This research was supported by a National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) through the National Research Foundation of Korea funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning. The authors also acknowledge a KAIST Systems Healthcare Program.

1. הכנת תבניות micropatterned והידרוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר דפוסי מיקרו בקנה מידה הרצויים באמצעות SU-8 photoresist על פני השטח של פרוסות סיליקון באמצעות 15,17 טכניקת photolithography סטנדרטי שני שלבים לתבניות יציקת PDMS. הדוגמא המוצגת משתמשת דפוס כבד כמו lobule-רשת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את PDMS ופתרון סוכן ריפוי עם יחס של 1: 5 (כלומר, 12.5 גרם של PDMS ו -2.5 גרם של סוכן ריפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את g 15 של הפתרון ביסודיות, דגה הבועות בתא ואקום, ולאחר מכן להפיץ את הפתרון המעורב על גבי משטח micropatterned של פרוסות סיליקון באופן שווה בתוך צלחת ליהוק נייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות סיליקון על צלחת מחוממת 65 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות על משטח שטוח כדי לרפא את PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PDMS נרפא מצלחת הליהוק ופרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצוות של PDMS ולמקם אותו על גבי צלחת פטרי 100 מ&quot;מ קוטר עםבצד עד micropatterned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את micropatterned PDMS נרפא בצלחת פטרי באמצעות אתנול 70% ומים מזוקקים לעיקור ראשוני. לאחר מכן, לייבש אותם לחלוטין במשך 10 דקות בתנור על 65 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים ומערבבים O / N 3 גרם של חומרים פעילי שטח nonionic אבקה במים מזוקקים 100 מיליליטר, יצירת 3% (w / v) פתרון ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבניות PDMS micropatterned בשואב פלזמה ולנקות אותם דקות 1 (85 W, 0.73 mbar) כדי ליצור משטח הידרופילי, כדי להקל על התוספת של נוזלים מימיים. לאחר מכן, מעיל פני השטח של PDMS עם פתרון 100 מיליליטר השטח לפחות 3 שעות (Oro / N) באמצעות נדנדה מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הפתרון פעילי שטח מתבניות PDMS ולייבש אותם לחלוטין בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, לעקר כל עובש micropatterned על ידי חשיפה לקרינת אולטרה סגולה (UV) מעל 30 דקות. </li></ol> 2. מכין את ההשעיה התא מבשר Hydrogel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללהכין מבשר הידרוג&#39;ל, לפזר 0.1 גרם של אבקת אלגינט נתרן ב 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS), יצירת 1% (w / v) מבשר אלגינט. לפזר את האבקה לחלוטין, דגירה ולערבב אותם O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מחובר למזרק 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי HepG2 בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי 1% פניצילין, סטרפטומיצין על צלחת תרבית רקמה קונבנציונלית עד 70% - מפגש 80% בחממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים באמצעות פעם PBS, ולאחר מכן trypsinize על ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של 0.05% טריפסין- EDTA במשך 4 דקות ב5% CO 2 באינקובטור humidified על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התאים שנקטפו מצלחת התרבות ב 250 XG במשך 3 דקות וגלולות באמצעות 1 מיליליטר של PBS לאחר הסרת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים מופצים אחת בPBS באמצעות תא אוטומטידֶלְפֵּק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה ב 250 XG במשך 3 דקות והסרת PBS, להוסיף 1 מיליליטר של 1% (w / v) של פתרון אלגינט נתרן לתא גלולה שנותרו ולערבב אותם בעדינות באמצעות pipetting. צפיפות הזריעה הסופית של התאים צריכה להיות 5 x 10 יוני - 10 יולי תאים / מיליליטר. דגירה ההשעיה התא / הידרוג&#39;ל בחממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. טעינה וcross-linking של תא / השעיה Hydrogel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1.47 גרם של סידן כלורי ליבש בשל DDH 2 O 100 מיליליטר לייצר מגיב cross-linking (כלומר, 100 מ&quot;מ CaCl 2 · 2H 2 O בDDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הפנים של אדים עם מתמר קולי באמצעות אתנול 70%, ולמלא אותו עם 200 מיליליטר של מגיב cross-linking. מכשיר האדים הוא 110 מ&quot;מ רחב, ארוך 300 מ&quot;מ ו -170 מ&quot;מ עמוק (כלומר, 110 מ&quot;מ x 300 מ&quot;מ x 170 מ&quot;מ (ר x H x D)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את PDMS micropatternedתבניות בשואב פלזמה ולנקות אותם דקות 1 ב 85 W כדי ליצור משטח הידרופילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתמדה לטעון 7.2 μl של ההשעיה התא / הידרוג&#39;ל המעורב היטב בקצה micropattern בעובש. הדוגמא המוצגת משתמשת דפוס כבד כמו lobule-רשת (איור 1). הנפח של ההשעיה תלויה בדפוס הטופוגרפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג gelation של ההשעיה התא / הידרוג&#39;ל, להדליק את מכשיר האדים ולוודא