The authors thank members of the Valdez laboratory for intellectual input on experiments and comments on the manuscript.

כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH ופרוטוקולי חיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית וירג&#39;יניה טק ושימוש. 1. בעלי חיים הכנות לקראת ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בתערובת של קטמין (90 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי עם מזרק אינסולין סטרילי 1 מ&quot;ל. הפתרון המוביל מכיל תערובת של מי מלח 0.9%, 17.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין, ו xylazine 2.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מניחי חיות בחזרה אל תוך כלובים בזמן המתנת תרופות ייכנסו לתוקף. הערה: אם מינון העמסה אינו מספק הרדמה מספיק למשך ההליך, תוספת 25% של מינון העמסה ניתן להזריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיות צג לפרסם הזרקה כדי לבדוק מחירי נשימה יציבים ודיכאון מתאים של רמות עוררות. בדוק את הרמה עוררת עם קמצוץ רגל אחורי, שאמורה לעורר שום תגובה כאשר הרדימו מספיק. הערה: זה בדרך כלל לוקח 3-5דקות עבור עכבר בוגרים צעירים עם ממוצע של 25 עד 30 גרם. אם החיה עדיין תגובה לאחר 10 דקות לאחר ההזרקה, 25% נוספים של מינון העמסה הרדמה ניתן להזריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל וזלין ו משחת עיניים שמן מינרלי אור העיניים של החיה כדי למנוע יובש. הסר חיות מהכלוב ומניחים על משטח נקי וישר. לגלח את הגפיים האחוריים הרצויים מרגל אגן באמצעות גוזם שיער חשמלי, החשיפה בצד הלטרלי רק של האיבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח מסיר שיער כימי לאתר המגולח דקות 1. הסרה ידנית של השיער באמצעות מגבוני מעבדה. לנקות את האזור עם מעבדה מקולף לנגב טבול אתנול. </li></ol> 2. הליך כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירי ניתוח באמצעות חיטוי או שיטה מתאימה אחרת. נקו את האתר כירורגית ולוח כירורגית עם 80% אתנול / H 2 0. לחטא את האתר כירורגית עם proviodine. יש לשים את הסמן על הלוח כירורגית וליישר עם ריסון איבר. לִשְׁמוֹרהגפה האחורית היעד במצב טבעי אנטומית עם מפרק הברך קצת מורחבת ללא סיבוב פנימי או חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חיה ולוח תחת מיקרוסקופ כירורגי. אוריינט לאתר החתך הסדיר דרך מישוש של ציוני דרך שטחיים, מפרק הברך הגרמי במיוחד ואת הרכס בין קדמי tibialis ואת השרירים הגסטרוקנמיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך כ 3 ס&quot;מ דרך העור באמצעות מספריים או אזמל באביב תוך שימוש מלקחיים כללי עבור מרתק. הפוך את החתך בניצב כמובן שבבסיס של העצב שׁוֹקִיתִי המשותף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך החתך דרך fascia השטחית, חשיפת femoris שרירי vastus lateralis שרירים. הפרד את השרירים האלה על ידי חיתוך דרך fascia החיבור העמוק. חתך 1-2 ס&quot;מ צריך להספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בו שריר הירך הדו-ראשי caudally באמצעות כתיבה מכאנית, חושף את העצבים שׁוֹקִיתִי המשותפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקבות העצב proximally עד היתר שלהקטע עם גיד של הראש הלטרלי של שריר הסובך נמצא. הערה: זמן חשיפה עשויה לדרוש מניפולציה נוספת של העור והשרירים חזר בו. בצומת זה משמשת ציון הדרך היציבה עבור הפגיעה העצבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוז העצב עם מלקחיים בסדר, יישור הטיפים באופן מקביל לגבול הלטרלי של הגיד הגסטרוקנמיוס. למחוץ עצב שׁוֹקִיתִי המשותף על ידי הפעלת לחץ יציב, קשה במשך 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשש למעוך מלא של העצב על ידי בדיקה ויזואלית דרך הטלסקופ כירורגית. היא תופיע שקופה באתר של פציעה. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, את הקרינה תיעלם מן האתר של פציעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כתיבה ויישר מחדש השרירים בעמדות האנטומי שלהם. לסגור את האתר חתך עם 6-0 תפרים משי. 1-3 תפרים קטע פשוט מספיק. מניחי מחל עכבר על כרית חימום בכלוב נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניטור כל החיות עבור 2 שעות שלאחר-אופרהtion לבדוק לנשימה וכל תופעות לוואי ההרדמה. נהל מנה ראשונית של עצירות 0.05-0.10 מ&quot;ג / ק&quot;ג באמצעות זריקה תת עורית מפשעתי מיד לאחר ההתאוששות מהניתוח. תן 3 מנות נוספות כל 12 שעות במשך 48 השעות הקרובות. לאחר החלמה מלאה, לחזור עכברים למתקן הטיפול בבעלי החיים. </li></ol> 3. בידוד מכתים של פושטי digitorum Longus (אדי) שרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב חיות באמצעות isoflurane. לוותר 0.5 מ&quot;ל isoflurane נוזל לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל ארוז עם labwipes סופג. מניח את הצינור הסגור והפתוח עם החיה בתא 3 אטום 2,500 סנטימטר. לפחות 4 דקות של חשיפה מספיקה. מבחן עבור אובדן palpebral הבילטרליים, הבוהן קמצוץ, ורפלקסים זנב-קורט כדי להבטיח שכל סוס הוא מחוסר הכרה לפני שתמשיך עם זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transcardially perfuse 16 בעלי החיים הראשונים עם 10 מ&quot;ל 0.1M PBS, אז 25 מ&quot;ל של paraformaldehyde 4% ב 0.1M PBS (pH 7.4). הפרין (30 יחידות / 20g משקל חיה) ניתן להוסיף עם PBS (10 יחידות / מיליליטר) כדי למנוע קרישת דם במיטות נימים קטנות, שיפור תוצאות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את עור מכסה גפיים אחוריים באמצעות מספריים לחתוך transversally דרך העור סביב ההיקף של הבטן. מקלפים את העור בעבר הגפיים והרגליים האחוריות באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר fascia השטחית של גפיים אחוריים ידי אחיזה ומתקלף עם מלקחיים. אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה, שלאחר לתקן עכברים כל לילה PFA 4% 50 מ&quot;ל צינורות. לשטוף שלוש פעמים עם PBS. הערה: עכברים קבועים ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס. אם לא, דלג על שלב זה והמשך לשלב 3.6 בלי חיות שלאחר התיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את שרירים אדי 18 מ גפיים אחוריים עכבר, ויש להקפיד לשמור הפרוקסימלי וגידים דיסטלי המלאה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שרירי אדי בחסימת המאגר (PBS 1x המכיל 0.5% Triton X-100, 3% BSA ו -5% נסיוב עז) לפחות 1 שעה. </li><li&gt; כדי להמחיש אקסונים מוטוריים מסופי העצב שלהם, שרירי מקום צינורות המכילים neurofilament (1: 1,000) ו synaptotagmin-2 (1: 250) נוגדנים מדוללים חסימת חיץ במשך 3 ימים. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. הערה: דלג על שלב זה אם באמצעות עכברים לבטא חלבונים הקרינה (XFP) אקסונים הפריפריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם הנגדי ללא פגע אד כביקורת חיובית עבור עצבוב NMJ מלא. בקרות שליליות צריכות לכלול אד שהושג ב 4 ימים שלאחר פציעה, נקודת זמן שבו NMJ הוא denervated לחלוטין, כמו גם אד מוכתם נוגדנים משני בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שרירית עם נוגדנים משני מתאימים מתויגים fluorescently כדי לזהות neurofilament ו synaptotagmin-2 עבור 1 יום. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. הערה: שלב זה יכול להתבצע ביחד עם צעד 3.10. דלג על שלב זה אם באמצעות עכברים לבטא חלבוני קרינת אקסונים פריפריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את postsyבאזור naptic של NMJ, דגירה שרירי עם 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Alexa-555-bungarotoxin אלפא מצומדות מדולל חסימת חיץ לפחות 2 שעות. לשטוף שרירים שלוש פעמים עם 1X PBS ו 10 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הר השרירים כולה בשקופיות זכוכית בעלי מטען חשמלי חיובי, למקם את השריר ישירות בשקופית, להוסיף כמה טיפות של גליצרול מבוסס הרכבה בינונית בשקופית ומכסים coverslip. לחץ על coverslip נגד השקופיות כדי לשטח את השריר. משרים את התקשורת הרכבה מההיקף של מגבונים במעבדה באמצעות שקופיות coverslip. החל לק כדי לאטום את הקצוות בין coverslip והחלק. </li></ol> 4. הדמיה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את המבנה של NMJs, תמונה השריר אדי באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal מצויד להלהיב 488, 555 ו 633 ננומטר אור וללכוד את האור הנפלט עם 20X ו 40X מטרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש כולו NMJs, ליצור תמונות הקרנת העוצמה המקסימלית של שניות אופטימשא במרווחי 1 עד 2 מיקרומטר בנפרד משתרעת הנמוכה ביותר לאזורים גלויים הגבוה ביותר של NMJ. צור תחזיות בעצמה מקסימלית באמצעות תוכנת הדמיה זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע שיעורי reinnervation, לסווג NMJs כמו: 1) לחלוטין denervated = האתר postsynaptic הוא לגמרי נטול קשר עם האקסון, פחות מ -5% colocalization בין האקסון AChRs. 2) חלקית מעוצבבים = האקסון חלקית חופף postsynapse, 5-95% colocalization בין האקסון AChRs. 3) עצבוב מלא = כמעט פרד המושלם בין-סינפסה פוסט טרום, יותר מ 95% colocalization בין האקסון AChRs. אל תכלול NMJs העומד בניצב למישור ההדמיה או אינם מדמיינים מלא בתמונה. הערה: כל הניסויים האלה, לפחות 3 חיות ו -50 NMJs לכל חיה נבדקו. תוצאות נחשבו משמעותיות באמצעות סטודנט מבחן t עם ערך P של פחות מ 0.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעוור המפעיל, אנשים נפרדים יכולים לבצעניתוח הניתוח ותמונה. ללא ידע של קבוצות הטיפול, הנתח יכול להיות אובייקטיבי עם ניקוד NMJ. לחלופין, תמונות יכולות להיות אקראיות והציגו למפעיל לניתוח ללא ידיעת בעלי חי המקור. </li></ol> 5. PCR כמותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב חיות באמצעות isoflurane נקע בצוואר הרחם. סר עור fascia השטחית מכסה שרירי רגליים על פי צעד 3.3. לנתח הקדמי tibialis ואת השרירים אדי פי לשלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא את קדמי tibialis כולו ושרירי אדי צינור 1.5 מיליליטר על חנקן נוזלי. הסרה של רקמה מהצינור ומקום במכתש מראש צונן שקוע חלקית בחנקן נוזלי. טוחני שריר קפוא לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסי אבקת שריר קפוא לתוך מגיב מיצוי RNA זמין מסחרי ולבצע מיצוי RNA וסרת הדנ&quot;א הגנומי עם ערכה זמינה מסחרי על פי i של היצרןnstructions. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שעתוק לאחור עם שילוב transcriptase הפוך זמין מסחרי על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע qPCR באמצעות ערכה זמינה מסחרי באמצעות גני משק מתאימים (ראה טבלה של חומרים). השתמש Cycler תרמית PCR כמוני זמינה מסחרי לבצע PCR (ראה טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישול בטמפרטורת גדר ל -58 מעלות צלזיוס. להתאים את הפרמטרים אופניים נוספים למפרט של יצרן של תערובת ירוקה פולימראז תקי / SYBR. כלול צעד עקום להמס סופי בתכנית Cycler תרמית מורכבת 0.5 ° C מגביר מצטבר מ -65 ° C עד 95 ° C כדי לבדוק סגולי פריימר פריימר היווצרות dimer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת רמות ביטוי mRNA ביחס ידי 2 - שיטת ΔΔCT 21 באמצעות 18S RNA כמו גן השליטה. </li></ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Front. Neurosci. 8, 252 (2014).</li><li>Apel, P. J., Alton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+age+impairs+the+response+of+the+neuromuscular+junction+to+nerve+transection+and+repair:+An+experimental+study+in+rats.">How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats.</a> J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).</li><li>Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+neuromuscular+innervation.">Age-related changes in neuromuscular innervation.</a> Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).</li><li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles.">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PloS one. 7 (4), e34640 (2012).</li><li>Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-existing+pathways+promote+precise+projection+patterns.">Pre-existing pathways promote precise projection patterns.</a> Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).</li><li>K&#252;ry, P., Stoll, G., M&#252;ller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+cellular+interactions+in+peripheral+nerve+regeneration.">Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration.</a> Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).</li><li>Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration:+gaining+perspective+on+inflammatory+events+after+peripheral+nerve+injury.">Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury.</a> J Neuroinflammation. 8, 110 (2011).</li><li>Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+Wallerian+degeneration+and+axonal+regeneration+after+peripheral+nerve+injury.">Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).