We appreciate the colleagues in Taiwan Cetacean Society, Marine Biology and Cetacean Research Center of National Cheng Kung Univerisy, Farglory Ocean Park, and Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi Universiy for sample collection. This project was funded by grant to WCY from the Council of Agriculture of Taiwan (100AS-02.1-FB99).

<ol>
	<li>Robards, M. D., Reeves, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+extent+and+character+of+marine+mammal+consumption+by+humans:+1970-2009.">The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009.</a> Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).</li><li>Booth, S., Zeller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury,+food+webs,+and+marine+mammals:+implications+of+diet+and+climate+change+for+human+health.">Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health.</a> Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).</li><li>Endo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+mercury,+methyl+mercury,+and+selenium+levels+in+the+red+meat+of+small+cetaceans+sold+for+human+consumption+in+Japan.">Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan.</a> Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).</li><li>Tryland, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pathogens+in+marine+mammal+meat.">Human pathogens in marine mammal meat.</a> Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).</li><li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick+and+simple+method+for+the+identification+of+meat+species+and+meat+products+by+PCR+assay.">A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay.</a> Meat Sci. 51, 143-148 (1999).</li><li>Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+identification+of+southern+hemisphere+beaked+whales+(Cetacea:+Ziphiidae).">Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae).</a> Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).</li><li>Dalmasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+feedstuffs.">A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs.</a> Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).</li><li>Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+cooked+sausages.">PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages.</a> Meat Sci. 77, 649-653 (2007).</li><li>Liu, L., Chen, F. -. C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Monoclonal+Antibody-based+Sandwich+ELISA+for+the+Detection+of+Porcine+Skeletal+Muscle+in+Meat+and+Feed+Products.">Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products.</a> J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).</li><li>Kotoura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sandwich+ELISA+for+the+Determination+of+Beef+Meat+Content+in+Processed+Foods.">A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods.</a> Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).</li><li>Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+reliable+identification+of+imported+Pangasius+catfish.">Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish.</a> J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).</li><li>Ross, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+surveillance:+web-based+molecular+identification+of+whales,+dolphins,+and+porpoises.">DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises.</a> J.Hered. 94, 111-114 (2003).</li><li>Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+lateral+flow+test+strip+technology+for+detection+of+infectious+agents+and+chemical+contaminants:+a+review.">Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).