שמכשיר האדים מייצר ערפל של מגיב cross-linking. לרסס את מגיב cross-linking על מבשר הידרוג&#39;ל למשך 5 דקות, מכסה את פני השטח הטופוגרפיים של תבניות PDMS בטווח של 5 סנטימטר. הערה: מרחקים ארוכים יותר וקצר יותר מאשר 5 סנטימטר יכול לגרום gelation שלמה ואחידה, בהתאמה. ודא שיש לו את מכשיר האדים שיעור ריסוס של 250 מיליליטר / שעה, ייצור 20 מיליליטר של ערפל של המגיב cross-linking ב5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות תהליך cross-linking, לכבות את מכשיר האדים ולמלא את מו PDMSLDS עם PBS. </li></ol> 4. טיפול בגיליונות בודד מודולרי Hydrogel <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את כל גיליון הידרוג&#39;ל קשוח מתבניות micropatterned באמצעות pipetting PBS בעדינות סביב גיליון הידרוג&#39;ל באמצעות קצה פיפטה 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים כל גיליון הידרוג&#39;ל צף באמצעות קצה קצה פיפטה 1,000 μl-לחתוך סוף. לכל גיליון הידרוג&#39;ל כבד כמו lobule-רשת ממדים של 8 מ&quot;מ x 8.7 מ&quot;מ, ולהיות 100 - 200 מיקרומטר עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שכבה יחידה של גיליון הידרוג&#39;ל ל1 מיליליטר של DMEM בצלחת 12-היטב, ותרבות התאים במבחנה באופן צף באמצעות הידרוג&#39;ל לבנות כמרכיב יחידה בצלחת 12 גם יותר משבוע ב5 % CO 2 humidified חממה ב 37 מעלות צלזיוס. להחליף את התרבות בינונית בכל יום אחר. </li></ol> 5. גיליונות Hydrogel עצרת של רב שכבתיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.1-1.5 לייצר מסגרת PDMS עם ממדים של 18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ x 4 מ&quot;מ (x Wx D H), ואשר מכיל מבני 170 מיקרומטר-גבוה עמוד במשטח נמוך יותר. השתמש 42 גרם של התערובת של PDMS וסוכן ריפוי, עם אותו היחס כמו בשלב 1.2. מניחים תבנית פוליקרבונט מיוחדת על פרוסות סיליקון למסגרת PDMS ליצור מסגרת פנימית עם ממדים של 8 מ&quot;מ x 9 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ (ר x H x D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מסגרת PDMS וניירות לסנן ניילון 180 מיקרומטר-נקבוביות שקועות במים ופינצטה מזוקקים בחיטוי במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המסגרת מעוקרת PDMS על רבע מפיסת נייר סינון ניילון (בקוטר של 5 סנטימטרים) בצלחת פטרי בקוטר 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את גיליון הידרוג&#39;ל מודולרי לתוך הפנים של מסגרת PDMS באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl-לחתוך סוף. גיליונות הידרוג&#39;ל המשמשים להרכבה צריכים להיות מתורבת לפחות יום אחרי שהם היו מפוברקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הקצה של כל גיליון הידרוג&#39;ל מודולרי עם מסגרת PDMS באמצעות קצה פיפטה 200 μl ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.4 ו -5.5 שימוש בגיליונות הידרוג&#39;ל מודולרי כדי ליצור ערימה של 4 - 6 שכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות על ידי זורם אותו דרך מבני העמוד בתחתית מסגרת PDMS. לאחר מכן להוסיף 2 μl של פתרון אלגינט (2% w / v) בפינה של המבנה רב שכבתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס ערפל של מגיב cross-linking למשך 30 שניות על המבנה רב שכבתי לצרף את הקצוות של כל שכבה עם אלה של אחר. השתמש 2 מיליליטר של ערפל של מגיב cross-linking (בשיעור ריסוס של 250 מיליליטר / שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המבנה רב שכבתי בעדינות עם 400 μl DMEM ולהסיר את מסגרת PDMS באמצעות פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את המבנה רב-שכבתי מנייר הסינון בעדינות על ידי ניגוב עם תא המרים הבא התוספת של 4 מיליליטר של DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר לבנות לצלחת 6-היטב המכילה 3 מיליליטר של DMEM באמצעות נייר סינון, ותרבות התאים במבחנה באופן צף, עם הידרוג&#39;ל לבנות כרב שכבתיפיגום רב היקף סלולארי בצלחת 6-גם יותר משבוע בחממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. להחליף את התרבות בינונית בכל יום אחר. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li><li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities.">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li><li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels.">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li><li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas.">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li><li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays.">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions.">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li><li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel.">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li><li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks.">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117 (2011).