אנו מודים המנוח רודי לימבורג בודת היקף זרוע קרדן, קימברלי ג&#39;יימיסון, מתיו מקהנרי, ו ראג&#39;ו Metherate עבור השאלה לנו ציוד, Almut קלבר ו קנטר Arikawa, על עידוד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע (NSF) כדי KJM ומענק NSF IOS-1,257,627 ל ADB

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הקלטה תאית יכולה להיות טכניקה קשה לשלוט בשל הצעדים טכניים הרבים המעורבים. עבור ניסויים מוצלחים כמה נקודות חשובות יש לקחת בחשבון. ראשית, חשוב שיהיה שולחן מבחינת רטט-מבודד כראוי שבו הניסוי מבוצע. חוקרים רבים משתמשים בלוחות אוויר, אשר לחלוטין להפריד את השולחן מהבסיס, מתן בידוד רעידות מעולה. ההגדרה שלנו כרוכה שולחן שיש עבה עם ארגז חול על גבי, שלתוכו הוא הניח את בעל micromanipulator / אלקטרודה / דגימת מנגנון במה. זוהי אלטרנטיבה יעילה יותר סבירה כדי שולחן אוויר, במיוחד אם גישה לגז בתוך הבית או אוויר דחוס היא מגבלה. אמצעי רטט-קליט נוספים עשויים להילקח כגון מתלי אוויר פסיביים, או התוספת של אלמנטי ריפוד אל רגלי השולחן (למשל, פתח כדורי טניס, צינורות אופניים, רפידות ג&#39;ל סמיכות). יתר על כן, זה הכרחי כי ההתקנה הניסיונית להיות בתוךכלוב פאראדיי עם הכל מוארק כראוי. כלוב פאראדיי צריך מסך רשת מתכת בחלק הקדמי כי ניתן להסיר כשעובדים בתוך הכלוב והחליפו בקלות בעת ההקלטה. אפילו כמות קטנה של רעש חשמלי הסביבה (בעיקר 50 רעש הרץ מאספקת החשמל AC הראשי) יכול לבצע הקלטה טובה אחרת שמיש. בעת הכנת דגימה, hemolymph והשכבות פיגמנט שמסביב האומטידיה עשוי למנוע הקלטות מוצלחות. אם החור הקרני הוא חתך גדול מדי, שאיבה רגילה של hemolymph בגוף גורמת לפני השטח הנוזלי כדי לנוע למעלה ולמטה באתר לחתוך, וכתוצאה מכך הקלטה יציבה. לאחר חור הוא חתך, שכבות פיגמנט hemolymph משטח יהיה קריש במהירות לתוך גלד חדיר גם כאשר אטום עם וזלין, ולכן חשוב לקבל את האלקטרודה לתוך העין בהקדם האפשרי. הפתרון של רינגר עשוי לשמש גם במקום וזלין. האלקטרודה הקרקע עשויה להיות מוחדרתאיברי הפה או לתוך הגדם של אנטנה לחתוך. בנוסף, זה בדרך כלל מועיל כדי לשמור על בעלי החיים כמו כהה מותאם ככל האפשר. בשיטה זו, צעדים כוללים שמירה בחדר ההקלטה כהה מאוד, חסימת אור התועה מן מנורת קסנון מלהיכנס כלוב פאראדיי, הבזקי גירוי זמן קצר (30-50 msec), ואת בתדירות מספיקה נמוכה בין ההבזקים (0.5 ומעלה). כאשר פיגמנט ויזואלי בולע פוטון, את כרומופור ב rhodopsin בוררים מ 11- ציס -3-hydroxyretinal לכל - טרנס -retinal, גרימת שינוי קונפורמציה של החלבון opsin, והפעלת המכלול כולו כפי metarhodopsin, אשר יוזם את חלבון G אֶשֶׁד. תמונה הלבנת מתרחשת כאשר אור בעוצמה גבוהה גורמת כרומופור להפריד פיזית בין חלבון opsin. זמן הוא גורם מגביל בניסוי הזה כי האלקטרודה יהיה רק ​​להקליט ביציבות תגובות מתוך התא לתקופה מסוימת של זמן עד שזה נופל החוצהאו הקרום פגום. מסיבה