This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

The authors have nothing to disclose.

분비 시스템, 세균 이펙터 단백질의 숙주 세포의 세포질에서 이러한 시스템의 전송은 많은 병원성 박테리아가 복제 성 고유 한 틈새 내에서 감염을 확립 이용하는 중요한 독성 성분이다. 많은 연구 그룹의 초점은 세균 이펙터 호스트 단백질 및 숙주 세포에서이 경로 이펙터가 영향 사이의 상호 작용을 조사했다. 매우 제한된 조사있는 경우 호스트 단백질 성공 세균 이펙터 전위 필요한 될 가능성을 검토했다. 이 연구에서 우리는 의무적 세포 내 병원균 Coxiella burnetii의, 인수 공통 Q 발열의 원인이 에이전트를 사용했다. 숙주 세포에 진입 한 후, Coxiella 함유 공포는 수동적으로 매우 높은 숫자에 복제 산성 리소좀 유래 공포를 도달 할 때까지 정규 세포 내 이입 경로를 통해 트래 피킹. 별도로 ADVANTA을 복용에서일반 호스트 인신 매매 경로의 GE는 성공적인 복제 성 틈새 시장을 구축하기 Coxiella의 능력은 기능 형 IVB 분비 시스템 (T4SS) 이후 이펙터 전위 8, 17을 사용합니다. 이 분비 시스템은 레지오넬라의 잘 특성화 점 / ICM T4SS 기능적으로 유사하다. 이것은 적절하게 각각의 Coxiella 유전자 (19, 20)와 레지오넬라 균의 특정 점 / ICM 돌연변이를 보완에 의해 입증되었다. 레지오넬라 및 Coxiella 양자의 T4SSs 복제에 필수적이지만,이 시스템이 활성화 될 때의 타이밍이 매우 상이하고 각각의 복제 성 틈새의 발산 특성을 반영한다. 레지오넬라 T4SS 즉시 숙주 세포 및 이펙터의 급속한 전좌과 접촉시 발생되는 박테리아 기본 엔도 - 리소좀 경로를 피하고 대신 고유 ER 유래 복제 성 진공을 생성 할 수르 42. 박테리아는 산성 리소좀 유래 공포 (21)에 도달 한 후 대조적으로, Coxiella의 T4SS은 약 8 시간 게시물 감염 될 때까지 활성화되지 않습니다. Coxiella 수동적는 리소좀에 도달 할 때까지 활성화되지 않은 세포 내 이입 경로와 전위 시스템을 통해 천이 점을 감안, 유일한 기회는 세포 내 이입 성숙을 연구하는 도구로 Coxiella를 사용하는 자체를 제공합니다. 이펙터 전좌되기 전에 CCV 대한 요구는 호스트 단백질의 다수의 세포 내 이입 피킹 경로에 관여하는 단백질, 숙주 세포질에 효과기 단백질 전좌 중요 특히 이에 한정하지 않은 것을 나타낸다 산성화 될. 특정 타겟 방식의 siRNA를 이용하여 우리는 이펙터 전위에 특정 호스트 단백질의 역할을 규명하기 시작할 수있다. 이 연구에서 우리는 진핵 세포 내 이입 trafficki을 조절하는 두 단백질에 초점을 맞춘따라서 NG 경로와는 Coxiella 이펙터 CBU0077의 전위에 영향을 예측 하였다. 각각 초기와 후기 엔도 좀과 Rab5A 및 Rab7A 제어 막 융합. 제어 OTP의 siRNA (도 5b)와 비교했을 때의 siRNA를 사용하여 이러한 단백질의 하나를 음소거하는 CBU0077의 전위 효율의 현저한 감소 결과. 여기에 표시된 대표적인 결과는 이전 발행 결과 (21)을 반영하고 Coxiella 이펙터 전위 이러한 인간의 랩 단백질의 중요성에 추가 유효성 검사를 제공합니다. 이 기술은 Coxiella 도트 / ICM 이펙터 전위 다른 호스트 프로세스의 영향을 특성화하는데 사용되어왔다. retromer 단지는 Coxiella의 세포 복제에 중요한 것으로 밝혀졌다. 