German Research Foundation (FOR2240 "(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye" to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (to CC).

השימוש ברקמות אדם צריך להיות נבדקת ואושר על ידי עושה ועדות מוסדיות או שווה הערך. העבודה המתוארת כאן אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית והיה אישור לבדיקה מדעית. עבודה זו בוצעה על פי הצהרת הלסינקי. דגימות scleral אדם התקבלו מעיני תורמים הגלובוס (HR המקסימלי שלאחר המוות זמן 24) על עיניים בנק מחלקת עיניים, אוניברסיטת קלן, גרמניה. 1. הכנה ניסויית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 96% אתנול וזרחתי בופר (PBS) צינורות שונים. הכן את נוגדנים ראשוניים עם הדילול המומלץ של PBS המכיל אלבומין 2% שור (BSA) ולשמור את כל פתרונות על קרח. כן 100 μl לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את כל המכשירים ולהשתמש אזמלים חדים. אחרי חזר חיתוך עם אותה הסכין, לשנות את האזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג 1-2 מלקחיים COLIBRI, מספריים לנתח מיקרו ישר, אזמל # 10או נוצה מיקרו אזמל עיניים, וארבעה 26 מחטים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים בנייר אלומיניום סביב צלחת קלקר או להשתמש צלחת הפקק כדי להדביק את הרקמה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ סטריאו משקף. עבודה סטרילית מתחת זרימת אוויר למינרית במידת הצורך. </li></ol> 2. מכינים את בלובן העין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות את הנורה ולבצע ניקור ניקוב מצד corneoscleral, ולאחר מכן סובב את לִקְדוֹחַ. סובב את לִקְדוֹחַ בזהירות ובאופן שווה על פני השטח כדי לבצע חתך עגול באותה מידה. השתמש לִקְדוֹחַ 15.5 מ&quot;מ בגודל. חותך את המצורפים הנותרים עם מספריים מעוקלים. הסר את הניקור corneoscleral. זה יגרום נורה anteriorly נפתחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בלובן העין על מקלון עם החלק הפתוח כלפי מעלה. הסר את הרשתית עִנבִּיָה, באמצעות מלקחיים COLIBRI למשוך את שתי שכבות (הרשתית עִנבִּיָה) מן בלובן העין. אל תשאירו את עִנבִּיָה פיגמנט על בלובן העין הפנימית. השתמש במספריים מעוגלים כדי להסיר את הרשתית עִנבִּיָה מן הגבשושיות. הסר את remלחמית aining, שרירי extraocular, ו של הקפסולה שֶׁגֶם מן בלובן העין שטחית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדגם scleral בגודל הנדרש באמצעות מספריים ישרים מסוג ואת מלקחי COLIBRI. קח על 2 ס&quot;מ 2 דגימות scleral בגודל ממקומות שונים. בגלל גודלו הקטן, החזק את בלובן העין בעדינות לגזור לגודל המתאים כריבועים באמצעות מספריים ישר-סוג. ניקור corneoscleral מגדיר את השולים הקדמיים של דגימות scleral. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע חזר תופס עם מלקחי כאזור שבו רקמת התפס אינה מתאימה מיקרוסקופיה confocal מנתח. הכן את המספר הנדרש של דגימות בהתאם לסוג הניסוי (למשל קדמי לעומת בדיעבד, להשוות איור 1) ואת כמות הנוגדנים בשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים דגימות 1.5 מ&quot;ל צינורות לשימוש מאוחר יותר. תקן דגימות 1.5 מ&quot;ל 96% אתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים בכל 5 דקותב 1.5 מ&quot;ל PBS על שייקר. אם עובד עם רקמה קפוא, לבצע שלב זה לפני ההקפאה תוך שניות ספורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רקמה טריה. עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, צמד להקפיא את בלובן העין בחנקן נוזלי ולשמור אותו ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. אם עובד עם רקמה קפוא, להפשיר לפני השימוש. הימנע פשרת מעגלים חוזרים ונשנים של הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מדגם ב