זו אנחנו לא לשבור אותו המאפשרים לתא להתאושש, אך אנו כן משתמשים משך פלאש ותדירות שמצאנו לא לבזות את תגובת התא לאורך זמן. חשוב על מנת להפחית את התדירות והעצמה של אור אם תמונת הלבנה מתרחשת. במהלך ההקלטה, טיפ אלקטרודה גדול או תנועה רבה על ידי אלקטרודה עלול לגרום נזק לתא כאשר חודר את הממברנה. רק טיפים בסדר (לפחות ~ 100 MΩ) ותנועות קטנות אמורים לשמש כאשר מתקרבים תא להקלטה. אם הקלטה תאית מוחלת ליישומים אחרים, כגון קלטות מוח, מאוד עדינה, אלקטרודות חסונה עשויה להיות משך באמצעות זכוכית קוורץ, אבל חולץ מיוחד חייב לשמש אלקטרודות אלה. כאשר ראשון שהופך אלקטרודה משייך תכנית, בדקנו התנגדות טיפ ידי למלא את המשבצות האלקטרודה, לקבע אותו לבעל אלקטרודה או בהתקנה מדומה, ומעמיד את קצה האלקטרודה קרקע תמיסת מלח. Nשלוחה אנחנו מוחלים זרם למדידת השינוי במתח על האוסילוסקופ. כדי להזיז את קצה האלקטרודה אנו משתמשים micromanipulator ידנית שזז לאורך שני צירים. מניפולטורים אחרים קיימים כולל אלה דיגיטליים המאפשרים תנועה לאורך כל שלושת צירים ואלה עשויים לשמש ליישומים זו או מורכב יותר. ישנן דרכים רבות כדי לבנות במה הקלטה, ויש הרבה סוגים שונים של חומרה ותוכנה המשמשות הקלטה וניתוח הנתונים הנצפים. ההגדרה שלנו מייצגת אחד התקנה פשוטה, קלה, ובמחיר סביר של אסדת ההקלטה. בבניית עקומת VlogI, פונקציות שפותחה על ידי Naka ו ראשטון 33 ואחרים 34,35 חשבון עבור חלקים שאינם ליניאריים מהתגובות זממו. שיטות שונות משמשות כדי להתאים עקומה זו לנתונים, ואנחנו זממנו התוצאות של שיטה אחת כזו שאינה דורשת תוכנה עקומה-הולם, אם כי שיטות אחרות מתאימות גם 36,37 ( <stרונג&gt; איור 7). זה יכול להיות גם שימושי כדי להשוות רגישויות ספקטרלי למודלים של ספיגת rhodopsin באורך גל שיא נתון. מודלים פרסמו מספר שואף לשחזר ספקטרום ספיג rhodopsin 38,39. רעיון מדויק יותר של הספקטרום הספיג של פיגמנט ויזואלי לידי ביטוי תא קולט אור חרקים עשוי להיות מודל על ידי לקיחה בחשבון נכסי ommatidial כגון פיגמנטים סינון, אבל זה דורש מדידה פיזיולוגית נוספים ופרמטרי אנטומי 11,40. מגבלה אחת של השיטה היא שאם האורגניזם מחקר מבטא יותר מאחד opsin דומים גנטית בעיניים, זה יכול להיות קשה לזהות אילו opsin mRNA תואם עשוי איזו מחלקה ספקטרלי של תא קולט אור. כדי להתגבר על בעיה זו, שיטה זו כבר בשילוב עם זריקות צבע ו כלאה באתרו או אימונוהיסטוכימיה לזהות את opsins בהצלחה לידי ביטוי בתאים רשמו 10. השיטה שלנו היא פשוטה ונגישה חוקרים זרים עם אלקטרופיזיולוגיה חזותי. טכניקה זו נפוצה במדעי המוח, אך הם ייחודיים ושיטות ברורות נעדרות בספרות, מה שהופך שיטה זו קשה לשחזר. למרות וריאציות רבות של טכניקה זו להתקיים, אנו מציעים דרך פשוטה למדוד רגישות ספקטרלית בעיניים המתחמות. הנתונים הפיסיולוגיים הוא חלק חשוב של ראיות בסיפורים של אקולוגיה חזותית אבולוציה 41. וריאציה רצף opsin קשורה