우리가 retromer가를 유도 환경을 만드는 데 필요한 보여줄 수있는 전위 분석을 retromer 구성 요소를 침묵의 siRNA를 사용하고 수행함으로써Coxiella 이펙터 전좌 43. 여기에 도시 된 대표적인 결과이지만 감염된 OTP 제어 및 siRNA를 표적 Rab5A Rab7A과의 비교는, 프로토콜이 실험의 필요에 따라 변형 될 수있다. 예를 들어, 이펙터 전위의 레벨은 스크램블 siRNA를 비 형질 전환 세포로 형질 감염된 세포와 비교 될 수있다. 이 특정 연구의 초점은 의무적 세포 내 병원균 C.이었다 burnetii 피킹 및 세포 내 이입에 관련된 단백질, 그러나 내에서 설명 된 방법을 용이하게 무력화 분비 시스템을 이용하는 다른 세포 및 세포 외 병원균에 적용될 수있다. 실제로, 여기에서 사용되는 호스트 세포질 내 β-lactamase의 활성에 의존하는 형광체 기반 분석 전위가 이미 광범위 병원균 30-32,35,44의 범위에 걸쳐 사용되어왔다. 의 자연적, 감염 상태사용되는 특정 세포주 특정 세균 감염의 요구를 반영하도록 구성되어야한다. 또한, 알려진 내생 이펙터는 β-lactamase를가하기에 설명 된 방법의 성공에 가장 중요 융합. 프로토콜의 성공적인 구현을위한 하나의 중요한 고려 사항은 여기에서 설명하는 세균 항목 및 후속 복제에 미칠 수있는 특정 호스트 대상을 침묵에 미치는 영향이다. 여기에, Coxiella에 의해 이펙터 전위는 24 시간 후 감염을 측정한다. 이 경우, 다른 세포 내 박테리아 숙주 세포로 항목을 얻을 수있는 유기체의 능력은 중요하다. 또한, 특정 유전자 침묵은 따라서 관찰 전위 레벨을 변경하는 박테리아 복제에 영향을 미칠 수있다. siRNA의 침묵 크게 세균 항목 및 / 또는 복제 및 따라서 전위 효율에 영향을주지 않는 것을 확인은, 현미경이나 세균 명수법을 사용하여 달성 될 수있다. 전좌데이터는 siRNA를 처리 당 감염된 세포의 수를 정규화 할 수있다. Coxiella는 24 시간 배양 기간 중에 복제에 조금 겪는으로 세균 복제는 여기에 제시된 데이터를 혼동하지 않았습니다. 이 방법은 관심의 유전자의 충분한 침묵을 보장하기 위해 숙주 세포에 siRNA를 효율적으로 형질 전환이 필요합니다. 이 마음으로 올바른 형질 감염 시약을 선택하는 것은 매우 중요하다. 별도로 시약과 헬라 229 세포에 최적화 된이 특정 연구에 사용 된 조건에서 선택할 수 많은 다른 시약이 있습니다. 다른 형질 전환 시약을 이용하여 최저 효율이 가장 적절한 시약 모두가 선택되도록하여 RT-qPCR의 정량을 사용하여 siRNA를 특별히 선택된 관심의 성적을 대상이 될 수있다. 본 연구에서 제시되지는 않았지만, 우리는 이전에 두 Rab5A의 최저 효율성을 입증하고 Rab7A는 RT를 사용하여-qPCR 21. 또한, 웨스턴 블롯으로 관심과 확인의 대상에 대한 항체의 사용은 특정 대상의 siRNA 침묵을 확인할 수 있습니다. 의 siRNA를 사용할 때주의를 기울여야하는 두 가지 다른 중요한 고려 사항은 오프 대상 효과의 가능성과 형질 세포의 세포 생존 능력을 포함한다. 의도하지 않은 대상도 파괴 될 때 오프 대상 효과가 발생합니다. 이 표현형의 변화로 이어질 수 있으며, 오탐 (false positive)이 발생할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 하나의 호스트 대상을 침묵 사 siRNA 이중 가닥의 풀을 이용했다. 특정 대상 침묵​​하면이 결과는 네 siRNA 이중 가닥을 분리하고 전위 분석을 반복함으로써 달성 될 수있는 오프 - 타겟 효과 때문이 아니라고 전좌 효율 유효성의 저하가 발생하면. 