</li><li>Chen, Z. -. L., Yu, W. -. M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+regeneration.">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sciatic+nerve+injury+model+in+pre-clinical+research.">The sciatic nerve injury model in pre-clinical research.</a> J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).</li><li>Batt, J. A. E., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tibial+nerve+transection+-+a+standardized+model+for+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice.">Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> J. Vis. Exp. (81), e50657 (2013).</li><li>Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+nerve+injury:+a+simple+and+subtle+model+for+investigating+many+aspects+of+nervous+system+damage+and+recovery.">Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery.</a> J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).</li><li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals.">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Bowen, D. C., Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+regulation+of+MuSK+at+the+neuromuscular+junction.">Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction.</a> Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).</li><li>Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+deficiency+is+associated+with+an+increase+in+number+of+total+axons+and+motor+axons+innervating+mouse+tibialis+anterior+muscle.">Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle.</a> Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה המוצגת בכתב היד הזה מספקת הזדמנויות ייחודיות לזהות מנגנונים המעורבים בתיקון צמתים תוקפות (NMJ). שיטה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל גיד הגסטרוקנמיוס ליד הברך. אנו מראים כי רק אחרי 5 שניות של לחץ בעצבים עם מלקחיים, ניוון מוחלט יצוין ב -4 ימים לאחר פציעה. בעכברים בוגרים צעירים, אלפא-מנוע אקסונים מתחילים reinnervate אתרי הסינפטי קודמים השריר פושט אצבעות הארוכות (EDL) ב -7 ימים שלאחר פציעה, ששיאה היה הרפורמציה של אתרי presynaptic שאינם נבדלים מאלו עכברים וללא כל פגע ב -12 ימים. בנוסף, אנו מראים כי רמות של מולקולות הקשורות NMJ בחר לתאם בשיתוף פעולה הדוק עם מעמד העצבוב של NMJ. חשוב לציין, שינויים תאיים ומולקולריים אלה הם מאוד לשחזור בין בעלי חיים מאותו המין והגיל (איור 5 א-ב), מתן הזדמנויות לזהות tesגורמי t הפועלים לתקן את NMJ. במונחים של הליכים כירורגיים, סניף העצב המשותף שׁוֹקִיתִי נגיש מאוד כפי שהוא עובר על הגיד הגסטרוקנמיוס, מחייב חתך קטן בלבד שתוצאתו ניזק מועט שרירים בכלי דם שמסביב. ישנם מספר היתרונות של שימוש העצב שׁוֹקִיתִי הנהוג לבחון שינויים תאיים ומולקולריים הקשורים NMJs התחדשות. גיד הגסטרוקנמיוס משמש ציון דרך אנטומי יציב לפגוע העצב שׁוֹקִיתִי המשותף עקבי באותו מיקום ומרחק משרירי היעד. זה מאפשר להשוות את שיעור ההתחדשות של אקסונים reinnervation של שרירים באופן מהימן בין בעלי חיים מאותו המין והגיל. השלבים הקריטיים להצלחה מעין אלה כוללים הבטחת שהאתר הפגיע עקבי בין ניתוחים, למעוך עצב מלא מתקבל בכל בעל חיים, ופגיעה מינימאלית מתמשכת למבנים סמוכים. בין השרירים מעוצבבים על ידי גommon עצב שׁוֹקִיתִי, הקדמי tibialis (ת&quot;א) ו longus digitorum פושטי (EDL) השרירים הם מטרות מצוינות להערכת תיקון NMJ. שני שרירים אלה מורכבים בעיקר של סיבי שריר מסוג מהר כי הם מושפעים באופן חמור פציעה, הזדקנות ומחלות 5. לניתוח NMJ, שריר אדי הוא אטרקטיבי במיוחד, שכן הוא יכול להיות שלם רכוב לתדמית כל NMJs ללא עיוותים. זה גם עושה את זה אפשרי לתאם שינויים ב NMJs בשינויים במקומות אחרים סיבי שריר, אקסונים מוטוריים סביב התאים. שרירי TA ו אדי נעשו שימוש נרחב על מנת להעריך את ההשפעה של התערבויות מולקולריות אורח חיים שונים על שריר ותיקון NMJ בגלל המיקום האנטומי שלהם 20. עם זאת, denervation לטווח ארוך משנה הביטוי של גנים עם פונקציה קריטית מנוונת סיבי שריר, תאי מערכת החיסון הפעיל ותאי לווין 12-14, מה שהופך אותו קשה יותר להעריך ch תאית ומולקולריתanges שעשוי לסייע בקידום התחדשות של NMJs במיוחד. בשיטה המתוארת כאן העצב שׁוֹקִיתִי נרמס בסמיכות השרירים TA ו אדי, המאפשר החוצפה להגיע אליהם בתוך 7 ימים לאחר למעוך בעכברים בוגרים צעירים. לכן, שיטה זו צריכה להקטין את איבוד מסת שריר שינויים מולקולריים הקשורים מנוון סיבי שריר בשרירי ת&quot;א ואת האד. הפרוטוקול למחוץ העצב שׁוֹקִיתִי ניתן לשנות באופנת ברורים מרובה. פגיעה עצבית לחתוך ניתן להחליף בקלות עבור למעוך, המאפשרת הדמיה בזמן אמת in vivo טובה יותר של התחדשות עצבים היקפית. חתך מסיר חומר האקסון מת כמכשול לצמיחה מחודשת ומבטיח נזק הומוגנית של כל האקסון בתוך הצינור endoneurial. כאשר ביצעו כראוי הדוחק עצב שׁוֹקִיתִי יש כמה סיבוכים הקשורים. בעיה אחת שעלולה להיות נתקל היא כישלון של החוצפה reinnervate מטרות NMJ מקוריות. זה יכול להיגרם על ידי ACCidental לחתוך פגיעה העצב במהלך הניתוח. הקפד לבדוק את הקנס שקצו מלקחי ריסוק לכל קצוות חדים. אם בשלב כלשהו במהלך ניתוח איכות דלוקה עצב מוטל בספק, ניתן להרחיב את החתך המקורי כדי להמחיש את העצב טוב יותר. אמנם זה מגדיל את גודל הפצע יכול לגרום נזק לרקמות נוספות, זה יכול לעזור בזיהוי עצב שׁוֹקִיתִי נכונה הבחינה האם או לא דלוקה מלאה הושגה. הטכניקה המתוארת כאן עושה להחזיק מספר מגבלות. ראשית, כדאי בעיקר בעכברים בוגרים כמו מבני החיות האלה הם גדולים מספיק כדי לתמרן. יילוד ועכברים המתבגר הם הרבה יותר קטנים, הגדלת הקושי של הניתוח באופן משמעותי. שנית, העצב שׁוֹקִיתִי מכיל אקסונים החושי והמוטורי, וכתוצאה מכך denervation של רקמות היעד שעשויים להשפיע שיעורי התחדשות NMJ. NMJ מוכרת כאתר מוקד של פתולוגיה amyotrophic latטרשת eral (ALS) והזדקנות. כמו כן, יש צורך לתקן בעקבות פציעה בעצבים היקפיים להימנע מלסכן את מוטוריקה ואיבוד מסת שריר. השיטה למחוץ העצב שׁוֹקִיתִי צריכה לסייע בזיהוי ובדיקה של מולקולות עם תפקידים חשובים תיקון NMJ. בגישה אחת, שיטה זו יכולה לשמש לפרופיל mRNA ו microRNA עם תפקידי מפתח בשלבים שונים של התחדשות NMJ באמצעות ניתוח רצף RNA. זה יכול להיות מיושם גם כדי לקבוע את הפונקציה של גני מועמדי סלקטיבי הציגו ויימחקו שרירים. בנוסף, שיטה זו מלווה את עצמה היטב בדיקת היכולת של מולקולות אקסוגניים כדי להאיץ התחדשות עצב NMJ באמצעות הדמיה סטטי חי.

