אם ביטוי יציב עדיף, יש להשתמש וקטור כגון pWHE655 33 (איור 3). הוא מכיל מבודד כי האגף יחידת ביטוי transgene כדי למנוע תופעות עמדה באתר האינטגרציה הגנומי מלהתערב עם ביטוי transgene מושרה. הוא מכיל גם קשור, אבל הביע באופן עצמאי, קלטת התנגדות לG418 כדי להקל על הבחירה של אירועי אינטגרציה וקטור. התוצאה הסופית של שינויים אלה היא עלייה במספר השיבוטים עם מאפייני רגולציה מצוינים 33,37,38. cDNA sequences של גני המטרה ניתן לשכפל לוקטור זה על ידי שימוש באתרי ההגבלה הייחודיים לEcoRI וEcoRV 33. שיבוט של הווקטור המבטא את ההפך caspase-3 cDNA תואר בפירוט בהתייחסות 33. שיבוט של הווקטור להביע Bax האנושי בוצע באנלוגיה. CDNA Bax האדם היה מוגבר על ידי PCR מפלסמיד pVenus-באקס 39 באמצעות פריימרים oligonucleotide שמציגים אתרי הגבלה לEcoRI וEcoRV. לאחר הטיהור של שבר PCR והגבלה עם שני אנזימים, שבר היה ligated עם pWHE655 גם מוגבל, מניב pWHE655TREtight-באקס. שנית, שמינימאלי אמרגן הוא מתאים ביותר לביטוי transgene? האמרגן המינימלי המקורי P hCMV * -1 24 מציג כמה דליפות ספציפיות תאים מסוג 30, נובעים בחלקו הנוכחות של אלמנטי תגובה מושרה הפונקציונליים α-אינטרפרון 29. זה הוביל לפיתוח של הדור השני ט-תלוייזמים, כינו ΔMtetO, TREtight וSG-TRE, עם מרווח שינה ורצפים בין אלמנטי TETO ועם רצפי אמרגן מינימאליים שונים 33,40-42. הם מציגים מופחתים במידה ניכרת דליפות בהעדר דוקסיציקלין. בין יזמי הדור השני אלה, יש ΔMtetO רמת ביטוי transgene הנמוכה ביותר בנוכחות דוקסיציקלין 33. TREtight מתווך ברמה הגבוהה ביותר ביניים וSG-TRE ביטוי transgene 33. שינויים נוספים שממוזערים ביטוי רקע של אמרגן התגובה טטרציקלין אפילו יותר 43,44. לפיכך, הבחירה של אמרגן טטרציקלין מגיב יכולה להתבצע בהתאם לדרישות או המגבלות של transgene בהתאמה. עצמאי של הסוג של גישה ניסויית, אטימות של ביטוי של חלבון המטרה חשובה. לדוגמא, אינדוקציה של אפופטוזיס עם צורות מופעלות של חלבונים פרו-אפופטוטיים מובילה לתאמוות, גם כאשר כמויות מזעריות בלבד של חלבון מטרת בהתאמה באות לידי ביטוי 31-33. ההחמרה הנדרשת מושגת על ידי הוספת transsilencer טטרציקלין תלוי במערכת הרגולציה המותנה 30. זה מבטיח כי שעתוק מהאמרגן מושרה מודחק באופן פעיל, וזה חשוב במיוחד כאשר transfections החולף מבוצע, שכן הם בדרך כלל לא דולפים בביטוי transgene 30. אם מסלולי איתות שלא לגרום למוות תא חקרו, הדרישה לרגולציה מחמירה של ביטוי גן המטרה יכולה להיות רגועות ומערכות מושרה ללא transsilencer יכול לשמש לחלופין 43,44. מערכת הרגולציה מושרה נהגה לחקור את מסלול האיתות לא צריכה להיות מערכת ט. היתרון הגדול שלה הוא שזה כבר נעשה שימוש אינטנסיבי בתאי יונקים במשך יותר מ -20 שנים וכי הוא מפותח ביותר והפרק הטוב ביותרמערכת בקרה מושרה aracterized. עם זאת, יש לפחות 25 מערכות אחרות מותנות רגולציה 45,46 שיכולים להיות מועסק לחלופין, או בנוסף למערכת ט. שתיים או שלוש מערכות מושרה שונות עשויות להיות שימושיות בחיטוט מתכנס מסלולי איתות או לבדיקת יתירות של שני גני היעד או החלבון של עניין. ההליך שהוצג כאן צריך לעבוד עם יעילות transfection שתגרום לאות פלט חזקה ואמינה ממסלול האיתות המתאים, כי הוא נחקר. בגלל שורות תאי היציבות לבטא את החלבון של העניין באופן הומוגני (איור 4), כל התאים שהם transfected זמני עם פלסמיד מושרה המבטא את החלבון של ריבית חקרו להפרעה של החלבון של עניין עם איתות מסלול.