네 siRNA 이중 가닥 중 두 적어도 원래의 siRNA를 풀 유사한 표현형을 입증해야한다. 이 결과, 하나는 높은 확신 할 수 있다는 관찰 TRanslocation 효율 오프 - 타겟 효과 때문이 아니다. 생성 된 전위 결과의 유효성은 세포 생존 능력에 의존한다. 전좌 분석 후 핵 얼룩의 적용은 siRNA를 입을 다음 세포 생존 능력의 열거를 할 수 있습니다. PLK1의 경우, 중요한 세포 죽음은 쉽게 오염없이 관찰 될 수있다; 그러나, 표면 형광 현미경을 더 정확한 표현을 사용하는 것이 달성 될 수있다. 컨트롤과 비교하여, 예를 들어 50 %를 관찰 특정 호스트 타겟 중요한 세포 죽음을 침묵함으로써, 않을 경우 정확한 픽처 이펙터의 전위로 특정 숙주 단백질의 중요성에 관하여 추론 할 수있다. Rab5A 또는 Rab7A를 침묵하는 세포 생존율 (도 5C)에 약간의 영향을 미치고 있지만, 본 연구에서 나타난 바와 같이,이 감소가 관찰 된 전위 데이터의 유효성을 상쇄하기에 충분한 발음되지 않는다. 세포 생존 능력의 FOLL에 관해서 또 다른 고려 사항siRNA의 침묵을하기 때문에 중요한 세포 죽음은 종종 전좌 비율의 증가를 초래 관찰된다. 이는 적절 PLK1 (도 5a)에 대한보고 전좌 데이터에 의해 입증된다. 감소 된 세포 수는 감염의 다중도에 비례하여 증가를 초래한다. 이것은 감염률 따라서 전위 비율을 증가시킬 것이다. 본 연구에서 제시되지 않았지만, 이펙터 전위의 시각화는 무료 정량적 결과를 얻을 수있다. 별도의 여기 및 발광 광 긴 패스 이색 미러 끼워진 epifluorescent 현미경을 이용하여 세포 내 BLAM 기판 형광의 육안 관찰을 제공 할 수있다. β - 락타 마제 리포터 시스템에 가능한 대안은 아데 닐 레이트 사이 클라 제 - 리포터 시스템을 이용하는 것이다. 여기에 설명 된 리포터 시스템은 유사하게, 관심있는 유전자는 cyaA (a 칼 모듈 린 - 의존적 아데 닐 레이트 시클 라제 유전자 융합 </em&gt;) 보르 데 텔라 백일해에서 유래. 이펙터 전위는 면역 ELISA 키트를 사용하여 세포 내 환형 AMP (캠프)의 정량화에 의해 측정 될 수있다. 대한 CyaA의 활성 호스트 세포질에만 존재하는 숙주 세포의 칼 모듈 린에 완전히 의존하기 때문에, 전위는 이펙터의 cAMP 수준의 상승에 의해 확인된다. 이 방법은 또한 박테리아 45-47의 다양한 효과기 전위를 측정하기 위해 성공적으로 사용되었지만, 세포의 cAMP의 정량화는 캠프에서 기술 된 방법에 비해 더 많은 시간 소비되는 프로세스를 추출하는 숙주 세포의 용해에 의존한다. BLAM 기판 세포에 직접 첨가 할 수 있고, 형광 시간 내에 측정 될 수 있기 때문에 FRET 계 β - 락타 마제 리포터 시스템을 사용하여 이펙터 전위의 측정은보다 효율적이다. 또한, 여기에서 설명 된 방법보다 쉽게​​ 특히 96- 웰 형태의 높은 처리량 결과를 생성하도록 구성 될 수있다에서. 대부분의 세균성 병원균 병원균 혜택을 숙주 세포 기능의 조절을 허용하는 숙주 세포에 효과기 단백질을 도입하는 단백질 전좌 시스템에 의존한다. 타입 IV 분비 시스템은 이러한 레지오넬라, Coxiella 및 브루셀라와 같은 세포 내 세균에 의해 사용되는 유형 III 분비 시스템을 부착하고 E. 나온다 잖아 클라미디아 포함 병원체의 범위에서 이용된다 대장균과 살모넬라 균. 병원균의 범위에 의해 이펙터 전좌 특정 숙주 단백질의 침묵 발현의 효과를 비교함으로써, 개별 병원균 분비 시스템 또는 특정의 특정 유형에 의해 이펙터 전위 필요한 숙주 요인 이해는 설명 될 수있다. 이 호스트 병원체 상호 작용의 복잡성을 연구하는 독특한 접근 방식을 제공합니다.