קשר הדוק עם רגישות של תא קולט אור, מה שהופך אידיאלי בשיטה זו עבור מחקרים הבוחנים את הבסיס הגנטי שינוי פנוטיפי. מדידת רגישויות תא קולט אור ניתן לזווג גם עם מבחני ההבחנה בין צבעים התנהגותי, מראה את הבסיס הפיזיולוגי ספי אפליה חשוב ראיית צבעים 42-46. בשנת מניפולציות גנטיות או טיפוליות תסיסנית למשל, לא זהechnique יכולה להיות דרך טובה למדוד תפקוד פיזיולוגי תקין של העין או המוח, כמו גם 47,48. למרות שלנו אינו הראשון או שיטת המורכבים ביותר של הקלטה תאית בעיניים, תקוותנו היא כי נוכל להפוך שיטה זו יותר זמינה בקלות עבור רבייה ואינטגרציה בתוכניות מחקר מחוץ הנוירולוגיה רשמית.

התכונות החשמליות של תאים כגון נוירונים הם נצפו על ידי מדידת זרימת יונים על פני קרום התא כשינוי מתח או זרם. מגוון של טכניקות אלקטרו פותח כדי למדוד אירועים ביואלקטריים בתאים. נוירונים נמצאים בעיני חיות נגישים המעגלים שלהם הם בדרך כלל פחות מורכבים ממה במוח, מה שהופכים תאים אלה מועמדים טובים במחקר אלקטרו. יישומים נפוצים של אלקטרופיזיולוגיה בעיניים כוללים electroretinography (ERG) 1,2 ו הקלטה תאית microelectrode. ERG כוללת הצבת אלקטרודה או על העין של חיה, החלת גירוי אור, ומדידת השינוי במתח כסכום של התגובות של כל התאים הסמוכים 3-6. אם מישהו מעוניין במיוחד באפיון רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור בודדים, לעתים קרובות סוגי תאים מרובים להגיב בו זמנית בעוצמות שונות לגירוי נתון; וכך זהיכול להיות קשה לקבוע את הרגישויות של סוגי תאים ספציפיים מנתוני ERG במיוחד אם ישנם מספר סוגים שונים של תאי קולטי אור ספקטרלית-דומים לעין. פתרון אפשרי אחד הוא ליצור תסיסנית מהונדס עם קולטי האור (opsin) הגן של עניין הביע בתאים רוב R1-6 בעיניים ולאחר מכן לבצע 7 ארג. חסרונות פוטנציאליים של שיטה זו לא נכללו כל לביטוי הנמוך של קולטי אור החלבון 8, ואת מסגרת זמן הרבה עבור הדור והקרנת חיות טרנסגניות. לעיניים עם סוגים פחות של קולטני אור ברור ספקטרלית, הסתגלות של העין עם מסננים צבעוניים יכולה לעזור עם הפחתת התרומה של סוגי תאים מסוימים על ERG, ובכך לאפשר הערכה של מקסימום הרגיש ספקטרלית 9. הקלטה תאית היא טכניקה אחרת שבה אלקטרודה בסדר impales תא לבין גירוי מוחל. indiv הרשומה אלקטרודה שרקתגובת תא idual כך הקלטה וניתוח תאים בודדים מרובים יכולה להניב רגישויות ספציפיות של תאים מסוגים שונים פיסיולוגי 10-14. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד ניתוח רגישות ספקטרלית, את העקרונות הבסיסיים של תאיים הקלטה עם אלקטרודות חדה הם לשינוי עבור יישומים אחרים. באמצעות הכנה שונה של טיפוס, למשל, באמצעות אלקטרודות קוורץ חדה, אפשר להקליט עמוק באונה האופטית או אזורים אחרים במוח, תלוי השאלה נשאלת. לדוגמא, זמני תגובה של תאי קולטי אור פרט 15, פעילות התא האופטי אונות 16 (lamina, לשד או lobula 17), מוח 18 או גרעינים אחרים 19 