</li><li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules.">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li><li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking.">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions.">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol&#8722;Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures.">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol&#8722;Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction.">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li><li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters.">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li><li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip.">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li><li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels.">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).</li><li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids.">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li><li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+biomaterial.">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li><li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering.">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li><li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials.">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה של ​​בודה גיליונות הידרוג&#39;ל מודולרי, והרכבתם כדי ליצור פיגומים סלולריים 3D. לבנות מבני אלגינט דוגמת ברור בזמן קצר, אנחנו צריכים לזהות תהליך cross-linking שיכול ליצור מבנים קשיחים מספיק כדי לשמור על micropatterns המורכב מהתבנית, כמו גם לשמור על כדאיות תא וחילוף חומרים. פיתחנו תהליך cross-linking, כולל מעבר סול-ג&#39;ל, לרסס מגיב cross-linking באמצעות מכשיר אדים בצורה של ערפל. ללא תהליך cross-linking זה, דפוסי מיקרו בקנה המידה לא יכולים להיות שנוצרו בצורה של הידרוג&#39;ל דק לבנות עם העומק המוגבל מתרחב (100 - 200 מיקרומטר), שבו יש חדירות גבוהות מתרחבות למטבוליטים וחומרים מזינים. יתר על כן, בהשוואה לשיטות קיימות המבוסס על דיפוזיה, שדורשות 30 - 60 דקות, 18 - 20 ti cross-linkingשלי היה קצר יחסית (3 - 5 דקות). יתר על כן, זה היה גם מאתגר כדי לתפעל את גיליונות הידרוג&#39;ל הדקים, שהיו יציבים מכניים רק במדיום נוזלי. כפי שניתן לראות באיור 1, מבנה הידרוג&#39;ל הדק טופל בפשטות וביציבות ומניפולציות באמצעות קצה קונבנציונלי-לחתוך סוף להעביר לידי בין תנאי culturing שונים. באמצעות שימוש בטכניקות דור ומניפולציה, אנו יכולים לספק לא רק גיליון שכבה אחת באופן צף עבור יישומים פוטנציאליים במבחני סמים אבל מבנים רב שכבתיים גם נערמו, עם יישומים פוטנציאליים כפיגומים למבנים כמו רקמות. יכולות להיות שנוצרו ארכיטקטורות סלולריות רב שכבתיות ידי ערמת גיליונות הידרוג&#39;ל שכבה אחת מודולרי (איור 3 א). כל גיליון הידרוג&#39;ל מודולרית עשוי להכיל סוגי תאים שונים, ועלול להיות חשוף לתנאי תרבות שונים. מבנים רב שכבתיים אלה עשויים אז להיות סלקטיבי עאסםדימם. עם זאת, גיליונות הידרוג&#39;ל פשוט לערום עלולים להוביל לנימק תא בתוך המבנה התאסף כאשר העומק הכולל עולה על עומק diffusive המוגבל (איור 3 ג). כדי להתגבר על בעיה זו, יהיה צורך ליישר דפוסי micromesh, כגון משתלב כמו אונת כבד, כאשר גיליונות הידרוג&#39;ל הרב שכבתיים הם התאספו. לפיכך, אנו דורשים מסגרת PDMS עם אותו דפוס הפנים כגבול של גיליון הידרוג&#39;ל כדי ליישר את גיליונות הידרוג&#39;ל נערמו. לפיכך, micropatterns חור-מערך מיושר בגיליונות הידרוג&#39;ל רשת כינסו יכול לשמש כדי ליצור מבני צינור מורחבים, המאפשר תחבורה תזונתית יעילה יותר לכדאיויות תא משופרות (איור 3). מגבלה אחת של טכניקה זו היא היעדר אינטראקציות תא-מטריצה ​​בהידרוג&#39;ל אלגינט. אלגינט לא יכול לספק ligands הידבקות התא לin vivo דמוי אינטראקציות התא-מטריקס; 21 עם זאת, היא עושה אתאה השפעות מכאניות והנדסיות כפיגום מתמצת תאי 3D עם אינטראקציות תא-תא. לתאים ראשוניים ותאי גזע, אלגינט יכול לשמש השינוי הבא עם פפטידים המכיל RGD, 21 או בשילוב עם קולגן או ג&#39;לטין. 14,18 מגבלה נוספת היא שברגע גיליונות הידרוג&#39;ל-משובץ תא מיוצרים עם צפיפות תאים נמוכה מתחת 5 x 10 6 תאים / מיליליטר, בנייה של מבנה רב-שכבתי יכולה לגרום לקבצים מצורפים חלשים בין סדיני הידרוג&#39;ל כי רק הקצה של המבנה נקבע על ידי שימוש באלגינט נוסף. עם זאת, יכולות להיות שנערמו השכבות מרוכזת כפיגום יחיד באמצעות מבנה ניקוז מתחת למסגרת PDMS. בנוסף, צפיפות גבוהה יותר של תאים בגיליונות הידרוג&#39;ל יכולה להתרבות על פני השטח, כמו גם בתוך השכבה אחרי תרבות יום אחד, שיסייע לצרף קבצים בין שכבות כפי שמוצג באיור 3 א. Fabrica גיליון הידרוג&#39;לטכניקת tion והמניפולציה שתוארה כאן יכולה להיות מותאמת למערכות התרבות במבחנה והדגמים סלולריים כמו רקמות לספק in vivo דמוי מייקרו-סביבה ליישומים, כוללים מבחני סלולריים ואיברים מלאכותיים הנדסה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מבחני תרופה מבוסס תאים ומחקרים ביולוגיים הדורשים מיקרו שונה גיאומטרי 3D הסלולרי וmacroenvironments המשלבים תאים שונים או סוגי הידרוג&#39;ל.