PBS המכיל BSA 1.5 מ&quot;ל 5% בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. צעד זה גורם לנפיחות של המדגם כי הוא מועיל עבור למינציה וגם מונע מחייב נוקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות תפחו, להכין את ריבועי scleral ללמינציה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ, למשל מיקרוסקופ סטריאו משקף. הצמד את דגימות scleral האחוריות הממברנה הקלקר עטוף בנייר אלומיניום או צלחת הפקק באמצעות 26 מחטי G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כופפו את הקצוות של מחטים כך שהם לא להפריע את שדה הראייה מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למינציה samp scleral בעובי מלאles. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, החזק את קצה scleral הקדמי באמצעות מלקחיים COLIBRI. ואז לחתוך בזהירות שכבה דקה של בלובן העין שטחית באמצעות אזמל # 10, הנוצה מיקרו עיניים אזמל, או להב מרית. החזק את האזמל אופקי ולחתוך את השכבה השטחית בצורה רחבה ככל האפשר מן השכבה שמתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שכבת scleral דקה מכיכר scleral. שיטה זו ניתן להשוות טכניקות ניתוח סטנדרטיות להכין דש במהלך trabeculectomy וצריך לגרום שכבות עבות 30-80 מיקרומטר (השווה איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע התייבשות של בלובן העין על ידי הוספת כמויות קטנות של PBS לרקמה, PBS μl למשל 50 בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השכבות לחתוך לתוך 100 μl של PBS ב 96 את הצלחת היטב ולתייג פי הנטייה (לכיוון חצוני ומתמחה) ואת השכבה (שטחי ועמוק) למשל עם צבע עמיד למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.7-2.9 עד רקמת למינציה מלאה. &lt;/ Li&gt; </ol> .3 בצע אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של הנוגדנים העיקריים הנדרשים לתוך הדילול המומלץ. הנה, למשל, השימוש CD 31 (אדם אנטי עכבר חד שבטי) נוגדני LYVE1 (אדם ארנב נגד), הוא דילול של 1: 100 ב PBS (המכיל 2% BSA) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לשנות את המדיום בצלחת 96 באר, להחזיק פיפטה אל הקיר של הבאר ולהסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את דגימות שלוש פעמים בכל 5 דקות עם 200-300 PBS μl על שייקר. הוספת 100 μl של נוגדנים משני המתאימים; כאן להשתמש isothiocyanate והעמסת העכבר עז נגד (FITC) וצבעים cyanine ארנב עז נגד 3 (Cy3), דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. לדלל את הנוגדנים משני 1: 300 ב PBS המכיל סרום עיזים 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את דגימות שוב שלוש פעמים בכל 5 דקות ב 200-300 μl PBS על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מכתים הגרעין, למשל </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (דילול 1: 2,000, 100 μl היטב כל דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר), ולאחר מכן לשטוף שוב 2 פעמים ב 200-300 PBS μl על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות על גבי שקופיות מיקרוסקופ, להטביע אותם 1-2 טיפות של המדיום גובר פלורסנט, להוסיף coverslip, לאטום אותו על ידי כיסוי קצוות עם לכה שקופה, ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר או ישירות לבחון את השקופיות עם confocal מִיקרוֹסקוֹפּ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ confocal (או שווה ערך) כדי לנתח את הדגימות. השתמש ההגדלה הרצויה, הגדלה למשל 10-40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת את העובי של הדגימות, למדוד עם מיקרוסקופ confocal באמצעות Z- ערימות. כמות חלקי scleral אפשרי תלויה במיקום של בלובן העין, כמו העובי שונה equatorially ו בדיעבד (השווה מבוא). </li></ol>