In young adult and healthy animals, the neuromuscular junction (NMJ) is a highly stable connection between the presynapse, the nerve ending of an &#945;-motor axon, and the postsynapse, the specialized region of an extrafusal muscle fiber where nicotinic acetylcholine receptors (AChRs) selectively aggregate1. The nearly perfect apposition of the pre- and post-synaptic apparatuses is necessary for proper neurotransmission, survival of &#945;-motor neurons and muscle fibers and motor function. Unfortunately, the function of the NMJ is adversely affected by aging, diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), autoimmune diseases and injury to muscles and peripheral nerves2-5. These insults often result in degeneration of presynaptic nerve endings, leaving muscles denervated and significantly altering motor skills. For this reason, the identification of molecules that function to maintain and repair the NMJ has become a priority. Because peripheral nerves regenerate and reinnervate targets, peripheral nerve injury models have been used to identify molecular changes associated with regenerating NMJs. 
Peripheral nerve injury models often involve either completely cutting or crushing specific nerve branches6. Following a cut, the endoneurial tube has to be reformed, delaying axonal regeneration and reinnervation of target cells and tissues. The severity of this type of injury also causes axons to meander away from their original path, resulting in their failure to reach original targets. This is in contrast to nerves injured via crush where the endoneurium remains contiguous, providing a path for efficient and proper regrowth of regenerating axons. It also allows axons to find and reinnervate their original muscle fiber partners. Irrespective of injury model, there are a number of cellular and molecular changes that must occur for axons to regenerate and reinnervate targets. After an injury, the nerve segment proximal to the target is broken down and removed via a process termed Wallerian Degeneration7. This process involves reprogramming and de-differentiation of Schwann cells into non-myelinating cells that secrete regenerative factors, clear myelin, and recruit macrophages to the site of injury8. Macrophages in turn complete the clearance of myelin and axonal debris, which would otherwise impede growth of the regenerating axon9. In parallel, motor and sensory neurons activate mechanisms needed to promote regeneration of their severed axons. Once the regenerating axon reaches the target, it must transform from a growth cone to a nerve ending capable of properly transmitting (for motor axons) or receiving (for sensory axons) information10. In this regard, alpha-motor axons undergo a series of well-orchestrated changes that culminate in their growth cone differentiating into a fully functional presynaptic nerve ending that nearly perfectly opposes the post-synaptic site on the target muscle fiber11. 
The sciatic, tibial and accessory nerves have been the primary choices for studying axonal and NMJ regeneration12-14. However, there are a number of drawbacks when using these models to examine cellular and molecular changes associated with regenerating NMJs between animals and under different conditions. Firstly, the sciatic nerve supplies the majority of the muscles of the hind limb, with injury significantly limiting both movement and sensation. It is therefore not possible to use this method to study the impact of exercise alone or in combination with other factors. Additionally, the sciatic nerve is a rather thick structure and thus requires a large amount of compressive force to fully injure all axons. This in turn may result in complete transection of the more superficial axons while leaving the endoneurial tube of deeper lying axons intact, introducing significant variability in the rate and fidelity of regeneration among these axons. Complete transection of this nerve is even less desirable given that many axons will fail to reconnect with the same muscle fibers. Complicating matters, the sciatic nerve possesses intrinsic anatomic variability, both in the number and site of origin of its terminal nerve branches. It is therefore very difficult to lesion the same site. While the tibial nerve is smaller and more amenable to crush injuries, there is also no readily available landmark to serve as a lesion site for this nerve branch. 
The accessory nerve branch (part of cranial nerve XI) that supplies the sternocleidomastoid muscle has also been used to study regeneration of NMJs15. This nerve is particularly attractive because NMJs in the sternocleidomastoid muscle can be more readily imaged in live animals compared to NMJs in other muscles. But similar to the sciatic and tibial nerves, there is no specific landmark that can be used to injure this nerve in the same location, limiting it as a model for comparing regeneration of NMJs among individual animals of an experimental cohort. An inconsistent lesion site introduces variability in the rates of NMJ reinnervation. Due to these shortcomings, the procedure presented here utilizes the injury of a different peripheral nerve branch to examine regenerating NMJs. 
The common fibular nerve, also called the common peroneal nerve, contains many features that make it a reliable nerve to examine regeneration of NMJs between animals and across different treatments. The common fibular nerve has a predictable anatomic course as it runs over the tendon of the lateral head of the gastrocnemius muscle in the knee, the intersection serving as a stable landmark for lesions. The nerve is accessed through a small and minimally invasive incision near but anatomically segregated from the muscles of interest. The findings presented here demonstrate that regenerating motor axons begin to reform NMJs in the extensor digitorum longus (EDL) muscle 8 days after crushing the fibular nerve in 70 days old young adult female mice. Importantly, the pattern and rate of reinnervation is consistent among animals of the same age and sex and therefore provide a reliable injury model that will significantly hasten our understanding of the cellular and molecular changes required to maintain and repair NMJs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VetOne&#160;</td>
			<td>501072&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd Inc.&#160;</td>
			<td>003437&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine </td>
			<td>&#160;Zoopharm</td>
			<td>1Z-73000-150910&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim-wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Razor </td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>CLP-64800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% EtOH/H20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Proviodine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>91500-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 scalpel</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SSS 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 silk suture on reverse cutting needle</td>
			<td>&#160;Suture Express</td>
			<td>752B&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Heating Pad</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>AP-R-18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 555 conjugated alpha-BTX </td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>B35451</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>562037192</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 700 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable-flow peristaltic perfusion pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Total RNA Mini Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad iScript RT Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast Evagreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad CFX96</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube vet ointment</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>1621</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptotagmin-2 antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN401605</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN2475842</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fibular nerve injury method: a reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions

צומת עצב-שריר (NMJ) עובר שינויים מבניים ותפקודיים מזיקות כתוצאה הזדקנות, פציעה ומחלה. לכן, זה הכרחי כדי להבין את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בשמירה ותיקון NMJs. לשם כך, פיתחנו שיטה אמין ועקבי לבחון התחדשות NMJs בעכברים. שיטת עצב פגיעה זו כרוכה ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי נפוץ כפי שהיא עוברת מעל הראש הלטרלי של גיד שריר הסובך ליד הברך. שימוש עכברות בן 70 יום, אנו מראים כי אקסונים מוטוריים מתחילים reinnervate מטרות postsynaptic קודמים תוך 7 ימים לאחר למעוך. הם לגמרי לכבוש מחדש שטחים הסינפטי הקודם שלהם ב -12 ימים. כדי לקבוע את האמינות של שיטת פגיעה זו, השווינו שיעורי reinnervation בין עכברות ישנות פרט 70 יום. מצאנו כי מספר אתרי postsynaptic reinnervated היה דומה בין עכברים בבית 7, 9, ו -12 ימים למחוץ-פוסט. כדי לקבוע אםassay פגיעה זו יכולה לשמש גם כדי להשוות השינויים המולקולריים בשרירים, בדקנו רמות של למקטע-גמא של קולטן ניקוטינית שריר (גמא-AChR) ואת קינאז ספציפי-שריר (מושק). למקטע גמא AChR ומושק לדוחות אלו שהוגברו מאוד denervation הבאה ולחזור לרמות נורמליות לאחר reinnervation של NMJs. מצאנו קשר הדוק בין רמות תמליל עבור גנים אלה ומצב עצבוב השרירים. אנו מאמינים כי שיטה זו תאיץ את הבנתנו את השינויים התאיים ומולקולריים מעורבים בתיקון NMJ וסינפסות אחרות.