האלימות של חיידקים פתוגנים גראם שלילי רבים תלויה במערכות הפרשה מיוחדות לחטוף תאי מארח האיקריוטים. חיידקים משתמשים במערכות הפרשה אלה להזריק חלבוני חיידקים ארסי (effectors) לתא המארח כדי לווסת את מגוון פעילויות סלולריות וביוכימיים. המחקר של חלבוני מפעיל לא רק סיפק תובנה מדהימה להיבטים בסיסיים של מארח / אינטראקציות הפתוגן אלא גם לביולוגיה הבסיסית של תאים האיקריוטים 1. אפנון של אפופטוזיס תא המארח הוכח להיות מנגנון ארסיות חשוב עבור רבים פתוגנים תאיים, ומספר חלבוני מפעיל ויסות אפופטוזיס זוהה 2-9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים פעילותם להישאר חמקמקים במקרים רבים. אפופטוזיס, צורה של מות תא, ממלא תפקיד חשוב בתגובה חיסונית לזיהום 10. יש שני מסלולים עיקריים שמוביל לאפופטוזיסזוהה: מיקוד מיטוכונדריה (אפופטוזיס הפנימי) או התמרה ישירה של האות באמצעות קולטני מוות של תאים בקרום הפלזמה (אפופטוזיס החיצוני). המסלול הפנימי או בתיווך מיטוכונדריה המוות של תאים מופעל על ידי אותות תאיים וכרוך בהפעלה של Bax ובק, שני חברים פרו-אפופטוטיים של משפחת Bcl-2. משפחה זה מורכב מחלבוני רגולטור בעד ונגד אפופטוטיים ששולטים תא מוות 11-14. הפעלה של אפופטוזיס מובילה לoligomerization של Bax ובק ואחריו permeabilization הבא של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, וכתוצאה מכך שחרור ציטוכרום C לתוך הציטופלסמה. שחרור ציטוכרום C יוזם הפעלה של caspases מפעיל 3 ו -7 באמצעות הפעלה של caspase 9 בapoptosome 15. זה מוביל לproteolysis של מצעים נבחרו ש, בין יתר, בתוצאות החשיפה של phosphatidylserine על פני תא 16 ומשחרר DNase ייעודי שברי פרקromatin 17,18. כדי לקבוע היכן בתוך המפל אפופטוטיים חלבון מפעיל בודד מפריע, מערכת ביטוי מושרה הועסקה 19. מערכות רגולטוריות לביטוי מותנה של transgenes היו כלי רב ערך בניתוח הפונקציה של חלבון בתוך התא או חשיבותו לרקמות, איברים ופיתוח גוף, כמו גם בייזום, התקדמות ותחזוקה של המחלה 20-23. בדרך כלל, מערכות בקרה מושרה, כגון מערכת ט &#39;24 מועסקים כאן, יוצרות יחידת שעתוק מלאכותית (ראה איור 1). מרכיב אחד הוא גורם מהונדס באופן מלאכותי שעתוק נקרא TTA (activator תעתיק טטרציקלין תלוי), שהוקם על ידי מיזוג של מדכאי שעתוק חיידקי TetR 25 לתחום חלבון יונקים שמתווך הפעלת תעתיק או השתקת 24,26. המרכיב השני הוא היברידיאמרגן, כינה TRE (אלמנט טטרציקלין מגיב), בהיקף של אמרגן מינימאלי אוקריוטים, המכיל לפחות TATA-תיבה ואתר ייזום שעתוק, הצטרף לחזרות מרובות של אתר ה- DNA מחייבת אותו המקור לTetR, TETO 24,25. המרכיב השלישי הוא יגנד הטבעי של TetR, טטרציקלין או אחד מנגזרותיו, כגון anhydrotetracycline או דוקסיציקלין 25. עם בנוסף ליגנד למדיום התרבות, TetR מאבד זיקתה לTETO ומנתק מTRE. כתוצאה מכך, שעתוק של גן המטרה הוא בוטל. ביטוי transgene יכול, ובכך, להיות מבוקר היטב באופן זמן ותלוי-מינון בשתי תרבית התאים ובחיות 20,23,24. עם TTA, ביטוי transgene מתרחש constitutively, אלא בנוכחות של טטרציקלין. זה יכול להיות חסרון בחקר חלבונים רעילים