<ol>
	<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+(LYVE1)-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera.">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera.">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li><li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection.">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li><li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis:+what+can+we+learn+from+the+eye.">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li><li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments.">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li><li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact,+functional+spleen.">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li><li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+chamber-associated+immune+deviation,+ocular+immune+privilege,+and+orthotopic+corneal+allografts.">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li><li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera.">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li><li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit.">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li><li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+content+of+the+scleral+spur,+trabecular+mesh,+and+sclera.">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li><li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The sclera. , (2012).</li><li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Blutkreislauf+des+Auges.">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225 (1943).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li><li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm's+canal.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li><li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti.">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li><li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study.">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li><li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment.">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li><li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+(author's+transl).">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no financial disclosures. The contents of this article are solely the responsibility of the authors.

למינציה בלובן העין האנושית היא שיטה לביצוע במיקרוסקופ confocal על רקמה זו. שלב קריטי בתהליך זה הוא השימוש באתנול במקום פורמלין עבור הדבקת הרקמה. מניסיוננו, תוצאות טובות יותר מתקבלות כאשר באמצעות אתנול במקום פורמלין עבור קיבעון. אזמלים בלאנט להחמיר את ההליך וכן יש להימנע. באופן דומה, עד הייבוש של בלובן העין יש להימנע, כפי שהוא מסבך את ההליך ומקטין את איכות התמונות. באשר מכתים immunohistochemical, נוגדנים אחרים מאלו מיושמים כאן ניתן להשתמש. באופן כללי, קולגן מראה יותר פלואורסצנציה אוטומטית ורקע בערוץ הירוק, ולכן אדום, כחול, וערוצי מרחיקות אדומות מראה תוצאות טובות יותר עם רקע פחות. עם זאת, ישנם מספר מגבלות של הטכניקה. למינציה בלובן העין דורש הרבה תרגול, כפי שהוא הליך מיקרו מבוצע תחת microscאופ. בגלל הטכניקה הזו מתבצעת באופן ידני, את פרוסות למינציה היחידות אינן בדיוק באותו הגודל נבדלות העובי שלהם בתוך פיסת רקמה אחת. כדי לקבל רקמות של בדיוק באותו הגודל, ניקור עשוי להוות אלטרנטיבה, למרות עובי השכבות עדיין להשתנות. כדי להשיג עובי בדיוק שהוגדר עבור סעיפים scleral, גידול microkeratome אוטומטי עשוי להוות אלטרנטיבה ניסויים עתידיים. אם למינציה מבוצע עם שכבות כי הם עבים מדי, שקופית הכיסוי עלולה לנקוע, ואת הרקמה יכולה להתייבש באופן פוטנציאלי. הגבולות המדויקים בין episclera ו stroma עשוי להיות קשה להבדיל פעם laminations מבוצעות. למרות זאת, למינציה בלובן העין יש מספר יתרונות השימוש אימונוהיסטוכימיה, במיוחד כשמשווים אימונוהיסטוכימיה מוטבע פרפין קבוע בפורמלין, המהווה את השיטה הסטנדרטית במצב הקליני הנוכחי. למינציה בלובן העין מאפשרת microsc confocalעתק להתבצע, באזורים גדולים יותר של בלובן העין להיות מנותח, שכבות שונות של בלובן העין להיבדק, כמו גם הקרנת וסריקה של רקמות. לעומת זאת, כאשר עובדים עם דגימות מוטבעות פרפין פורמלין-קבוע, בלובן העין משתנית העקביות שלה בצורה מועילה במהלך החימום מוקדם לאחזור אנטיגן. לאורך כל תהליך החימום, סיב קולגן להצטמק הרקמה מאבדת קשר עם השקופיות. בעבר, מקלעת הכלי ב episclera הייתה גלויה רק ​​על ידי שימוש בטכניקות והאנגיוגרפית או בתצוגת ההר השלמה, אבל לא חתכים. בנוסף הקשיים הטכניים, בלובן העין הוא avascular יחסית דל יחסית בתאי מערכת חיסוניים בהשוואה לרקמות אחרות בעיניים, כגון הרשתית. לכן, בעת שימוש שקופיות מוטבעות פרפין קבוע בפורמלין, שהן בדרך כלל 4 מיקרומטר שקופיות עבות מספר נדרשים כדי לזהות תאים חיוביים בלובן העין. לאחרונה, ניתן היה לראות באמצעות מפלסטיק למינציה זהing טכניקה בלובן העין האנושית אינה acellular, אך מכיל שפע של מקרופאגים LYVE1 + לצבור סביב כלי הדם 1. לסיכום, ביצוע מיקרוסקופיה confocal על סעיפים למינציה scleral הוא כלי מבטיח לחקור הפרעות פתולוגיות בעתיד, כגון scleritis, אובאיטיס, או טראומה.