העצב שׁוֹקִיתִי משותף, גם הנקרא העצב peroneal משותף, נובעת גיד הנשה מעל fossa popliteal, שם הוא נדנדות סביב ראשו של שוקית אל ההיבט הקדמי של הרגל (איור 1 א). יש לה סניפים לתוך עצבים שטחיים ועמוקים שׁוֹקִיתִי, יחד לספק את dorsiflexors של כף הרגל ועל בהונות (הקדמי tibialis, longus digitorum פושטי ו brevis, ו פושטי halluces השרירים longus), ואת everters של כף הרגל (שרירי peroneus). גם עצב זה נושא סיבים חושיים מקרינים אל dorsum של כף הרגל בצד הלטרלי של החצי התחתון של הרגל. זהו מבנה דק יחסית מורכב מנוע אקסונים חושי. הסניף עצב זאת בעקבות קורס אנטומיים לחיזוי. לרוחב עד הברך, העצב הוא שטחי בעיקר כפי שהוא פועל על הגיד של הראש הלטרלי של שריר הסובך (איור 1 ואיור 2). thהמיקום הוא משמש כציון דרך יציבה כי ניתן להגיע בקלות עם חתך קטן, הגבלת נזק לעור ו fascia (איור 1 א). הקוטר הקטן יותר של עצב זה, כשמשווה את הנשה ועצבי שוקה, מאפשר למחוץ כל האקסונים באמצעות כוח פחות, הקטנת הסיכוי לחלוטין ניתוק אקסונים שטחי יותר. עכברים לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) רק בנוירונים 17 שימשו כדי לייעל את הליך דלוקה עצב שׁוֹקִיתִי משותף וחד משמעי לדמיין אקסונים התחדשות. העצב נמחץ בקצה גיד הגסטרוקנמיוס הפרוקסימלי ביותר לשרירי היעד כי האתר הזה הוא נגיש יותר מהמיקום של החתך. אתר זה משמש גם ציון דרך אנטומי אמין, כך שניתן להשוות התחדשות של NMJs בקרב בעלי חיים מאותו המין והגיל. דחיסת העצב במשך 5 שניות באמצעות מיל מלקחיים בסדראולטס היעלמותו של YFP מהאתר של פציעה (איור 2 ב). עם זאת, הרקמות ותאי חיבור המתגוררים epineurium להישאר רציפים, המשרתים כצינור לחידוש והמדויק של אקסונים ליעדים המקוריים שלהם (איור 2 ב). ב 70 הימים ההם עכברות, פציעה די בכך כדי לגרום לניוון של כל מגזרי אקסונלית דיסטלי מן סומה העצבית (איור 4B). כדי לקבוע את אמינות שחזור של שיטת פגיעה זו, reinnervation של longus digitorum פושטי (אדי) שריר נבדק. שריר זה נבחר מכמה סיבות: 1) זה הפרוקסימלי עדיין מופרד פיזי מאתרי פגיעת החתך עצבים (איור 3 א). לפיכך, השריר משתנה רק על ידי ניוון של אקסונים innervating ניתק. קרבתה לאתר למעוך ממזערת את הזמן הדרוש על מנת שניתן יהיה reinnervated והשרירים atrophy. 2) הוא מורכב בעיקר של סיבי שריר שלד סוג מהיר, אשר רגישים יותר הזדקנות ומחלות. 3) NMJs שלה עובר שינויים מבניים משמעותיים במהלך ההתקדמות של מחלות והזדקנות שניתן נחלשה באמצעות תרגול גופני או הגבלת קלוריה. 4) זה הוא נגיש הדמיה לחיות ומניפולציה מולקולרית (איור 3D). 5) ניתן להפריד בקלות למרכיבים המטטרסו ארבעה שלה כי יכול להיות שלם רכוב כך שניתן באופן מלא תמונה כל אקסונים innervating שלה והקשרים שלהם באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 3). Reinnervation אתרי פוסט סינפטי ננטשו לפניה לאחר ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי על רגל ימין הוערך בשלוש עכברות בן 70 ימים לבטא YFP אקסונים מוטוריים. אתרי הפוסט סינפטי היו דמיינו באמצעות מתויג fluorescently אלפא-bungarotoxin (BTX), אשר נקשר באופן סלקטיבי עם זיקה גבוהה לשרירים NACHRS. השרירים נחשבו להיות denervated, באופן חלקי או מלא reinnervated הבאים הקריטריונים הבאים: 1) בסיבי השריר denervated, אקסונים המנוע היו חסרים לחלוטין מאתרים הפוסט סינפטי ופחות מ -5% colocalization בין האקסון AChRs נצפתה. 2) סיבי שריר מעוצבבים חלקית סווגו על ידי כמה אבל פרד שלם של אקסונים מוטוריים עם אתרי פוסט סינפטי ו colocalization 5-95% בין האקסון AChRs נצפתה. 3) בסיבי שריר מעוצבבים באופן מלא, לא היה כמעט פרד מושלם בין קצות עצבים מוטוריים ואתרי פוסט סינפטי וגדולים colocalization 95% בין האקסון AChRs נצפתה. NMJs הפרט הורחק מספירות אם endplates שלהם שכב בניצב למישור ההדמיה או NMJ כולו לא היה דמיין. שימוש בקריטריונים הללו, קונקורדנציה גבוהה בתעריף ומידת reinnervation נצפתה בקרב כל העכברים שנבדקו. ב 4 ימים לאחר למעוך, השרירים נמצאו denervated לחלוטין בכל EXA חיותממוקש (איור 4B). ממצא זה מראה כי ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי המשותף במשך 5 שניות, כמתואר לעיל, די בכך כדי לנתק את כל האקסונים. ב -7 ימים לאחר למעוך, קצות העצבים היו בתהליך של אתרי לשוב הפוסט סינפטי ננטשו לפניה (איור 4C, 4E-F). עם זאת, רוב סיבי השריר עדיין נמצאו חלקי בלבד מעוצבבים. עם ימים נוספים לאחר למעוך, קצות העצבים המשיך להתמיין אתרי presynaptic ו NMJs נמצאו reinnervated מלאה של 12 ימים (איור 4D, 4E-F). חשוב לציין, לא הייתה השתנות מעט בקרב עכברי denervated עבור אותו פרק הזמן (איור 4E-F), הוכחה כי ריסוק העצב שׁוֹקִיתִי יכול לשמש assay להשוות reinnervation של שרירים בין בעלי חיים מאותו המין והגיל. היכולת להשוות התחדשות NMJs בנאמנות בין בעלי החיים מספקת הזדמנויותכדי להבין את התכונות הסלולר הקשורים לכל צעד נדרש לתקן סינפסה זו במלואה. כדי לבחון את הארכיטקטורה של NMJs denervated ואת ההתחדשות מן העכברים 70 בימים ההם בשימוש מעל להשוואת מחירים של reinnervation, מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה תמונות של NMJs התקבלו. כצפוי, ניתוח זה חשף מספר שינויים המתרחשים קצות העצבים האקסון α-מנוע כפי שהם reinnervate סיבי שריר (איור 4G-I). קונוסים צמיחה אקסונלית להופיע להרחיב ולהתחיל להסתעף כפי שהם לפנות באתרי postsynaptic (איור 4G). סניפים אקסונלית אלה אז לצמוח לאורך אזורים ספציפיים של postsynapse, שהגיעו לשיאה הסמיך כמעט המוחלטת של עצב האקסון וכלה באתר postsynaptic (איור 4H-I). תכונות מבניות נוספות התחדשות קצות עצבים מוטוריים מאוד דומים גילו כי אלו במהלך ההתפתחות נצפו, כוללים אקסונים מספר מתחרים על היםהיעד ame (איור 4H), שהגיעה לשיאה האקסון היחיד innervating סיב שריר אחד על ידי 12 ימים לאחר למעוך. בנוסף, סניפים אקסונלית החורגות אתרי הפוסט סינפטי, המוזכרים כאן כמו נבטים, בכל שלבי שלאחר פציעה נצפו (איור 4I). נבטי אלה היו תופעה שכיחה מאוד, אפילו NMJs מעוצבבים מלא דבר המצביע על כך את השלב הסופי של תיקון אקסונלית כרוך הכחשה של סניפים אקסונלית extrajunctional. למרות שינויים ברורים אלה קצות עצבים, פוסט סינפטי אתרים נשארים נבדלים