Coxiella burnetii의는 인수 공통 인체 감염 Q 열병을 일으키는 독특한 세포 내 병원균이다. 이 질환은 증상이 혈청에서 종종 노출 한 후 심내막염 년으로 나타난다 생명을 위협하는 만성 감염 연장 임상 프레 젠 테이션의 광범위한 스펙트럼과 연결됩니다. 인간의 감염은 주로 반추 동물, 특히 젖소, 양, 염소 감염의 주요 저수지와 오염 된 에어로졸의 흡입을 통해 발생합니다. 이러한 동물 Coxiella 감염은 일반적으로 무증상이지만 감염 낙태를 트리거 할 수 있으며, 유체 출산 및 태반 내의 상당한 세균 부하는 한 로컬 환경을 오염시킬 수있다. 공중 보건과 농업 산업 모두 최근 네덜란드 2에서 발생한 Q 열병 발생이 관찰되었다에 엄청난 부담 등 오염의 예는 수 있습니다. 2007 년과 사이2010, Q 열병 4,000 통해 인간의 경우는 진단받은이 발발은 염소 농장 3의 중요한 오염에 연결되었다. 또한, Coxiella 인해 심각한 이환율과 사망률 (4)을 일으킬 수있는 박테리아와 필요한 낮은 전염성 선량의 환경 안정성에 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류로, 잠재적 인 생물학적 무기입니다. Coxiella은 두 단계에 존재하는 천연 소스에서 고립 된 단계 I 생물은 매우 악성이며, 단계 II 생물이 높은 생체 내에서 감쇠된다. 예를 들어, Coxiella burnetii 나인 마일 단계 I 생물의 여러 체외 통로 후, 단계 II 박테리아가 절단 된 리포 폴리 사카 라이드의 결과로 돌이킬 수없는 염색체 삭제를 포함하는 제조 하였다 (LPS) 5. 이 균주, C. burnetii NMII는 조직 배양 모델 I, 위상 표현형 유사하고 안전한 모드를 제공한다연구진은 실험실 5 Coxiella의 발병 기전을 연구하기위한 리터. 최근 몇 년 동안 몇 가지 혁신이 빠르게 Coxiella 유전학의 분야를 전진했다. 특히, 무균 매체의 개발 (시트르산 시스테인 매체 산성화 - ACCM-2)는 모두 액체 및 고체 배지에 6,7 Coxiella의 무 세포 성장을 허용했다. 이것은 유도 유전자 발현 시스템, 셔틀 벡터 및 랜덤 트랜스포존 시스템 8-11 포함 Coxiella 가능한 유전 도구 직접 개선 결과. 가장 최근에, 대상 유전자의 불 활성화에 대한 두 가지 방법이 특정 독성 유전자 후보 (12)를 조사하기위한 방법을 포장, 개발되었다. 폐포 대 식세포에 의해 내재화 이어 Coxiella는 막 결합 구획 내에 높은 번호에 복제는 액포 (CCV)을 함유 Coxiella- 불린다. CCV는 호스트 세포 내 이입 매매 일이 필요합니다거친 초기와 후기 엔도 좀이 리소좀 유래 세포 기관 (13)에 성숙 할 때까지. 이 과정을 통해 상기 CCV 중 하나가 일시적으로 나타나거나 포함 액포와 연관되지만 Rab5, Rab7, CD63 및 LAMP-1 13-15에 한정되지 유지 숙주 요인을 취득한다. 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제는 완전한 기능 도트 / ICM 형 IVB 분비 시스템 (T4SS) 8,16,17에 전적으로 의존한다. 이 분비 시스템 ancestrally 공액 시스템과 관련된 여러 단백질 구조 및 박테리아 단백질을 제공하기 위해 모두 세균과 액포 막에 걸쳐 호스트 세포질 18에, 이펙터 불린다. Coxiella T4SS는 기능적으로 레지오넬라 뉴모 필라 (19, 20)의 잘 특징 유형 IVB 점 / ICM 분비 시스템과 매우 유사합니다. Coxiella이 리소좀 유래 산성에 도달 할 때까지 흥미롭게 T4SS 이후 이펙터 전위의 활성화가 발생하지 않는다세포 기관, 약 8 시간 게시물 감염 17,21. 현재까지 130여 점 / ICM 이펙터는 9,17,22-24를 확인되었습니다. 이 이펙터의 대부분은 가능성이 숙주 세포 내에서 Coxiella의 복제시 중요한 역할을; 단, 약간의 이펙터 기능 25-29 특성화되었다. 본 연구에서 우리는 숙주 세포의 세포질 내 β-lactamase의 활성을 통해 (이하 BLAM 기판이라 함) CCF2-AM FRET 기판 (도 1)의 절단에 의존하는 형광 기반 전위 분석을 이용한다. 관심의 유전자는 구성 적 발현을 제공하는 리포터 플라스미드에 β-lactamase를 (연기하는거야)-1 TEM 융합된다. BLAM 기판을 FRET 쌍을 형성하는 두 개의 형광 발색단 (쿠마린 및 플루오 레세 인)로 구성되어있다. 플루 오레 신 및 이펙터 전위의 부재하에 녹색 형광 발광의 FRET의 쿠마린의 여기 결과; 그러나, 만약 즐M 이펙터 융합 단백질은 호스트 세포질로 전좌하고, 얻어진 β-lactamase의 활성을 절단 여진 다음 청색 형광 방출을 생산 FRET 쌍을 분리 BLA​​M 기판의 β 락탐 고리. 이 전위 분석이 잘 C. 등 다양한 세포 내 및 세포 외 박테리아의 범위에서 이펙터 단백질을 식별하는 방식으로 입증되었다 burnetii, L. 뉴모 필라, L. longbeachae, 클라미디아 트라코마 티스, 장내 유해 E. 대장균, 살모넬라 균 및 브루셀라 17,30-35. Coxiella 이펙터 전위 특정 숙주 인자의 역할을 결정하기 위해 우리는 특히 작은 간섭 RNA의 (siRNA의), RNA 간섭으로 알려진 유전자 침묵을위한 확립 된 방법을 이용한다. 원래 예쁜 꼬마 선충에서 발견, RNA 간섭은 타고난 defe에 사용되는 보존 내생 세포 과정바이러스에 대한 NSE뿐만 아니라 유전자 조절 (36, 37). 서열 - 특이 적 siRNA를 바인딩 한 후 mRNA를 분해 특정 유전자 침묵 또는 최저 38 결과 (RNA 유도 침묵 복합체) RISC 통해 발생한다. 이 연구에서의 siRNA가 세포 내 이입 경로의 중요한 레귤레이터 두 호스트 단백질 Rab5A 및 Rab7A를 대상으로 하였다. 이펙터 전위에 Rab5A 및 Rab7A 입을의 영향 C.을 사용하여 확인 하였다 burnetii pBlaM-CBU0077. 것은 이미 Coxiella 17 도트 / ICM 분비 시스템 전좌 것으로 나타났다 CBU0077로 선택 하였다. siRNA의 유전자 사일런 여기 기재된 fluorescencebased 전위 분석 양쪽을 이용하여 우리는 Coxiella 이펙터 단백질의 전위에 숙주 인자의 역할을 설정하기 시작한다. 이 방법은 유사한 secretio 소유 모두 세포 내 및 세포 외 박테리아의 넓은 범위에 적용될 수있다이펙터 단백질의 전위에 대한 책임 N 시스템.