בלובן העין היא השכבה החיצונית הנוקשה המכסה את העין, העשוי רקמת חיבור צפופה. זה עוזר להגן על מבנים תוך-עיני וכדי לשמור על לחץ תוך עיני. לפיכך, בלובן העין חיוני לראייה ברורה. זהו ללא כלי הלימפה 1,2 ובכך מהווה גבול חיצוני הלימפה ללא הבינה לבין העין הפנימית ללא הלימפה 3-7. הוא גם מספק אתרים מצורפים עבור שרירי extraocular וחולק דמיון אנטומי עם גידים. מכיוון בלובן העין מורכבת בעיקר צרורות צפופות של סוג אני קולגן יש מספרים קטנים של סוגי קולגן III, IV, V, VI, VIII 8,9 ואלסטין 10,11, רקמה זו אינה קלה לשימוש עבור אימונוהיסטוכימיה. אנטומית, בלובן העין ניתן לחלק לשלוש שכבות עיקריות: (1) episclera vascularized השטחי, נמצאות מתחת הלחמית הקפסולה של שֶׁגֶם ולקראת הצדדים הבחזרה הדואר של העין מול מסלולו; (2) את stroma scleral, החלק העיקרי של בלובן העין; ו (3) את lamina fusca, המהווה שכבה דקה, פיגמנט ממוקם ישירות מעל עִנבִּיָה. הידע אנטומי שלנו על בלובן העין נובע בעיקר מן המחצית הראשונה של המאה ה -20. באותו זמן, חוקרים בדקו את האנטומיה של כלי דם בעיקר באמצעות זריקות דיו הודו 12 וכלי דם ליהוק 13-15. מאוחר יותר, זה נחקר במחקרים והאנגיוגרפית 16-19. מאז אותה תקופה, שיטות ישנות שופרו חדשים פותח אפשרו לנו להשלים את הידע האנטומי קודם. לדוגמה, זה כבר רק יותר מעשור אחד מאז היו לנו סמנים הלימפה אמין כמו-1 קולטן hyaluronan ספציפי האנדותל של כלי הדם הלימפה (LYVE1) 20 או 21 podoplanin. מיקרוסקופיה Confocal מציעה אפשרויות חדשות ללימוד התכונות אנטומיות של ti השונהssues של העין. היא מאפשרת כתמים מרובים כדי לשמש להבחנת סמנים של תאים או עבור הלוקליזציה של תאים ביחס כלי דם מבנים אנטומיים אחרים. הוא מספק סקירה כאשר המדגם הוא בגודל גדול יותר ומאפשר לנו לסרוק באמצעות מדגם כאשר בחיפוש אחר סוג תא מסוים. בעזרת טכנולוגיה Z-Stack, מיקרוסקופיה confocal יכול לשמש דגימות עד 100-200 מיקרומטר. בלובן העין שונה בעובי בין 0.3 מ&quot;מ מאחורי הוספות שרירים 1 מ&quot;מ בקוטב האחורי 11. בשל הוא עובי השקיפות שלה, בלובן העין אינו מתאים מיקרוסקופיה confocal בשיטות מסורתיות. כדי לתקן את זה, רקמות scleral היו למינציה כדי לאפשר ניתוח שלהם עם מיקרוסקופיה confocal. טכנולוגיה זו שימושית להשגת הבנה טובה יותר של שני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ב בלובן העין האנושית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96% ethanol</td>
			<td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P075.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binocular stereo microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Hongkong, China</td>
			<td>n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles&#160;</td>
			<td>Terumo, Leuven, Belgium</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.5mm trepan</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>no.10 scalpel&#160;</td>
			<td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td>
			<td>2E+08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scalpel micro feather&#160;</td>
			<td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td>
			<td colspan="2">no. 7657BR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)</td>
			<td>Dako, USA</td>
			<td>IR610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE1 antibody&#160; (polyclonal rabbit anti human)</td>
			<td>Zytomed, Germany</td>
			<td colspan="2">RBK014-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti mouse FITC antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td>F0257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rabbit Cy3 antibody</td>
			<td>Dianova, Germany</td>
			<td colspan="2">111-165-003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum normal</td>
			<td>Dako, Glostrup, Denmark</td>
			<td colspan="2">X090710-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>6335.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides&#160;</td>
			<td>Engelbrecht, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td colspan="2">WC7695002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x24mm</td>
			<td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td>
			<td>7695026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAKO fluorescent mounting medium&#160;</td>
			<td>DAKO, USA</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM Meta 510 confocal microscopy&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Jena, Germany</td>
			<td>n.a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a laminating technique to perform confocal microscopy of the human sclera