בעיקר בכל השלבים שלאחר הפציעה בהשוואה לאלו בשרירים וללא כל פגע, כוללים ב 4 ימים לאחר למחוץ כאשר סיבי שריר נמצאים denervated לחלוטין. לא היה שום סימן של תהליך הפיצול או הפסד מהותי חלוקה מחדש לאזורים נוספים סינפטי של AChRs. ממצאים אלה בתוקף עולה כי שיטת למחוץ עצב שׁוֹקִיתִי יכול לשמש assay לזהות ולבדוק מולקולרית, תרופתי והתערבויות בסגנון החיים tכובע לקדם תיקון של קצות עצבים ב סינפסות, כולל NMJ. למרות ההתקדמות שחלה באחרונה, התקדמות מועטה נעשתה בזיהוי גורמי הנגזרות השריר הנדרש מספיק כדי לתחזק ולתקן את NMJ. ולכן ביקשנו אם השיטה פגיעה עצבית שׁוֹקִיתִי משותף שניתן להשתמש בהם כדי לזהות מולקולות שינו בשלבים מסוימים של התהליך reinnervation ועם תפקידים פוטנציאליים בתיקון NMJ. כהוכחה עיקרית, ניתוח ביטוי של שני גנים הקשורים NMJ, למקטע גמא AChR ואת קינאז ספציפי שרירים, מושק 18 בוצע. כפי שראינו עם PCR כמותי, הגנים האלה גדל הבאים denervation וירידה כמו NMJs הם reinnervated (איור 5 א-ב). גנים אלה שהוגברו ב 4 ימים לאחר למעוך, כפי שדווח בעבר באמצעות 19 שרירי denervated לחלוטין. כמו סיבי שריר העצבים reinnervate, רמות של גנים אלו מורידות ו rapidly לחזור לנקודת ההתחלה. בין חיות שנבדקו, דפוס הביטוי לשני הגנים זהה כמעט, הוכחת קשר הדוק בין שינויים המולקולריים תאיים ב NMJs התחדשות. שיטה זו ולכן מספקת הזדמנויות ייחודיות לזהות שינויים מולקולריים הקשורים בשלבים שונים של התחדשות NMJ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54186/54186fig1.jpg" /> איור 1:. Common שׁוֹקִיתִי עצב אנטומיה (א) סכמטי המפרט את מסלול העצב הסכיאטי וענפים מסוף שלה ביחס ציוני דרך שטחית וגרמי. SCN = גיד הנשה, TN = עצב הטיביאלי, עצב SrN = Sural, CPN = עצב הנפוץ שׁוֹקִיתִי, SPN = עצב השטחי שׁוֹקִיתִי, DPN = עצב העמוק שׁוֹקִיתִי. אתר החתך הרצוי מותווה. (ב) תרשים של מיקום העצב המשותף שׁוֹקִיתִי ביחס השרירים המקיפים עם העור הוסר.אתר חתך יחסית מוצג שמעל fascia ההשקעה. TA = השוקה הקדמי שריר אדי = פושטי digitorum Longus שרירים. (C) חשופים הנשה ועצב שׁוֹקִיתִי משותף. CPN חוצה את שריר הסובך (GN) גיד ברמה של הברך. קראש אתר ביחס גיד לראות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54186/54186fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54186/54186fig2.jpg" /> איור 2:. ניתוח עצב קראש נפוצות שׁוֹקִיתִי (א) החתך הראשוני צריך להיות רק כמה ס&quot;מ אורך. לאחר חודר דרך העור fascia שטחית, החתך חייב להיות המשך דרך fascia השקעה / עמוק שוכב בין femoris שרירי ושרירים ת&quot;א. (A1) העצב שׁוֹקִיתִי הנפוץ היא דמיינה בקלות בלי t מיקרוסקופיהדרך עינית החתך (Gn = הגסטרוקנמיוס שרירים). (A2) ההצלבה של גיד עצב הגסטרוקנמיוס המשותף שׁוֹקִיתִי ניתן מדמיין בקלות אם החתך הוא התרחב (נחוץ רק למטרות צילום). הדוחק צריך להיות ממוקם במיקום המסומן על ידי הקו האדום בניצב העצב ובמקביל גיד Gn. (ב) CPN הוא אפילו יותר מדמיין בקלות עם עכברים מהונדסים YFP תחת היקף ניתוחי ניאון. (B1) עצב מאבד קרינה באתר של התאהבות, המאפשר אישור של פציעה למחוץ מלאה. (B2) דלוקה מלא CPN יכול עדיין להיות דמיין עם תאורת עין וחדר העירום. העצב יהפוך שקוף. תמונה זו מדגישה את העובדה epineurium והמבנה של CPN נשארים שלמים תוך הגבלת ניזק זמנית לכלי רקמות דם סמוכים.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54186/54186fig3.jpg" /> איור 3:. האנטומיה של פושטי digitorum Longus (אדי) שרירים (א) 3 ממדי התמונה של אדי ביחס עצמות הגפיים האחוריות בעכבר. שנוצר באמצעות JAtlasView (B) גזור חלקית שריר אדי מתחלק אגפיה ארבעה המטטרסו וסימון הספרות בשליטת כל חטיבה. (C) YFP שכותרתו ענף של העצב שׁוֹקִיתִי עמוק כפי שהוא מעצבב הלהקה סוף-צלחת של חטיבת אדי שליטה על הספרה השנייה. (ד) סניפים אקסונלית ואתרי הקשר שלהם יכולים להיות מזוהים בקלות, המאפשרים בחינה עקבית של NMJs שנבחר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54186/54186fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר o</a>f דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54186/54186fig4.jpg" /> איור 4: שיעור דומה של reinnervation בין בעלי החיים של אותו גיל ומין הניתוח של NMJs בשריר EDL לאחר ריסוק עצב שׁוֹקִיתִי.. (א) הודעה סינפטי אתרים תפוסים לחלוטין על ידי אקסונים בעכברים וללא כל פגע. (ב) בשעה 4 ימים לאחר למעוך, השרירים נמצאים denervated לחלוטין. (C) אקסונים מתחילים reinnervate השרירים 7 ימים לאחר למחוץ (D) לגמרי לכבוש מחדש באתרי postsynaptic ב -12 ימים. (E - F) שיעור מחדש התפוסה NMJ הוא כמעט שאין להבחין בין בעלי חיים denervated עבור אותו אורך זמן. (G - אני) נציג תמונות של קצות עצבים אקסונלית המבדילים-מחדש לתוך אתרי presynaptic התבגר. כיבוש אתרי postsynaptic כדלקמןדפוס צפוי, החל חרוט צמיחה ופיתוח ענפי שבסופו של דבר מילאה לגמרי את אתרי postsynaptic ללא החורגות NMJ region.Similar להתפתחות, אתרי postsynaptic בתחילה מעוצבבים על ידי אקסונים מחדש גדל מספר אבל רק אחד האקסון נשאר ברגע NMJ כבר התאחה לחלוטין. (H) דוגמאות של הנבטה אקסונלית צוהלת, עצבוב חלקי ללא חפיפה מלאה בין מראש ומנגנוני postsynaptic, ו עצבוב על ידי אקסונים מספר מצוינים. 70 עכברות יום בן נבדקו; בר סולם = 50 מיקרומטר (AD), 20 מיקרומטר (GI). שגיאה בר = SEM. N = 3 עכברים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54186/54186fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54186/54186fig5.jpg" /> איור 5: העצב שׁוֹקִיתִי קראש שיטה כמוn Assay לזהות גנים מועמדים מעורב בתיקון NMJ (A - B). רמת ה- mRNA של שני גנים הקשורים NMJ, למקטע גמא AChR ומושק, הם שינו באופן דומה בשריר ת&quot;א של עכברים denervated עבור אותו אורך של זמן . עם פגיעה עצבית פוסט זמן להגדיל, רמות של שני התמלילים להקטין, שחזרו בסיס, אשרו ניתוח היסטולוגית מראה reinnervation המתקדמת של NMJs. כל שורה מייצגת עכבר פרט. שגיאה ברה = סטיית התקן של הממוצע של משכפל טכני. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54186/54186fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions at JoVE.com