הידרוג במיוחד מבטיח ביו-חומרים, וצפויים להיות חשוב בביולוגיה בסיסית, מבחני תרופתיים ורפואה. 1 ​​Biofabrication של מבנים תאיים המבוסס על הידרוג&#39;ל הוצע להפחית את השימוש בניסויים בבעלי חיים, 2,3 להחליף רקמות להשתלה, 4 ולשפר מבחני מבוססי תאים. 5,6 חומרים המכילים מים (הידרו) viscoelastic (ג &#39;) לאפשר למספר גדול של תאים להיות כמוס ומתוחזק במבנה פיגום לשלוט microenvironment הסלולרי 3D. בשילוב עם ההדרכה של טכנולוגיות מייקרו-נוזליות או micropatterning, הגיאומטריה של מבני הידרוג&#39;ל ניתן לשלוט באופן מדויק בקנה המידה הסלולרית. עד כה, מגוון צורות של הידרוג&#39;ל, כוללים חלקיקים, 7 - 9 סיבים, 10 - 12 וגיליונות, 13-15 שימשו כיחידות בנייה במלמטה למעלה approכואב לייצור של ארכיטקטורות רב-תאיות מאקרו בקנה מידה. שני חלקיקים מבוססי הידרוג&#39;ל וסיבים היו מפוברקים בקלות ובמהירות ליישומים כמו סביבות סלולריות מיקרו בקנה מידה, עם פקדי fluidic באמצעות מכשירי microfluidic. עם זאת, כיחידות הבסיסיות של רקמות מהונדסות, זה יהיה מסובך לסדר אותם מחדש ולהגדלת נפחם כמבני מאקרו בקנה מידה. 16 זה קשה יותר להשיג מבנים בקנה המידה מאקרו מאשר לייצר מודולים בסיסיים בגודל מיקרון. יחידות כמו גיליונות של מבנים מבוססי הידרוג&#39;ל יכולות לשמש כדי להגביר את עוצמת הקול של פיגומים באמצעות תהליך הרכבה פשוט. Consequentially, שכבות שנערמו של גיליונות הידרוג&#39;ל לספק לא רק גידול נפח אלא גם הארכה גיאומטרית בחלל 3D. יש לנו דיווח שיטה של בודה גיליונות הידרוג&#39;ל micropatterned, 13 בעבר - 15 יחד עם ההרכבה שלהם לרבים-שכבארכיטקטורות סלולריות אבודות של. הטכניקה מאפשרת micropatterning מורכבת ועיצוב המודולרי של מבנים תאיים באמצעות תהליך ערימה של מבנים רב שכבתיים. דרך הייצור של גיליונות מוערמים מודולרי הידרוג&#39;ל, הmicropatterned, יכול להתממש מערכת תרבית תאי 3D עם מייקרו-סביבה סלולרית מאקרו בקנה מידה מבוקר. פרוטוקול וידאו זה מתאר שיטה פשוטה אך רבת עוצמה ייצור שיכול לשמש לבניית גיליונות הידרוג&#39;ל מודולרי, המבוססים על קו הכבד האנושי תא קרצינומה (HepG2). אנו מדגימים זאת מניפולציה פשוטה של ​​גיליונות הידרוג&#39;ל אלה בדוגמת מודולרי, וההרכבה שלהם לתוך מבנה רב-שכבתי.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Powdered nonionic surfactant&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alginic acid sodium salt, low viscosity</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic humidifier</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr</td></tr><tr><td>Nylon net filter hydrofilic, 180 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate mold</td><td></td><td></td><td>Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern</td></tr></tbody></table>