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Iron sulfate</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto-neopeptone</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl beta cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>For bacterial culture</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>Non-targeting control</td></tr><tr><td>siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Causes cell death; measure of transfection efficiency</td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA buffer</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>For transfection</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Reduced-serum medium used for transfection</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>For cell culture and infection</td></tr><tr><td>Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Can use alternate equivalent product</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>For storage of Coxiella strain</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>For dilution of samples and standards for qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>Probenicid solution component</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Probenicid solution component</td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen orthophosphate</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Probenicid solution component</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Probenicid solution component</td></tr><tr><td>DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Fixing solution for HeLa 229 cells</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask with vented cap</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>For growth of bacterial strain</td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask with vented cap</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>For growth of HeLa 229 cells</td></tr><tr><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture flask with vented cap</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>For growth of HeLa 229 cells</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td></td><td></td><td>For quantification of HeLa 229 cells</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>For qPCR reaction</td></tr><tr><td>8-Lid chain, flat</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>For qPCR reaction</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench top microfuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench top vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>For pelleting bacterial culture</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>For gDNA quantification</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR machine</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td></tr><tr><td>ClarioSTAR microplate reader</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>For measurement of fluorescence</td></tr></tbody></table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii의, Q 발열의 원인 물질은 복제 성 틈새를 확립 타입 IV 도트 / ICM 분비 시스템에 의존하여 세포 내 병원체이다. 이펙터의 코호트는 호스트 프로세스를 조작 및 복제에 대한 고유 리소좀 유래 액포의 확립을 허용하는 숙주 세포에 본 시스템을 통해 전좌된다. 특정 유전자의 siRNA를 이용하여 침묵과 β-lactamase의 활성에 의존하는 FRET 기반의 기판을 사용하여 이펙터 전위 측정 : 여기에 제시된 방법은 두 개의 잘 확립 된 기술의 조합을 포함한다. 이 두 접근 방법의 적용, 우리는 박테리아 분비 시스템 기능 및 이펙터 전위에서 호스트 인자의 역할을 이해하기 시작할 수있다. 이 연구에서 우리는 Rab5A과 Rab7A, 모두 세포 내 이입 인신 매매 경로의 중요한 규제 기관의 역할을 조사했다. 우리는 이펙터 translocatio의 감소 중 단백질 결과의 발현을 침묵 입증N 효율. 이러한 방법은 또한 쉽게 분비 시스템을 이용하는 다른 세포 및 세포 외 병원체를 조사하도록 변형 될 수있다. 이러한 방식으로, 세균 이펙터 전위에 관련된 호스트 요인 글로벌 영상이 드러날 수있다.