יכולים גם להיות מוקלטות עם בטכניקות דומות, או גירויי צבע יכולים להיות מוחלפים עם קיטוב 20 -22 או תנועה לגירויים 23,24. Phototransduction, התהליך שבו אורהאנרגיה נספגת מומר אות אלקטרוכימיים, היא תכונה עתיקה ועד עממית, כמעט כל ימינו חית טווח מערכת 25. הפיגמנט החזותית שנמצאה בתאי קולטי אור ואת אחראית ליזום phototransduction החזותי הוא לרודופסין. Rhodopsins בכל חיים מורכבים של חלבון opsin, חבר של משפחת קולטן המצומד לחלבון G 7 הטרנסממברני, וכן כרומופור הקשורים הנגזר רשתית או מולקולה דומה 26,27. Opsin רצף החומצות האמיניות ומבנה כרומופור להשפיע על ספיגת של rhodopsin אורכי גל שונים של אור. כאשר פוטון נספג על ידי כרומופור rhodopsin הופך מופעל, ייזום מפל G- חלבון בתא שבסופו של דבר מביא לפתיחת תעלות יונים קרום הנכנס 28. בניגוד לרוב נוירונים, תאי קולטי אור לעבור שינויים פוטנציאל מדורגים שניתן למדוד כשינוי יחסי משרעת תגובה עם שינוי גירוי אור. בדרך כלל נתוןסוג קולטי האור מבטא רק גן opsin אחד (אם כי קיימים חריגים 8,10,29-31). ראיית צבעים מתוחכם, מן הסוג שמוצאים בהרבה חוליות ופרוקי רגליים, מושגת עם עיניים מורכבות של מאות או אלפי התאים קולטי האור בכל להביע אחת או מדי פעם יותר סוגים לרודופסין. מידע חזותי הוא נתפס על ידי השוואת תגובות על פני פסיפס קולטי האור באמצעות איתות עצבית במורד מורכבות העין והמוח, וכתוצאה מכך תפיסת דימוי להשלים עם צבע ותנועה. אחרי מדידת תגובות גלם של תא קולט אור לאורכי גל שונה של אור באמצעות הקלטה תאית, אפשר לחשב רגישות ספקטרלית שלה. חישוב זה מתבסס על עיקרון Univariance, הקובע כי תגובתו של קולטי אור תא תלויה במספר הפוטונים הוא סופגים, אך לא על התכונות המיוחדות של הפוטונים הם סופג 32. כל פוטון כי הוא absorbed ידי rhodopsin יניעו אותו סוג של תגובה. בפועל, זה אומר כי משרעת תגובת הגלם של תא תגדל בשל הן גדלה בעוצמת אור (פוטונים יותר לספוג), או שינוי אורך גל לכיוון רגישות לשיאו (הסתברות גבוהה יותר של rhodopsin קליטה גל כי). אנו עושים שימוש בעיקרון זה בהתייחסות תגובות הסלולר בעצימות ידועות אותו הגל לתגובות באורכי גל שונה, ואותה קיצוניות אבל רגישות ביחס ידועה. סוגי תאים מזוהים בדרך כלל על ידי אורך הגל שבו פסגות רגישותם. הנה אנחנו מראים שיטה אחת עבור הקלטה תאית וניתוח הרגישות ספקטרלית של קולטני אור בעיניים של פרפר, עם דגש על ביצוע שיטה זו נגישה יותר לקהילת המחקר הרחבה יותר. למרות הקלטה תאית נותרת נפוצה בספרות, במיוחד ביחס ראיית צבע חרקים, שמצאנו thaתיאורי t של חומרים ושיטות הם בדרך כלל קצרים מכדי לאפשר רבייה של הטכניקה. אנו מציגים שיטה זו בפורמט וידאו במטרה מתיר שהכפול הקל שלה. כמו כן, אנו מתארים את הטכניקה באמצעות ציוד השגה ובמחיר סביר בקלות. אנו מנסים לפתור אזהרות נפוצות, שלעתים קרובות אינם מדווחות, אשר להאט מחקר כאשר אופטימיזציה טכניקה חדשה ולא מוכרת.