לתאים סרטניים או בגלל טטרציקלין יש ראשון שהוסר מהמערכת, לפני שהשתקף transgenen מתרחש וניתן לנטר את ההשפעות של חלבון המטרה בתא. זה יכול להיות זמן רב ולא תמיד מלא, במיוחד בבעלי חיים מהונדסים 27. כדי לטפל במגבלה זו, מוטציה TetR עם תגובה הפוכה לנוכחות של דוקסיציקלין שימשה כדי ליצור גורם שעתוק חדש, rtTA (הפוך TTA) 28. זה רק נקשר לTRE ו, במקביל, מפעיל שעתוק בנוכחות דוקסיציקלין. דליפות שייר של המערכת, כלומר., ביטוי transgene בהעדר גורם שעתוק קשור-TRE, שמקורו גם (i) מהשפעות עמדה באתר אינטגרציה הגנומי, (ii) מTRE עצמו 29, או (iii) שמאינו -specific מחייב של TTA / 28 rtTA, היה ממוען על ידי החדרת משתיק תעתיק נוסף, כינה TTS (משתיק קול תעתיק טטרציקלין תלוי) 30 למערכת. הוא יוצר רשת רגולטור כפולה יחד עם rtTA (ראה איור 1).בהעדר דוקסיציקלין, TTS נקשר לTRE ופעיל כיבוי כל שעתוק שנותר. בנוכחות של דוקסיציקלין, TTS dissociates מTRE וrtTA נקשר בו זמנית גרימת ביטוי של גן המטרה. שכבה נוספת זו של החמרה לעתים קרובות יש צורך לבטא את החלבונים רעילים לתאים פעילים מאוד 31-34. שימוש במערכת כפול רגולטור לפיקוח הדוק זה, המפל אפופטוטיים יכול להיות יזם בצעד שהוגדר מאפשר ניתוח של האם חלבון מפעיל נתון יכול להפריע אינדוקציה אפופטוזיס. שיטה זו יכולה לא רק לשמש כדי לחקור את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבוני מפעיל חיידקים, אלא גם לביטוי מושרה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לנתח הפרעה למסלולי איתות אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת לנתח שבצעד חלבון מטרה, או לחלופין מולקולה קטנה, אינטראקציה עם הרכיבים של מסלול איתות. השיטה מבוססת, מצד האחד, על הביטוי מושרה של חלבון ספציפי ליזום אירוע איתות בצעד שהוגדר מראש ובמפל האיתות נבחר. ביטוי בד בבד, ומצד שני, של הגן של עניין לאחר מכן מאפשר לחוקר להעריך אם הפעילות של חלבון המטרה הביע ממוקמת במעלה הזרם או במורד הזרם של אירוע איתות יזם, בהתאם את ההודעה של מסלול האיתות שמתקבל. הנה, המפל אפופטוטיים נבחר כמסלול איתות מוגדר להפגין פונקציונלי פרוטוקול. חיידקים פתוגניים, כגון burnetii Coxiella, translocate חלבוני מפעיל שמפריעים לאינדוקצית מות תא מארח בתא המארח כדי להבטיח את הישרדות חיידקים בתא ולקדמםהפצה באורגניזם. ג חלבון מפעיל burnetii CaeB מעכב ביעילות מוות של תאי מארח לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם UV-אור או עם staurosporine. כדי לצמצם את הצעד שבי CaeB מפריע להתפשטות של האות אפופטוטיים, חלבונים שנבחרו בפעילות פרו-אפופטוטיים מאופיינת היטב לידי ביטוי באופן זמני דוקסיציקלין והעין מתנהלת. אם CaeB פועל במעלה הזרם של חלבונים אלה, אפופטוזיס ימשיך ללא הפרעה. אם CaeB פועל במורד הזרם, מוות של תאים יהיה מעוכב. חלבוני הבדיקה שנבחרו היו באקס, הפועל ברמה של המיטוכונדריה, וcaspase 3, המהווה את פרוטאז התליין הגדול. CaeB מפריע למוות של תאים הנגרם על ידי ביטוי באקס, אך לא על ידי caspase 3 ביטוי. CaeB, ובכך, אינטראקציה עם המפל אפופטוטיים בין שני החלבונים האלה.