construction of modular hydrogel sheets for micropatterned macro-scaled 3d cellular architecture

ניתן בדוגמת הידרוג במייקרו בקנה המידה תוך שימוש בטכנולוגיות מייקרו-נוזליות או micropatterning לספק in vivo דמוי גיאומטריה רקמה תלת-ממדי (3D). בונה מבוססת הידרוג&#39;ל 3D וכתוצאה מהסלולרית הוכנס כחלופה לניסויים בבעלי חיים ללימודים מתקדמים ביולוגיים, מבחני תרופתיים ויישומי השתלת איברים. למרות שיכולים להיות מפוברקים בקלות חלקיקים מבוסס הידרוג&#39;ל וסיבים, קשה לתפעל אותם לשיקום רקמות. בסרטון הזה, אנו מתארים שיטת ייצור לגיליונות הידרוג&#39;ל אלגינט micropatterned, יחד עם ההרכבה שלהם כדי ליצור מערכת תרבית תאי 3D מאקרו בקנה מידה עם מייקרו-סביבה סלולרית מבוקר. שימוש בטופס ערפל סוכן gelling סידן של, גיליונות הידרוג&#39;ל דקים נוצרים בקלות עם עובי בטווח של 100 - 200 מיקרומטר, ועם micropatterns המדויק. אז יכולים להיות מתורבת תאים עם ההדרכה הגיאומטרית של גיליונות הידרוג&#39;ל בתנאים בודד. יתר על כן, גיליונות הידרוג&#39;ל ניתן להשפיע בקלות באמצעות micropipette עם קצה לחתוך הסוף, וניתן להרכיב למבנים רב שכבתיים על ידי לערום אותם באמצעות polydimethylsiloxane דוגמת מסגרת (PDMS). גיליונות אלה מודולרי הידרוג&#39;ל, אשר יכול להיות מפוברק באמצעות תהליך קליל, יש יישומים פוטנציאליים של מבחני במבחנה סמים ומחקרים ביולוגיים, כוללים מחקרים פונקציונליים של מיקרו וmacrostructure ושיקום רקמות.