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

הקלטה תאית היא טכניקה רבה עצמה להשתמש כדי לקבוע כיצד תא בודד יכול להגיב לגירוי נתון. במחקר חזון, הקלטה תאית כבר היסטורי טכניקה נפוצה בשימוש ללמוד רגישויות של תאי קולטי אור פרט לגירויים באור שונים כי הוא עדיין בשימוש כיום. עם זאת, יש עדיין מחסור של המתודולוגיה מפורט בספרות לחוקרים המעוניינים לשכפל ניסויי הקלטה תאיים בעיניים. כאן אנו מציגים את מקק מודל לבחינת פיזיולוגית עין באופן כללי יותר. תאי קולטי אור חרקים נמצאים קרוב לפני השטח של העין ולכן קלים להגיע, ורבי המנגנונים המעורבים חזון שמורים פני טווח מערכת חיה. אנו מתארים את ההליך הבסיסי הקלטת in vivo התאית של תאי קולטי אור בעיניים של פרפר, עם המטרה של עשיית טכניקה זו לנגישה יותר חוקר עם ניסיון קודם קצת בדוארlectrophysiology. אנחנו מציגים את הציוד הבסיסי הדרוש, איך להכין פרפר חי להקלטה, כיצד להוסיף microelectrode זכוכית לתוך תא בודד, ולבסוף הליך ההקלטה עצם. אנו גם להסביר את הניתוח הבסיסי של נתונים בתגובת גלם לקביעת רגישות ספקטרלית של סוגי תאים בודדים. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד בקביעת רגישות ספקטרלית, גירויים אחרים (למשל, אור מקוטב) וריאציות של השיטה הם החלימו על התקנה זו.

עבור אלמנטים רבים של הגדרת ההקלטה, תיאור בכתב אינו מספק פירוט מספיק. איור 1 הוא סכימטי של הרכיבים מעורבים הגדרת ההקלטה המלאה. באיור 2, ספקטרה הם זממו עבור אור לבן כל מסנן התערבות כדי לתת תחושה של למה בגורם תיקון נחוץ ומה נדרש כדי לחשב את התיקון הזה. איור 3 מציג תמונות ותרשים של הזרוע קרדן המשמש אלה ניסויים. איור 4 היא תמונה מורכבת מראה להקליט את הבמה ואת micromanipulator. איור 5 מראה כמה צעדים בהכנת פרפר לניסוי. לאחר הקלטה מתחילה, שינוי שלילי מתח בתגובת בזק אור אומר כי האלקטרודה הוא מחוץ לתא, כמו איור 6 א. כוחו של התגובה תלויה הקרבה של האלקטרודהלהטות לתא קולטי אור, ואת זוית הפגיעה של בזק האור. התגובה צריכה להיות גדולה (&gt; 30 mV) לפני הטיפ הוא קרוב מספיק לתא כדי לדקור. איור 6 מראים תגובת depolarizing ברורה גירוי אור, מסמל כניסה לתוך תא קולט אור. הפוטנציאל הנח צריך להיות יציבה משרעת התגובה צריך להיות גדול (לפחות 40 mV), אם כי משרעת המוחלטת עשויים להשתנות במידה ניכרת. אנו מודדים בתגובה יחסית, אז זה יותר חשוב כי יחס האות לרעש גבוהה. אם נח שינויים פוטנציאליים מאוד, צורת גל התגובה נראית יוצאת דופן, או התגובה המרבית היא נמוכה מדי, אז השוואת תגובות יחסית בכל מסנני ההפרעות הופכים לבלתי אפשריים. דוגמאות של הקלטות שמישות מוצגות באיור 6 ג, 6 ד. לאחר השלים הקלטה מוצלחת, תגובות ND חייבים להתוות ומשוואת Naka-ראשטון צריכה להיות מצוידת לנתונים 33, shown באיור 7. נתון זה הוא זמם באמצעות סדרת מסנן ND ללא מסננים הפרעה. אם ההקלטה היא