이 연구를 들면, C. CBU0077 이전 Coxiella 도트 / ICM 분비 시스템 (17)의 전좌 이펙터로 도시 된 바와 같이 burnetii pBlaM-CBU0077 균주를 선택 하였다. 앞서 감염, 칠일 C.의 게놈 / ㎖의 총 개수 burnetii pBlaM-CBU0077 배양 물을 사용 qPCR에 열거 하였다. (4)는 순환 액의 예를 보여주는 도표 (TR) 값은 다음의 두 qPCR에 표준 샘플 예상. 4.3.3에 설명 된대로 (증폭 플롯 (그림 4B)과 수치 (그림 4C)에 그래픽으로 표시) 중부 표준시 값은 수출 및 분석 하였다. 도시 대표 데이터에 기초하여, 10 mL로 재현 탁 세균 배양 (도 4d)에서 2.31 ​​× 108 게놈 / ㎖가 있었다. 해당 박테리아 희석을 생성하려면 (1.88 × 10 8 유전체 / ㎖ 전n은 2 ㎖)에 재현 탁 박테리아 1.63 ml의 신선한 예열 DMEM + 10 % FCS 370 μl를 첨가 하였다. siRNA를 형질 역방향이어서, 세포에 감염되었다 C. 24 시간 동안 (300)의 MOI에서 burnetii pBlaM-CBU0077. 역방향의 배양 후 이펙터 전좌 BLAM 기판 정량화로 형질 감염된 세포를 형광 플레이트 판독기를 사용하여 결정될 수있다. 7에 기재된 분석에 따라, 비감염 된 OTP로 정규화 된 모든 비율 값 감염된 OTP로 정규화 될 수있다. 숙주 유전자의 침묵 후 이펙터 전위 레벨은 감염된 OTP 제어에 비해 후 3 결과들로 그룹화 될 수있다 : (1) 변화 없음; (2) 이펙터 전위를 증가; (3) 이펙터 전위를 감소. 이후 통계적 분석, 예를 들면 학생의 t 테스트를 위해, 모든 관찰 차분 t의 중요성을 결정하기 위해 사용될 수있다O OTP 제어 감염. 3 개의 독립적 인 실험에서 이펙터 전위에 Rab5A 또는 Rab7A를 침묵의 결과는도 5a에 도시되어있다. 연기하는거야 - CBU0077 전위의 수준에서 유의 한 감소는 OTP 제어 (p 값 = 0.0088 (Rab5A)과 p 값 = 0.0059 (Rab7A), 쌍, 학생 t 테스트)에 비해 Rab5A 및 Rab7A 모두의 침묵하는 동안 오류가 발생했습니다. 세포 생존 능력에 대한 siRNA의 처리에의 영향은 또한 설립되었다. 전좌 분석 후, 세포를 고정 하였다 핵 얼룩 염색 및 이후 정량. OTP 제어 (12 % 및 31 %, 각각)에 비하여 세포 생존율의 감소 Rab5A 또는 Rab7A 결과 중 치료가이 감소 PLK1 (97 %), 공지 된 유전자만큼 심각하지 않지만,도 5c에 도시 된 바와 같이 세포 사멸 원인 (p- 값 = 0.0102 (Rab5A를) p- 값 = 0.0081 (Rab7A), p- 값 &lt;0.0001 (PLK1), 쌍, 학생 t 테스트). GE의 호스트의 입을 어떻게 이러한 결과는 보여된 siRNA를 이용 NES 부정적인 세균 이펙터 전위의 레벨을 변경할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig1.jpg" /> 그림 1. 감염하는 동안 연기하는거야 기판의 행동의 메커니즘. C. burnetii는 숙주 세포에 의해 내재화 및 리소좀 유래 공포가 Coxiella 함유 공포로 명명 형성한다. 24 시간 후 감염, 세포는 β-lactamase를 즉, 연기하는거야 - CBU0077 이펙터없이 전위, 쿠마린의 여기에서이없는 경우. FRET 쌍 (A)를 형성하는 두 형광을 보유하고 막 투과성 연기하는거야 기판과로드 녹색 형광 신호 (520 ㎚) (B)로서 관찰 형광에 FRET 410 nm의 결과. 기능적 도트 / ICM 분비 시스템의 경우에서, BLAM-CBU0077 융합 단백질은 숙주 세포에 전좌되며 카스티 것두 염료의 분리를 야기하고 FRET 중단하고 410 nm의 (C)에서 여진 후 푸른 형광 신호 (450 ㎚)의 결과, β-lactamase의 활성을 통해 상기 BLAM 기판 처마. 모두 녹색 및 청색 형광 신호가 될 수있다 형광 플레이트 리더를 이용하여 검출. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig2.jpg" /> . 그림 2. 역 형질과 전좌 분석 워크 플로우의 도식 개요 주 1 : C. 준비 burnetii pBlaM-CBU0077 문화 4 일 :. 96 웰 트레이에 / 웰 3.92 × 10 3 세포의 최종 밀도로 40 nM의 siRNA의 종자 헬라 229 세포를 이용하여 역 트랜 5 일 :. 장플랜지 미디어 7 일 :. C의 전체 게놈 / ㎖를 정량화 burnetii pBlaM-CBU0077 문화 qPCR에를 사용하여 이후 300 일 (8)의 MOI와 역 형질 전환 세포를 감염 :., 6 배 로딩 염료를 추가 형광을 측정하고 세포 수를 정량화 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig3.jpg" /> 그림 3. 역 형질과 헬라 229 세포의 시드를 설정하는 데 사용되는 96 웰 플레이트 레이아웃. (빨간색으로 표시)은 &quot;빈&quot;우물 미디어 만 포함하고 siRNA의 또는 헬라 229 세포 중 하나를 추가 할 필요가 없습니다. 이에 최적화 된 이후 OTP의 siRNA (감염되지 않은 우물과 감염된 우물 어두운 청색 빛 파란색으로 표시)을, 비 대상 제어로 사용적은 오프 대상 효과가있다. 