ראשית, קווי HEK293 תאי יציבות המבטאים את החלבון של העניין (CaeB) כחלבון ה- GFP-היתוך הוקמו. כביקורת, שורות תאי HEK293 ביציבות להביע GFP היו גם נוצרו. ביטוי של ה- GFP וGFP-CaeB אומת על ידי ניתוח immunoblot. Immunoblot הנציג (איור 4 א) מדגים ביטוי יציב וברור לזיהוי של ה- GFP וGFP-CaeB. עם זאת, assay זה לא יכול לקבוע אם כל התאים להביע GFP או GFP-CaeB. לכן, שורות תאי HEK293 transfected ביציבות נותחו גם על ידי cytometry זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4, מעל 90% מהתאים בשתי שורות התאים הביעו GFP. כך, ניתן להשתמש בשורות תאי יציבות אלה כדי לנתח את הפונקציה של CaeB נוסף. בשלב הבא, הפעילות אנטי-אפופטוטיים של CaeB הייתה assayed על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן נגד PARP ביקע. מחשוף מפרקי חלבונים של PARP הגרעיני מנטרל פעילות תיקון DNA והוא סמן אופייני termiשלבים סופיים של אפופטוזיס. מחשוף של PARP לא זוהה בHEK293-GFP או HEK293 תאים-GFP-CaeB, הוכחה כי לא הביטוי של ה- GFP, ולא של ה- GFP-CaeB הוא רעיל לתאים. עם זאת, כאשר טופלו התאים עם staurosporine, inducer חזק של אפופטוזיס הפנימי, מחשוף של PARP זוהה (איור 5). חשוב לציין, HEK293 תאים-GFP-CaeB יפגינו מופחתים מחשוף של PARP, המציינים את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבון Coxiella burnetii IV סוג מפעיל מערכת הפרשה 7 CaeB. כדי לנתח שבשלב CaeB מפריע למסלול אפופטוטיים, מערכת ט-האון הועסקה. בפירוט, HEK293 תאים-GFP או HEK293-GFP-CaeB היו transfected עם פלסמיד רגולטור constitutively להביע מדכא כפול / התקנה בשליטת דוקסיציקלין activator (איור 2) וקידוד פלסמיד תגובת pTRE או באורך מלא באקס אנושי או הצורה פעילה של caspase אדם 3, מכונה revCasp 3 (איור 3). מערכת זו מוסדרת בחוזקה, כפי שהודגם על ידי חוסר מחשוף PARP בתנאי גרימה-עישון (איור 6). תוספת של דוקסיציקלין לתאי transfected הביאה את הביטוי של Bax או 3. revCasp אם CaeB מפריע למסלול אפופטוטיים במורד הזרם של Bax, אז האות אפופטוטיים שנוצרה על ידי ביטוי וההפעלה הבאה של Bax צריכה להיות חסום על ידי ביטוי CaeB. ואכן, HEK293 תאים ביציבות להביע GFP-CaeB עמוק לעכב אינדוקציה אפופטוזיס על ידי ביטוי בשליטת דוקסיציקלין Bax, בעוד תאי HEK293-GFP מוצגים מחשוף PARP ברור. תוצאה זו מצביעה על כך שאינדוקצית אפופטוזיס לוקי CaeB במורד הזרם של הפעלה באקס. בשלב הבא, זה נותח אם CaeB יכול להפריע caspase 3 הפעלה - אירוע בסוף המסלול אפופטוטיים. HEK293 תאים-GFP, כמו גם תאי HEK293-GFP-CaeB, מחשוף PARP התערוכה (איור 6), מצביעים על כך שפעם אחת caspase מפעיל 3 Activated, CaeB לא יכול למנוע אפופטוזיס התרחשות. יחד נלקח, נתונים אלה מראים כי CaeB פועל בין Bax וcaspase 3 הפעלה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52903/52903fig1.jpg" /> איור 1. סקירה סכמטי של מערכת הרגולציה טטרציקלין. מערכת ט-האון מורכב משני פלסמידים שונים, פלסמידים רגולציה ותגובה. פלסמיד הרגולציה מקודד transsilencer ט-התגובה (TTS; עיגול מלא) וtransactivator ההפוך ט-התגובה (rtTA, מעגל פתוח). שני החלבונים באים לידי ביטוי constitutively תחת השליטה של האמרגן החזק, המכונן התארכות גורם-1 אלפא (P EF-1a). TTS וrtTA גורמי שעתוק chimeric המורכב מתחום אוקריוטים תעתיק רגולציה (משתיק קול או activator, בהתאמה) ומדכאי טטרציקלין חיידקים (TetR). TetR מתווך DNA מחייב לשבעה ט &#39; </em&gt; רצפי מפעיל (TETO) על פלסמיד התגובה. TETO ממוקם במעלה הזרם של אמרגן ציטומגלווירוס המינימלי מושרה (P CMV), ביחד ויוצרים אלמנט ט-התגובה (TRE). תחת ללא גרימת תנאים, TTS חייב TRE מניעת ביטוי. לאחר תוספת של דוקסיציקלין (Dox; יהלום מלא), rtTA אינטראקציה עם Dox מוביל לשינויים ולהפעלה