בלובן העין היא רקמת חיבור צפופה שמכסה ומגן על העין. זה מורכב בעיקר חבילות קולגן צפופות (סוגים אני, III, IV, V, VI, ו- VII). בשל autofluorescence, העמימות, והעובי שלה, זה לא נמצא מתאים מיקרוסקופיה confocal. גישה חלופית לזו שהוצגה כאן, אשר משתמשת בלובן העין קבוע בפורמלין מוטבע פרפין עבור אימונוהיסטוכימיה, יש אתגרים טכניים, במיוחד כאשר החימום המוקדם הרקמה לאחזור אנטיגן. מאז בלובן העין הוא דל יחסית בשני התאים וכלי, שימוש דגימות רקמה גדולות שנחקר כדי לסייע במניעת תאים המשקיפה ולהבין הלוקליזציה שלהם ביחס כלי ואתרי אנטומיים אחרים. כדי לאפשר הניתוח של דגימות רקמה גדולות תחת מיקרוסקופ confocal, טכניקת למינציה בוצעה ליצור שכבות דקיקות מן בלובן העין. בעקבות ניתוח התוצאות של כלי הדם CD31 ו hyalu אנדותל כלי הלימפהרונאן קולטן 1 (LYVE1) תאים חיוביים, לגביה אישור לבדיקה מדעית הושג, את היתרונות והמגבלות של שיטה זו הם דנו.

בניסויי הנציג בצעו כאן, ישנם יתרונות להדגמה נגזרים השימוש בטכניקת למינציה המסוימת הזה. הניסוי הראשון ממחיש את הרשת המגוונת של מקלעת כלי דם episcleral בשלוש תמונות נציג (איור 3). הכלי הן חיובי עבור CD31. הניסוי השני מראה תאים חיסוניים, בפרט LYVE1 + תאים של episclera ויחסיהם אל כלי דם חיובי CD31. הנה טכנולוגיית Z-Stack שימש ב 10X ההגדלה לסרוק דרך רקמת ולהבין יחסי תלת ממדי של כלי הדם ותאי החיסון (איור 4). בלובן העין, כמו גם את שרירי extraocular הסגורים, ניתן לנתח את קיומו של כלי דם או תאי מערכת חיסון. איור 5 מראהLYVE1 תאים חיוביים וכלי דם חיובי CD31. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig1.jpg" /> איור 1:.. תמונה סכמטי של העין האנושית הנה סכמטי של חתך של העין האנושית <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53920/53920fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig2.jpg" /> איור 2:. תמונה סכמטי של טכניקת למינציה בלובן העין מוחזקת בזהירות עם מלקחי COLIBRI עם למינציה לשכבות בסדר באמצעות אזמל. חוזר על שלב זה מוביל שקופיות רקמה דקות שיכול לשמש עבור מיקרוסקופיה confocal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53920/53920fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של fi זה</a><html> איור. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig3.jpg" /> איור 3:. מקלעת כלי דם Episcleral, immunopositive עבור CD31 A ו- B נגזרות episclera הקדמי, בעוד C הוא מהמיקום האחורי. בר סולם עולה 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53920/53920fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig4.jpg" /> איור 4:. כלי CD31 + דם LYVE1 + תאים בתוך Z- מחסנית, מציג את יחסי האנטומי בין אותם כלי קטנים בגדולים עשויים לחפוף. בר סולם עולה 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53920/53920fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> התחת = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53920/53920fig5.jpg" /> איור 5: מצ&quot;ב בלובן העין הם השרירים extraocular הם מכילים רשת כלי דם בסדר דומה וכמה LYVE1 + תאים.. בר סולם עולה 200 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53920/53920fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera at JoVE.com

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K Views.  University of Cologne. Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used. 

Video: Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. Conventional methods assess neurological deficits and electrophysiology and quantitative sensory testing quantifies functional alterations to detect neuropathy. However, the earliest damage appears to be to the small fibres and yet these tests primarily assess large fibre dysfunction and have a limited ability to demonstrate regeneration and repair. The only techniques which allow a direct examination of unmyelinated nerve fibre damage and repair are sural nerve biopsy with electron microscopy and skin-punch biopsy. However, both are invasive procedures and require lengthy laboratory procedures and considerable expertise. Corneal Confocal microscopy is a non-invasive clinical technique which provides in-vivo imaging of corneal nerve fibres. We have demonstrated early nerve damage, which precedes loss of intraepidermal nerve fibres in skin biopsies together with stratification of neuropathic severity and repair following pancreas transplantation in diabetic patients. We have also demonstrated nerve damage in idiopathic small fibre neuropathy and Fabry's disease.