적갈색과 녹색 우물은 각각 Rab5A 및 Rab7A의 siRNA를 나타냅니다. PLK1 표현의 손실이 세포주의 대부분의 프로 - 세포 사멸 경로 및 광범위한 세포 사멸을 유도 할 수있는 (노란색으로 표시) PLK1의 siRNA가 형질 전환 효율의 척도로 사용된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig4.jpg" /> 그림 4. 대표 qPCR에 코네티컷 값은 C에서 게놈 / ㎖의 총 수를 정량하는 데 사용 burnetii pBlaM-CBU0077 문화. (A) Coxiella 배양 게놈 / ㎖의 번호를 열거 할 qPCR에에 사용되는 사이클 조건. 표준 및 샘플들 모두 가능한, CT 값은 그래프 (B)와 숫자 (C)로 표현되는형식. (D) 표준 코네티컷 값, 평균 그래프와 로그 추세선이 계산되었다. 식 샘플의 평균을 사용 코네티컷 C.의 게놈 / ㎖의 총 개수 값 burnetii pBlaM-CBU0077 문화 × 10 8 2.31로 측정되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig5.jpg" /> siRNA를 Rab5A의 음소거 및 Rab7A. 헬라 229 셀 동안 도트 / ICM 이펙터 연기하는거야 - CBU0077 그림 5. 전좌는 역 Rab5A 고유의 siRNA (적갈색 바), Rab7A (녹색 막대), OTP (파란색 막대) 또는 PLK1로 형질 감염시켰다 (노란색 막대가)와 C. 감염 전에 72 시간 동안 배양 24 시간 동안 (300)의 MOI에서 burnetii pBlaM-CBU0077 변형. t 후그 BLAM 기판의 첨가는 형광 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 측정 하였다 (A)을 테이블 450과 함께 하나의 실험에서 얻은 원료 형광 값 보여. 블랭크 값을 공제 한 후 비감염 OTP 제어에 520 nm의 비율 상대 (미디어 단지, 아니 셀). 전위 (B)와 세포 생존율 (C)의 레벨이 백분율로 표현되는 세 개의 독립적 인 실험에서 OTP 역 형질 감염된 세포 ± 표준 편차 상대적인 의미한다. * p- 값 &lt;0.05; ** p 값이 &lt;0.01; **** p 값이 &lt;0.0001 (쌍, 학생 t의 -test). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 집중 </str옹&gt; </td></tr><tr><td> 구연산 </td><td> 13.4 밀리미터 </td></tr><tr><td> 구연산 나트륨 </td><td> 16.1 밀리미터 </td></tr><tr><td> 인산 칼륨 </td><td> 3.67 밀리미터 </td></tr><tr><td> 마그네슘 클로라이드 </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> 0.02 밀리미터 </td></tr><tr><td> 황산 철 </td><td> 0.01 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 125.4 밀리미터 </td></tr><tr><td> L 시스테인 </td><td> 1.5 밀리미터 </td></tr><tr><td> neopeptone </td><td> 0.1 g / L </td></tr><tr><td> 카사 미노산 </td><td> 2.5 g / L </td></tr><tr><td> 메틸 베타 사이클로 덱스트린 </td><td> 1g / L </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> 125 ㎖ / L </td></tr></tbody></table> 표 1. 구성 요소 필수 1 배 ACCM-2를 확인합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td colspan="4"> 목표 농도 </td></tr><tr><td></td><td> 1μM </td><td> 5 μM </td><td> 10μM </td><td> 20 ㎛ </td></tr><tr><td> 두더지 시작 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 nmol의 </td><td> 1 ml의 </td><td> 200 μL </td><td> 100 μL </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> 2 nmol의 </td><td> 2 ml의 </td><td> 400 μL </td><td> 200 μL </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> 5 nmol의 </td><td> 5 ml의 </td><td> 1 ml의 </td><td> 500 μL </td><td> 250 μL </td></tr><tr><td> 10 nmol의 </td><td> 10 ml의 </td><td> 2 ml의 </td><td> 1 ml의 </td><td> 500 μL </td></tr><tr><td> 20 nmol의 </td><td> 20 ㎖ </td><td> 4 ml의 </td><td> 2 ml의 </td><td> 1 ml의 </td></tr></tboDY&gt; </table> 적절한 농도로 하이 드레이팅 동결 건조 된 siRNA에 필요한 1 배의 siRNA 버퍼의 표 2 권.