קונפורמציה. rtTA הופעל מחליף TTS על פלסמיד התגובה, המאפשר שעתוק של גני המטרה המתאימה Bax וcaspase 3, ובכך מוביל לאפופטוזיס אינדוקציה ומוות של תאים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52903/52903fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52903/52903fig2.jpg" /> איור 2. סקירה סכמטי של pWHE125 פלסמיד הרגולציה. אלמנטים חיוניים להתפשטות בBacקפיטריה, כולל מקור של שכפול (אורי PBR) וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה אמפיצילין נגד (Amp R), וביטוי של ט-transregulators, כגון האמרגן / משפר החזק, מכונן המיידית המוקדמת של ציטומגלווירוס האדם (P / E hCMV), אתר הריבוזום פנימי מחייב מפוליו-וירוס (PV-IRES) ופולה-אתר מהווירוס קופי 40 (SV40 פולה) מוצגים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52903/52903fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52903/52903fig3.jpg" /> איור 3. סקירה סכמטי של פלסמיד התגובה. אלמנטים חיוניים להתפשטות חיידקים, כולל מקור של שכפול (אורי PBR) וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה (Amp R), וביטוי מושרה באאוקריוטים, כגון expressi transgeneבקלטת עם האמרגן ט-התלוי המינימלי TREtight (P TREtight), הגן של אדם עניין באקס (hBax) ואתר פולה מוירוס קופי 40 (SV40 פולה), מתוארים. קלטת ביטוי transgene מוקפת חוזר ישיר טנדם של שני עותקים של רצף עוף HS4 הליבה מבודדת (ליבת HS4). בנוסף, קלטת התנגדות G418 בהיקף של אמרגן קינאז phosphoglycerate עכברי 1 (P mPGK), גן נאומיצין התנגדות (G418 R) ואתר פולה קינאז תימידין האנושי (TK פולה) הוא הווה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52903/52903fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52903/52903fig4.jpg" /> איור 4. HEK293-GFP וHEK293-GFP-CaeB יציבות להביע חלבוני ניאון ירוקים. () Lysates שלמות התא של HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB היו immunoblotted לGFP להראות ביטוי יציב. ניתוח (ב) cytometry זרימת נציג (FACS) של HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB מוצג כדי להדגים את עוצמת הביטוי של GFP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52903/52903fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52903/52903fig5.jpg" /> איור 5. השפעות של הביטוי של ה- GFP-CaeB על אפופטוזיס המושרה staurosporine. HEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB טופלו עם 4 מיקרומטר staurosporine במשך 6 שעות כדי לגרום לאפופטוזיס הפנימי. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP הופחת בHEK293 תאים-GFP-CaeB בהשוואה לתאי HEK293-GFP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52903/52903fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר</a>של נתון זה. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52903/52903fig6.jpg" /> שימוש איור 6. במערכת טיטון כדי לצמצם את נקודת פעולה של CaeB. () אפופטוזיס היה מושרה על ידי ביטוי של Bax בHEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP הופחת בHEK293 תאים-GFP-CaeB בהשוואה לתאי HEK293-GFP. (ב) אפופטוזיס היה מושרה על ידי ביטוי של revCasp 3 בHEK293-GFP וHEK293 תאים-GFP-CaeB. אפופטוזיס נותח על ידי ניתוח immunoblot PARP ביקע. מחשוף PARP היה דומה בHEK293 תאים-GFP-CaeB וHEK293-GFP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52903/52903fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling at JoVE.com

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K Views.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Video: Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.