יציבה, הנתונים מהסדרה המסננת ND צריכים להיות דומים לפני ואחרי הניסוי. רגישות ספקטרלית נקבע על ידי התאמת המשוואה Naka-ראשטון לעלילה VlogI באיור 7, אז לפתרון עבור (אני) עבור כל תשובה (V) באורך גל נתון, כמוסבר בחישובי סעיף 6 של פרוטוקול. דוגמא מייצגת של רגישות ספקטרלית נגזרה הקלטה יחידה היא להתוות איור 8 א (נא לציין מדוגמא זו אמת נתונים חושב, אבל השיא כבר עבר כמו תוצאה זו היא לא פורסמה). סוגי תאים ניתן לסווג על ידי רגישות שיא באורך גל דומה צורה כללית של הספקטרום הרגיש. סוגי תאים דומים אז בממוצע ואת הרגישות הממוצעת זממה במוטות סטיית התקן בכל אורך גל figuמחדש 8b. רגישויות ספקטרלית של שלושה סוגי תאים טיפוסיים המופיעים חרק מוצגי 8C איור (מוטות גודל וטעייה מחושבות לפי נתונים אמיתיים, אבל הפסגות מוזזות). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig3.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> איור 1:. סכמטי של הקלטת רכיבי רכיבים של נתיב האור, דגימת התקנה, והקלטת חומרה מצוינת. מסלול אופטי יושב על ספסל העץ מחוץ לכלוב פאראדיי. Xe, מנורת קשת קסנון, Cd, קבל הרכבה, Lx, עדשה קמורה, ND, גלגל מסנן צפיפות ניטראלי, CF, הפרעות מסננות, S, תריס, Lc, עדשה קעורה, Co החללית, קרן collimating, פו, סיב אופטי כבל. כלוב פאראדיי יושב עלספסל עץ סביב הדגימה. ספסל העץ יושב מעל אבל לא נוגע שולחן השיש המבודד מבחינת רטט מתחת. הקלטה (RC) והתייחסות אלקטרודות (RF) מחוברת headstage (HS). Rc מוחדר העין (ה) ו- RF מוחדר חלק אחר של הגוף. את headstage הוא חלק מההגדרה מגבר קדם (Pa) מחוץ לכלוב פאראדיי. האות מועבר מן המגבר דרך כמפחית רעש הבלוף (Hb), ולתוך האוסילוסקופ (OS). מתוך אוסצילוסקופ האות עוברת דרך חומרת PowerLab (PLB) ולתוך המחשב הנייד (CPU) שם הוא נקרא על ידי תוכנת LabChart. התריס נשלט על ידי מחולל אותות (FG) אשר עובר דרך ערוץ שני על אוסצילוסקופ, ועלול גם להיות מועבר דרך ערוץ שני על חומרת PowerLab אם איתות הולכים להיות מוקלטים גם כן. <html><img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig5.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> איור 2:. לבן אור והפרעה מסנן ספקטרה ששימשו לחישוב גורמי תיקון ספקטרה נמדד בשלב 2.5 של פרוטוקול מוצגים מתוך 300 כדי 700 ננומטר, עבור אור לבן כמו גם כל אחד 41 מסננים הפרעה. כל ספקטרום מסנן הפרעות נמדד רק עם מסנן כי נתיב האור. T 520 תואם את השטח מתחת הספקטרום עבור המסנן עם ננומטר שיא 520, ו- s 520 תואם את עוצמת האור הלבן באורך גל שיא של המסנן, 520 ננומטר. ערכים אלה משמשים לחישוב גורמי תיקון עבור כל מסנן (במקרה 520 ננומטר זה) כמתואר בשלב 2.6 בפרוטוקול. page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> איור 3:. תיאור של ההיקפי זרוע קרדן בשימוש בניסויים הזרוע קרדן מחזיקה את כבל סיב אופטי