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Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

10.6K 조회수.  University of Melbourne.  세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 

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Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

연구

생화학

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately 20 nm to accommodate large tRNA substrates at the A-, P- and E-sites. Consequently, the ribosome dynamics are naturally de-phased quickly. Single molecule method can detect each ribosome separately and distinguish inhomogeneous populations, which is essential to reveal the complicated mechanisms of multi-component systems. We report the details of a smFRET method based on the Nikon Ti2 inverted microscope to probe the ribosome dynamics between the ribosomal protein L27 and tRNAs. The L27 is labeled at its unique Cys 53 position and reconstituted into a ribosome that is engineered to lack L27. The tRNA is labeled at its elbow region. As the tRNA moves to different locations inside the ribosome during the elongation cycle, such as pre- and post- translocation, the FRET efficiencies and dynamics exhibit differences, which have suggested multiple subpopulations. These subpopulations are not detectable by ensemble methods. The TIRF-based smFRET microscope is built on a manual or motorized inverted microscope, with home-built laser illumination. The ribosome samples are purified by ultracentrifugation, loaded into a home-built multi-channel sample cell and then illuminated via an evanescent laser field. The reflection laser spot can be used to achieve feedback control of perfect focus. The fluorescence signals are separated by a motorized filter-turret and collected by two digital CMOS cameras. The intensities are retrieved via the NIS-Elements software.

Single molecule fluorescence energy transfer is a method that tracks the tRNA dynamics during ribosomal protein synthesis. By tracking individual ribosomes, inhomogeneous populations are identified, which shed light on mechanisms. This method can be used to track biological conformational changes in general to reveal dynamic-function relationships in many other complexed biosystems. Single molecule methods can observe non-rate limiting steps and low-populated key intermediates, which are not accessible by conventional ensemble methods due to the average effect.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

면역학 및 감염병학

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes such as development are affected. The Caenorhabditis elegans germline is a great model system for studying PPIs that are related to the regulation of stem cells, meiosis, and development. There are a variety of well-developed techniques that allow proteins of interest to be tagged for recognition by standard antibodies, making this system advantageous for proximity ligation assay (PLA) reactions. As a result, the PLA is able to show where PPIs occur in a spatial and temporal manner in germlines more effectively than alternative approaches. Described here is a protocol for the application and quantification of this technology to probe PPIs in the C. elegans germline.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates use of the proximity ligation assay to probe for protein-protein interactions in situ in the C. elegans germline.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

발생학

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

생물학

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

생체공학

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

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