יש לנו תיארנו את הייצור ומניפולציה של גיליונות בודדים הידרוג&#39;ל סלולריים. כפי שניתן לראות באיור 1, אנו מפוברקים תבניות PDMS micropatterned, והידרוג&#39;ל המכיל תאים הועמס על גבי משטח הידרופילי של תבניות אלה ושימוש במכשיר אדים כדי ליצור ערפל תרסיס של gelling סוכן צולבים. לאחר שחרור מהתבניות, תאי HepG2 היו בתרבית בגיליונות בודד הידרוג&#39;ל עם דפוסים שונים (איור 2). לפיכך, גיליונות הידרוג&#39;ל הדקים סיפקו סביבת תרבות 3D. יתר על כן, גיליונות הידרוג&#39;ל מודולרי ניתן שנאספו על ידי שכבות הגיליונות באמצעות micropipette עם טיפ-לחתוך סוף, ובאמצעות מסגרת PDMS, המאפשרת תרבות 3D מאקרו בקנה מידת תא (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" /> איור 1. תזרים צ&#39;הRT מציג המצאה של גיליון Hydrogel וגיליונות Hydrogel רב שכבתיים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig2.jpg" /> איור 2. תרבות האוב 3D סלולארי בגיליונות Hydrogel שונים. שיטת הייצור של ריסוס מגיב cross-linking אפשרו דפוסים מדויקים של הידרוג&#39;ל אלגינט במייקרו בקנה המידה. יתר על כן, יכולים להיות שנקטפו גיליונות הידרוג&#39;ל מפוברקים מהתבנית ומניפולציות בקלות בתנאים בודד. תאי HepG2 היו בדוגמת ותרבותית בגיליון הידרוג&#39;ל השטוח (), גיליונות הידרוג&#39;ל עם עמודי משושים (B), רשת (C), רשת כמו אונת כבד (ד &#39;), מערך של חורים (E), וmultiplmicrofibers דואר כמו microcomb (F). הברים בקנה מידה הם כדלקמן:. 500 מיקרומטר (A, D, F), 100 מיקרומטר (B, C), ו- 2 מ&quot;מ (E) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig3.jpg" /> איור 3. אסיפה של גיליונות Hydrogel micropatterned למאקרו בקנה מידת בונה סלולרית. סוגים שונים של גיליון הידרוג&#39;ל יכול להרכיב באמצעות הערמת שכבה אחר שכבה עם יישור, כולל ההרכבה של חמישה גיליונות הידרוג&#39;ל המכילים תאי HepG2 מוכתמות בקרינה ירוקה ותאי NIH3T3 מוכתם בקרינה אדומה (). הרכבה של גיליונות הידרוג&#39;ל micropatterned עם מבנה מורחב צינור (ב &#39;) הניתנת tha כדאיות תא גבוה יותרn שגיליונות שאינן בדוגמת הידרוג&#39;ל (ג) לאחר 7 ימים. הכדאיות הוערכה על ידי צביעת תאי HepG2 עם calcein-AM (תאי חיים מוצגים כירוק) וhomodimer-1 ethidium (תאים מתים מוצגים כאדום). ברים סולם:. 500 מיקרומטר (א) ו -200 מיקרומטר (B, C) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig3large.jpg" target="_blank">​​אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture at JoVE.com