ומאפשרת סיבוב כדורי מלא וכוונון זוויתי כך שאור יכול להיות מועברת בזווית הנכונה של שכיחות לתא מוקלט. (א) מלמעלה למטה תצוגה. (ב) צפו מהצד בזווית. מספרים מתאימים לאותו חלק בכל הלוחות. (1) הצלחת התחתונה מאפשרת סיבוב עגול מלא במישור האופקי. (2) הצלחת האנכית מאפשרת סיבוב עגול מלא של הזרוע במישור אנכי. (3) גליל הזה מחזיק את זרוע מתכת עם כבל סיב אופטי על בסופו של דבר, וזה מאפשר במישור האנכי השני של סיבוב מעגלי בניצב (2). (4) כבל הסיב האופטי מתקיים iבמקום n בסוף של הזרוע, והאור מכוון המיקום של דגימת הגדרת הניסוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig1.jpg" /> איור 4:. מרכיבי הגדרת ההקלטה (א) צינור פלסטיק המשמש להחזיק את הדגימה. (ב) מבט מלמעלה על הפלטפורמה שעליה דגימת הצינור מורכבת. (C) מבט צד של פלטפורמת כדור-ו-משותף עם בסיס מגנטי (1). הפניה אלקטרודה שמר נייח עם דבק שעווה בצד של פלטפורמה (2). הפניה אלקטרודה עוטפת קליפ תנין ו מולחמים במקום, מתן שטח מצורף שבו האלקטרודה התייחסות headstage יכול קליפ (3). (ד) אלקטרודה קצה בהגדלה 20X. סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר. (E) שלב, בעל אלקטרודה, והתקנת micromanipulator. את headstage (1) הוא קבוע מעל המנגנון עםחוט הקלטת כסף (2), ואת אלקטרודה ההשוואתית עם קליפ תנין (3) מצורפת. בעל אלקטרודה (4) הוא קבוע על micromanipulator ידנית (5) עם פוסט מתחת שעשוי להיות מותאם עם ידית לתנועה אנכית או עלול להיות דחף או משך לתנועה אופקית של בעל אלקטרודה. הפלטפורמה המגנטית עם דגימה יושבת על הבמה (6) ממש מתחת מחזיק האלקטרודה. (ו) כלוב פאראדיי המקיף את הגדרת הקלטה עם מסך שיכול להיות משך למעלה או למטה בחלק הקדמי. רדיד אלומיניום מושם מתחת כל הציוד עם רפידות גומי על העליונה. כבל הסיב האופטי (1) מוביל אל תוך הכלוב מן המסלול האופטי בחוץ, והיא נוהלה על ידי זרוע קרדן (2) לכיוון הבמה (3). המנגנון הבמה מניפולטור ההקלטה ממוקם בתוך קופסת חול (4) מונחת על שולחן השיש מתחת ההתקנה. כל הציוד האחר נשען על גבי ספסל העץ כי לא נוגע שולחן השיש. תיבת החול שיושבת על גבי שולחן השיש בתוך חורלגזור של שולחן העץ, כך הדגימה מבודדת מבחינת רטט לחלוטין מן הציוד על השולחן מהעץ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig2.jpg" /> איור 5:. פרפר Prep (א) הפרפר מוכנס לתוך הצינור ואת הראש, כנפיים, ואנטנות הם משותקים בשעווה חמה. האלקטרודה האדיש מוכנס לתוך איברי הפה (1), פיסת השעווה יבשה משמשת להחזיק את הבטן (2), וכן רקמות רטובות ממוקמות מאחורי הדגימה. (ב) תקריב של ראש שעווה למטה. העין שתירשם מ (1) נשמר ברור שעווה או פסולת, לבין אלקטרודה ההשוואתית (2) מוכנסת לתוך איברי פי שעווה חמה הוא נמס במהירות על זה כדי לשמור אותו במקום.