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

עצב שׁוֹקִיתִי השיטה פגיעה: A Assay אמין כדי לזהות מבחן הגורמים תיקון Neuromuscular הצומת

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

the-fibular-nerve-injury-method-reliable-assay-to-identify-test

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.6K Views.  Virginia Tech. We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle. 

Video: The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

עצב הראייה קראש פגיעה דגם Murine לחקר הישרדות רשתית תא גנגליון

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing delivery of oxygen and nutrients. About half of the stroke survivors are left with some degree of disability. Innovative methodologies for restorative neurorehabilitation are urgently required to reduce long-term disability. The ability of the nervous system to reorganize its structure, function and connections as a response to intrinsic or extrinsic stimuli is called neuroplasticity. Neuroplasticity is involved in post-stroke functional disturbances, but also in rehabilitation. Beneficial neuroplastic changes may be facilitated with non-invasive electrotherapy, such as neuromuscular electrical stimulation (NMES) and sensory electrical stimulation (SES). NMES involves coordinated electrical stimulation of motor nerves and muscles to activate them with continuous short pulses of electrical current while SES involves stimulation of sensory nerves with electrical current resulting in sensations that vary from barely perceivable to highly unpleasant. Here, active cortical participation in rehabilitation procedures may be facilitated by driving the non-invasive electrotherapy with biosignals (electromyogram (EMG), electroencephalogram (EEG), electrooculogram (EOG)) that represent simultaneous active perception and volitional effort. To achieve this in a resource-poor setting, e.g., in low- and middle-income countries, we present a low-cost human-machine-interface (HMI) by leveraging recent advances in off-the-shelf video game sensor technology. In this paper, we discuss the open-source software interface that integrates low-cost off-the-shelf sensors for visual-auditory biofeedback with non-invasive electrotherapy to assist postural control during balance rehabilitation. We demonstrate the proof-of-concept on healthy volunteers.

A novel low-cost human-machine interface for interactive post-stroke balance rehabilitation system is presented in this article. The system integrates off-the-shelf low-cost sensors towards volitionally driven electrotherapy paradigm. The proof-of-concept software interface is demonstrated on healthy volunteers.

ממשק אדם-מכונה-שילוב חיישנים בעלות נמוכה עם מערכת גירוי חשמלי Neuromuscular לשיקום מאזן פעימות הודעה

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

הערכה של תפקוד העצבי באמצעות גירוי עצבי חשמלי Percutaneous

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...