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

construction-modular-hydrogel-sheets-for-micropatterned-macro-scaled

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment. 

Video: Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biochemistry

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

Immunology and Infection

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

תוסף טכניקת הייצור עבור הזיוף נתיישב ומהירה של מבוססי הידרוג Micromachines עם רכיבים תגובה מגנטית

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its restrictions. Producing few repeatable results of pattern formation deteriorates the analysis of the mechanisms underlying the self-organization. Reducing variation in initial culture conditions, such as the cell density and distribution in the extracellular matrix (ECM), is crucial to enhance the repeatability of a 3D culture. In this article, we demonstrate a simple but robust procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain highly repeatable pattern formations. A micromold with a desired shape was fabricated by using photolithography or a machining process, and it formed a 3D pocket in the ECM contained in a hybrid gel cube (HGC). Highly concentrated cells were then injected in the pocket so that the cell cluster shape matched with the fabricated mold shape. The employed HGC allowed multi-directional scanning by its rotation, which enabled high-resolution imaging and the capture of the entire tissue structure even though a low-magnification lens was used. Normal human bronchial epithelial cells were used to demonstrate the methodology.&#160;

We present a procedure for controlling the initial cell cluster shape in a 3D extracellular matrix to obtain a repeatable pattern formation. A cubic device containing two different hydrogels is employed to achieve multi-directional imaging for tissue pattern formation.

שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions without further additives. Continuous photoinitiated on-chip gelation enables variation of the microgel aspect ratio, which determines the building block properties for the obtained constructs. Glycidyl methacrylate (GMA) or 2-aminoethyl methacrylate (AMA) monomers are copolymerized into the microgel network based on polyethylene glycol (PEG) star-polymers to achieve either epoxy or amine functionality. A focusing oil flow is introduced into the microfluidic outlet structure to ensure continuous collection of the functionalized microgel rods. Based on a recent publication, microgel rod-based constructs result in larger pores of several hundred micrometers and, at the same time, lead to overall higher scaffold stability in comparison to a spherical-based model. In this way, it is possible to produce higher-volume constructs with more free volume while reducing the amount of material required. The interlinked macroporous scaffolds can be picked up and transported without damage or disintegration. Amine and epoxy groups not involved in interlinking remain active and can be used independently for post-modification. This protocol describes an optimized method for the fabrication of microgel rods to form macroporous interlinked scaffolds that can be utilized for subsequent cell experiments.

Microgel rods with complementary reactive groups are produced via microfluidics with the ability to interlink in aqueous solution. The anisometric microgels jam and interlink into stable constructs with larger pores compared to spherical-based systems. Microgels modified with GRGDS-PC form macroporous 3D constructs that can be used for cell culture.

פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...