(ג) יש חור לתוך העין שבו שכבת התאים קולטי האור ורוד-לבן ניתן לראות. פיגמנט שחור hemolymph צהוב נעדרים. (ד) עם נוף צדדי של הדגימה עם אלקטרודה הקלטת זכוכית (1) להציב את העין, ואת האלקטרודה האדיש (2) המצורפת לשלב את הראש, אשר אמור להשלים מעגל כפי שאפשר לראות על האוסילוסקופ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53829/53829fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig6.jpg" style="font-size: 14px;" /> איור 6:. תגובות גלם מהקלטות לדוגמא כל תגובה תואמת בזק אור יחיד של 50 משך msec (פסים שחורים). (א) דוגמא של שינוי המתח השלילי הגדול כי יש לראות רקלפני הכניסה לתא. (ב) הקלטה נקיה צריכה מעט רעשי רקע ומתן מענה depolarizing גדול, בדרך כלל של לפחות 40 mV. (ג) דוגמא של הקלטה ירודה עקב השינוי השלילי האפשרי לאחר השיא הראשי (ראשי חץ). (ד) דוגמא נוספת הקלטה רעה. הפוטנציאל נח עובר תנודות גדולות (פס אדום) ואת הכמות הגדולה של רעש רקע יכול לטשטש את משרעת תגובה (ראש החץ). <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig7.jpg" /> איור 7:. התגובה-Intensity התחבר פונקציה לינארית חוגים מוצקים להראות התגובות השקולות של תא 3.5 כדי 0 OD, עבור התקנה ניסיונית זו. עוצמת אור על סולם לוגריתמים. בעצימויות גבוהות מאוד התגובה רוויה, בעוצמות נמוכות מאוד תגובה קטנה נמשכת במקום לצנוח לאפס לאורך הקו. Tהוא Naka-ראשטון המשוואה 33 הוא מצויד בכושר שאינו ליניארי זה (קו מקווקו). <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig8.jpg" /> איור 8:. דוגמאות רגישות ספקטרלית (א) התגובות של תא בודד נציג הוקלטו רגישות ספקטרלית יחסית חושבה. השיא של תא זה ב 440 ננומטר, כלומר הוא מגיב הטוב ביותר אור הכחול. נתוני תא בודדים עשויים להיראות (שיא ב 380 ננומטר) רועש. (ב) תאים עם אותו לשיא וצורה יחסית הם ממוצעים יחד וברי סטיית התקן מתווספים. הנה, שבעה תאים כחולים משבעה אנשים היו ממוצעי מתן עדויות מוצקות לכך לסוג תא קיים מין זה מקסימאלי רגיש לאור ב 440 ננומטר. (ג) תהליך זה ניתן לחזור לכל סוגי התאים מצאו, זמם יחד. עיני חרקים להשתנות נרחבות רגישויות הרפאים שלהם אלא תוספות טיפוסיותect יכול להיות פסגות המוצגות כאן, ב 370 ננומטר, 440 ננומטר, ו -510 ננומטר. הערה, רגישויות ספקטרלי כל אלה מחושבים באמצעות נתוני אמת, אבל הפסגות הוזזו משום שהנתונים טרם פורסם עבור מין זה.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

11.3K Views.  University of California, Irvine.  הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר. 

Video: Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

יחידה יחידה ב-vivo הקלטות של התצלובת הראייה של עכברוש

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

תכנון והרכבה של Microdrive קל במיוחד ממונע להקלטות עצביות כרוניות בבעלי חיים קטנים

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.