Corneal Confocal microscopy is a non-invasive clinical technique which may be used to quantify C fibre damage to diagnose and stratify patients with increasing neuropathic severity.

מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

ניצול גירוי מגנטי Transcranial לחקר מערכת Neuromuscular האדם

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Probe-based Confocal Laser Endomicroscopy of the Urinary Tract: The Technique

Probe-based confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces during standard endoscopy. With applications currently in the respiratory1 and gastrointestinal tracts,2-6 CLE has also been explored in the urinary tract for bladder cancer diagnosis.7-10 Cellular morphology and tissue microarchitecture can be resolved with micron scale resolution in real time, in addition to dynamic imaging of the normal and pathological vasculature.7
The probe-based CLE system (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, France) consists of a reusable fiberoptic imaging probe coupled to a 488 nm laser scanning unit. The imaging probe is inserted in the working channels of standard flexible and rigid endoscopes. An endoscope-based CLE system (Optiscan, Australia), in which the confocal endomicroscopy functionality is integrated onto the endoscope, is also used in the gastrointestinal tract. Given the larger scope diameter, however, application in the urinary tract is currently limited to ex vivo use.11 Confocal image acquisition is done through direct contact of the imaging probe with the target tissue and recorded as video sequences. As in the gastrointestinal tract, endomicroscopy of the urinary tract requires an exogenenous contrast agent&mdash;most commonly fluorescein, which can be administered intravenously or intravesically. Intravesical administration is a well-established method to introduce pharmacological agents locally with minimal systemic toxicity that is unique to the urinary tract. Fluorescein rapidly stains the extracellular matrix and has an established safety profile.12 Imaging probes of various diameters enable compatibility with different caliber endoscopes. To date, 1.4 and 2.6 mm probes have been evaluated with flexible and rigid cystoscopy.10 Recent availability of a &lt; 1 mm imaging probe13 opens up the possibility of CLE in the upper urinary tract during ureteroscopy. Fluorescence cystoscopy (i.e. photodynamic diagnosis) and narrow band imaging are additional endoscope-based optical imaging modalities14 that can be combined with CLE to achieve multimodal imaging of the urinary tract. In the future, CLE may be coupled with molecular contrast agents such as fluorescently labeled peptides15 and antibodies for endoscopic imaging of disease processes with molecular specificity.

Probe-based confocal laser endomicroscopy enables real-time microscopy of the human urinary tract during cystoscopy, providing dynamic, intravital imaging of pathological states such as bladder cancer with cellular resolution. Endomicroscopy may augment the diagnostic accuracy of standard white light endoscopy and provide intraoperative image guidance to improve surgical resection.

Endomicroscopy בדיקה מבוסס Confocal ליזר בדרכי השתן: הטכניקה

Probe-based  confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology  that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

נהלי ביופסיה של שריר שלד אנושי באמצעות טכניקת Bergstrom השתנה

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Construction of Vapor Chambers Used to Expose Mice to Alcohol During the Equivalent of all Three Trimesters of Human Development

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). At the most severe end of the spectrum is Fetal Alcohol Syndrome (FAS), characterized by growth retardation, craniofacial dysmorphology, and neurobehavioral deficits. Studies with animal models, including rodents, have elucidated many molecular and cellular mechanisms involved in the pathophysiology of FASDs. Ethanol administration to pregnant rodents has been used to model human exposure during the first and second trimesters of pregnancy. Third trimester ethanol consumption in humans has been modeled using neonatal rodents. However, few rodent studies have characterized the effect of ethanol exposure during the equivalent to all three trimesters of human pregnancy, a pattern of exposure that is common in pregnant women. Here, we show how to build vapor chambers from readily obtainable materials that can each accommodate up to six standard mouse cages. We describe a vapor chamber paradigm that can be used to model exposure to ethanol, with minimal handling, during all three trimesters. Our studies demonstrate that pregnant dams developed significant metabolic tolerance to ethanol. However, neonatal mice did not develop metabolic tolerance and the number of fetuses, fetus weight, placenta weight, number of pups/litter, number of dead pups/litter, and pup weight were not significantly affected by ethanol exposure. An important advantage of this paradigm is its applicability to studies with genetically-modified mice. Additionally, this paradigm minimizes handling of animals, a major confound in fetal alcohol research.

We demonstrate the construction of alcohol vapor chambers using readily available materials that simultaneously house 6 mouse cages. We further describe their use in a mouse model of fetal alcohol exposure equivalent to all 3&#160;trimesters of human pregnancy. This paradigm exposes animals during gestation and postnatal days 1-12.

בניית לשכות החמקן לחשיפת עכברים לאלכוהול במהלך המקביל של כל שלושת הטרימסטר של התפתחות אדם

Exposure to alcohol during development can result in a constellation of morphological and behavioral abnormalities that are collectively known as Fetal ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של שבץ כלי אחד

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Development of an Algorithm to Perform a Comprehensive Study of Autonomic Dysreflexia in Animals with High Spinal Cord Injury Using a Telemetry Device

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the mid-thoracic level can lead to a potentially life-threatening hypertensive condition called autonomic dysreflexia (AD) that is often triggered by noxious or non-noxious somatic or visceral stimuli below the level of injury. One of the most common triggers of AD is the distension of pelvic viscera, such as during bladder and bowel distension or evacuation. This protocol presents a novel pattern recognition algorithm developed for a JAVA platform software to study the fluctuations of cardiovascular parameters as well as the number, severity and duration of spontaneously occurring AD events. The software is able to apply a pattern recognition algorithm on hemodynamic data such as systolic blood pressure (SBP) and heart rate (HR) extracted from telemetry recordings of conscious and unrestrained animals before and after thoracic (T3) complete transection. With this software, hemodynamic parameters and episodes of AD are able to be detected and analyzed with minimal experimenter bias.

The catheter of a telemetry device is implanted into the abdominal aorta in order to continuously collect beat-by-beat hemodynamic data from animals pre and post-high thoracic spinal cord transection. A novel JAVA software was employed to analyze hemodynamic parameters as well as frequency and intensity of spontaneous episodes of autonomic dysreflexia.

פיתוח אלגוריתם לבצע מחקר מקיף על האוטונומית דיסרפלקסיה ב בעלי חיים עם פגיעה בחוט השדרה גבוהה שימוש בהתקן טלמטריה

Spinal cord injury (SCI) is a debilitating neurological condition characterized by somatic and autonomic dysfunctions. In particular, SCI above the ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can jeopardize their spontaneous breathing, topical anesthesia of the airway is a popular technique. The spray-as-you-go technique represents one of the simplest opportunities to anesthetize the airway mucosa. The application of local anesthetic through the working channel of the flexible endoscope is a widespread practice for anesthetists as well as pulmonologists. There is neither need for additional devices nor special training as a pre-requisite to perform this technique. However, a known clinical problem is the coughing and gagging reflex that may occur when the liquid anesthetic strikes the airway mucosa and other sensitive structures like the vocal cords. This can be avoided by the use of oxygen applied through the working channel with the aim of fogging the local anesthetic into finer particles. Furthermore, the oxygen flow provides a higher oxygen supply and contributes to a better view, dispersing mucus secretions and blood away from the lens. Using an atomizer with a high oxygen flow of 10 L/min we maximized these benefits, caused less coughing and had more satisfied and therefore cooperative patients. Possible, but very rare complications of using oxygen flow including gastric insufflation, organ rupture or barotrauma did not arise. We attribute the complication-free use of high oxygen flow to the design of the set, which permits flow and pressure release.

The topical anesthetic lidocaine was atomized using a high oxygen flow through the working channel of a flexible intubating endoscope to achieve topical airway anesthesia for awake endotracheal intubation. We prefer this modified spray-as-you-go technique for endoscopic intubation to classical bolus application because of higher patient satisfaction and better compliance.

הרדמת Airway האקטואלית עבור Awake-אנדוסקופית אינטובציה שימוש הריסוס-as-you-go טכניקה עם זרימת חמצן גבוהה

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

השני דור הרמונית אותות ב הארנב בסקלרה ככלי להערכה של רקמות טיפולית cross-linking של קוצר ראייה (TXL)

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...