</li><li>Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+and+methods+for+the+detection+of+processed+animal+proteins+in+animal+feedstuffs.">Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs.</a> Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).</li><li>Rao, Q., Hsieh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+commercial+lateral+flow+feed+test+for+rapid+detection+of+beef+and+sheep+content+in+raw+and+cooked+meats.">Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats.</a> Meat Sci. 76, 489-494 (2007).</li><li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGA5:+molecular+evolutionary+genetics+analysis+using+maximum+likelihood,+evolutionary+distance,+and+maximum+parsimony+methods.">MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.</a> Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).</li><li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structure+of+myoglobin:+the+complete+immunochemical+anatomy+of+a+protein+and+conclusions+relating+to+antigenic+structures+of+proteins.">Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins.</a> Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).</li><li>Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+technology+for+the+generation+of+monoclonal+antibodies.">Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).</li><li>Kao, D. J., Hodges, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+a+synthetic+peptide+immunogen+over+a+protein+immunogen+in+the+development+of+an+anti-pilus+vaccine+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa.</a> Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).</li><li>Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoglobin+in+pelagic+small+cetaceans.">Myoglobin in pelagic small cetaceans.</a> J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).</li><li>Lo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immune+colloidal+gold+strip+for+cetacean+meat+restraining+illegal+trade+and+consumption:+implications+for+conservation+and+public+health.">Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health.</a> PLoS ONE. 8, e60704 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

באמצעות פפטיד סינטטי מצומדות לחלבון מוביל להפליא יעיל יותר בהשוואה לחלבון מאותו המקור שלה. עבור טכניקת כריך מבוסס, כי מב מפותחת באמצעות אפיטופים עם מיקומים יחסיים ידועים, שני מהבז במחקר זה אינו צפוי להפריע זה אינטראקציה של אחרים עם epitope אנטיגן היעד. יתר על כן, תגובתיות בין חלבון יליד הנוגדן של עכברים שחוסנו עם פפטיד סינתטי המצומד עשוי להיות חזק יותר תגובתיות בין חלבון יליד הנוגדן המופק חלבון יליד 19. השימוש conjugates פפטיד סינתטי מומלץ ולכן לפרוצדורות חיסון יעיל דור מב אנטי-פפטיד המתאים. המבנה של חלבון בעיקר כרוך רצף של חומצות אמינו בשרשרת פוליפפטיד. יש שרשרת צידו כל חומצת אמינו המוביל מאפיינים ספציפיים, ומעט שינוי ACI אמינורצף ד תוצאת שינויים במבנה. בגלל פפטידים עם אורך של 10-20 חומצות אמינו הם אידיאליים עבור שמכינה את הנוגדנים, אורך פפטידים סינתטיים (אימונוגן) בשעה באזור C-terminal הוגדל כדי להבטיח שהאזור אנטיגני הליבה יוכר. לכן, שאריות חומצת אמינו בין MBS של בעלי חיים שונים וכתוצאה מכך מבנים epitope שונים יכולים להיות מובחן ביעילות. לדוגמא, איור 3 א מציג את עיצוב פפטיד ציין תורם CGF5H9 מגיב חזק עם יונקים ימיים, אבל באופן שלילי עם חותמות. דוגמא נוספת היא הזיקות המובחנות כלפי תרנגולות וכלבים של CGF5H9 למרות העוף יש רצף זהה לזה של הכלב באתר אנטיגני הליבה 2. זה מצביע על כך את ההבדל רצף באזור החיצוני עלול להוביל לשינוי המבנה ובכך משתנה מחייב זיקה בין אנטיגן נוגדן. כתם המערבי, כתם נקודה, ובעקיפין ELISA שימשוהשיטה שלנו לסינון מבז מתאים. כתם המערבי נעשה שימוש נרחב כדי לזהות חלבונים ספציפיים תמצית רקמות או homogenate. בטכניקה זו, ג&#39;ל אלקטרופורזה משמש להפריד חלבונים מפוגל לפי אורך של פוליפפטיד. לכן, אפשר לאשר אם האות מציין את המשקל המולקולרי חלבון חזה. עם זאת, תוצאת זיהוי (חיובית או שלילית, חזקה או חלשה אות) לא יכולה הייתה לייצג את המצב האמיתי של נוגדנים לאנטיגן מחייב כי חלבונים מפוגלים משמשים. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש כתם נקודה להקרנת שלב שני. Dot הכתם הוא טכניקה לזיהוי חלבונים. היא מייצגת פישוט שיטת כתם המערבי. בשנת כתם נקודה, תערובת המכילה המולקולה כדי להתגלות מוחל ישירות על קרום כנקודה. זאת בשונה כתם מערבי כי דגימות חלבון אינן מפוגלות. לציין כי טכניקה זו מציעה שום מידע על הגודל של biomolecule היעד, ונקודה אחת תופיע אם שני מוlecules בגדלים שונים מזוהה. לבסוף, עקיף ELISA משמש עבור assay מחייב ליגנד כדי ליצור אות כי ניתן לכמת כראוי. הוא מספק מידע נוסף מאפיינים מב ובכך מקל על בניית הרצועה. ריכוזים של Mb בשריר משתנים בהתאם למיקום האוסף. לדוגמא, שרירים שחיו (שרירים ציריים) ב יונקים ימיים בעלי תכולה גבוהה משמעותי של Mb לעומת שרירים הלא שחייה, דגימות מן היונקים ימיים צעירים היו מוכנות לקבל ריכוז Mb נמוך משום שעולה הריכוז Mb לאורך של בעל חי 20. בתחילה, CSF1H13, אשר רק לוכד את Mb של יונקים ימיים וכלבי ים, נועד להיות קולואיד שכותרתו זהב ולהיות גילוי נוגדנים, ו CGF5H9, מכיר Mb של מינים רבים, יהיה נוגדן ללכוד על פס הבדיקה. החוקרים שיערו כי נוגדנים גילוי צריך להיות ספציפי יותר הנוגדן ללכוד צריךלהיות כללי יותר. עם זאת, איתות חיובית חלשה נמצאת על קו הבדיקה כאשר דגימות cetacean עם ריכוזים נמוכים Mb שמשו (מידע לא מוצג). הבעיה נפתרה כאשר עמדות שני מהבז התהפכו כמתואר תוצאות הנציג. איתות טובה גם הוצגה במשך cetacean יילוד (לווייתן של אומורה תקוע) (איור 4). לא ברור האם המאפיינים וריכוז מבזים לתרום לתופעה זו. במחקר זה, דגימות שריר קפוא מופשר הומוגני עם PBS שימשו על רצועת הבדיקה. תנאי מדגם אחרים ושיטות כנות עשויים להשפיע על התוצאה. לדוגמה, חלבון מלח מסיס כגון Mb צריך להיות חילוץ באמצעות PBS ולא מים טהורים. אחרת, החילוץ עלול להיות לקוי, אשר עלול להוביל לתוצאה בלתי סוטה. מאגר החילוץ המתאים: יחס מדגם הבשר הוא אחראי במידה מסוימת על הפרשנות המוצלחת של תוצאת הרצועה. amou גדולNT (0.3 גרם ב 1 מ&quot;ל חיץ) של דגימות בקרה (למשל, חיות בית) יכול לגרום תוצאה חיובית והרקע מטושטש. עם זאת, היחס ששימשו במחקר זה (1: 0.03) הפיק תוצאות נכונות. רק דגימות שריר טריות יכולות לשמש מבחן ברצועה זו. חלבון יכול להיות הידרוליזה או מפוגל לאחר טיפולים מסוימים (כגון ריפוי על ידי סויה רתיחה), אשר עשוי לגרום לתוצאות חיוביות לא רק עבור דגימות שריר cetacean אלא גם דגימות מבעלי חיים אחרים (מידע לא מוצג). לכן, הוא הציע מקורות מדגם משתנים ותוכניות עיצוב בנייה שונות אמורים לשמש במהלך פיתוח רצועה. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את ההתפתחות שני מבז תגובתי בחריפות Mb של יונקים ימיים, ו מבזים אלה חלים על רצועת בדיקה מהירה כדי לבדל את Mb של יונקים ימיים מן החותם וחיות אחרות. למרות ניתוח דנ&quot;א אמין מבוסס PCR לזיהוי של בשר לווייתן כבד הוא 12 זמין, זה אניs עבודה רב אינטנסיבי וזמן. רצועת הבדיקה המהירה היא טכניקה שאפשר לסמוך עליו ומהירה שניתן להשתמש בם בתחום לזהות בשרי cetacean, אשר נחוץ מאוד רשויות רגולטוריות 21. סביר להניח כי הרצועה ניתן לפתח לאיתור MBS הספציפי מחיות כגון סוסים או חזירים.

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today1. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat2. Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population3. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage4. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.
Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat5 and decomposed samples6 but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork9, beef10 and catfish11. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available12, and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States1. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats. 
Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses13, but it is rarely used for identifying proteins in meat14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:148px;">J373</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">Protein G HP SpinTrap&#160;</td>
			<td>GE&#160;Healthcare</td>
			<td>28-9031-34</td>
			<td>spin column containing Protein G Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11493027001</td>
			<td>Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Trans-Blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z613630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody blocker solution&#160;</td>
			<td>LTK BioLaboratories</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">BCIP/NBT phosphatase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-81-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse</td>
			<td style="width:183px;">KPL</td>
			<td>54-62-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate</td>
			<td>Thermo&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>EW-01928-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiskan&#160;EX ELISA reader&#160;</td>
			<td>Thermo&#160;Electron&#160;Corporation</td>
			<td>51118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloid gold (40 nm) solution&#160;</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>40-50 nm is appropriate for immunostrip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15561-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid test immno-strip printer</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td>AGISMART RP-1000&#160;</td>
			<td>Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:512px;">Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&#38;S), conjugate pads (#16S, S&#38;S) and absorbent pads (CF6, Whatman))</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freund&#8217;s adjuvant and incomplete Freund&#8217;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">F5881, F5506</td>
			<td>Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:512px;">Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Protech</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Gel preparation for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:148px;">1610436</td>
			<td>Protein staining in SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laemmli sample buffer and &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:148px;">1610737, 1610710</td>
			<td>Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a colloidal gold-based immunochromatographic test strip for detection of cetacean myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

מאפיינים חד-שבטיים נוגדנים פיתחנו שני מבז IgG 1 (CGF5H9 ו CSF1H13) הכרה שני פפטידים סינתטיים (MKASEDLKKHGNTVLC ו AIIHVLHSRHPAEFGC), בהתאמה, של cetacean Mb, ואלה שימשו לבניית פס הבדיקה immunochromatographic זהב colloidal כריך סוג עבור איתור מהיר של Mb cetacean. איור 2 מראה כי CGF5H9 מזהה יונקים ימיים ויונקים אחרים כלהקה צבעונית אחת בכל משקל מולקולרי החזוי של 17 kDa למידע. הלווייתן מהינקי המשותף (acutorostrata Balaenoptera) מציג להקה יחסית חלשה יותר הלהקות של יונקים ימיים אחרים. להקות נעדרות עבור טונה, תרנגולות וחותמות, בעוד להקה בסביבות 50 kDa הוא ציינה לחזירים. אמנם יש להקות ספציפיות מרובות לחזירים וטונה, CSF1H13 היא ספציפית מאוד, כי הוא מגיב רק עם יונקים ימיים וחותם כלהקה במשקל מולקולרי חזוי של 17 משוער kדא. מינקה whale רק מראה איתות חזק בשעה 1:10 (מידע לא מוצג) ללא האות נצפתה בשעה 1:25. איור 2 מראה תוצאות זהות כתם נקודה. 3A איור מראה כי CGF5H9 מדגים איתות חיובי עבור יונקים ימיים, ארנבים, כלבים, עזים, פרות (ערך OD&gt; 3.0); איתות חיובית חלשה לחזירים (ערך OD = 1.5); איתות שלילי עבור חותמות, תרנגולות וטונה. איור 3 ב מציג כי CSF1H13 מבטא זיקה גבוהה כלפי יונקים ימיים ודחיסות (ערך OD&gt; 3.0). שניהם CSF1H13 ו CGF5H9 יכול להגיב בחריפות עם כל ארבעת המינים cetacean. מינים אלה הם ארבעה ממשפחות שונות (לווייתן מינקי: Balaenopteridae; דולפינן: Delphinidae; ראשתן גמד: Kogiidae; פוקנה הודית: Phocoenidae), המציין את תגובתיות רחבה למינים cetacean מגוונים. לבניית רצועה, CGF5H9, מכיר tהוא MBS של יונקים ימיים ויונקים אחרים, הוא קולואיד שכותרתו זהב משמש נוגדן זיהוי להיקשר מיוגלובין, ו CSF1H13 מצופה על פס הבדיקה רק כדי ללכוד את MBS של יונקים ימיים וכלבי ים. לכן פס הבדיקה נועד להציג איתות חיובית כאשר הן מבז לזהות Mb cetacean. מכיוון Mb מחיות הלא cetacean ניתן לאבחון רק על ידי אחד משני מבז אלה, פס הבדיקה מראה תוצאה שלילית כאשר דגימות שריר מבעלי חיים אחרים נבדקות. פס הבקרה תמיד מראה תוצאה חיובית בגלל ארנב אנטי עכבר IgG נקשר שכותרתו זהב קולואיד CGF5H9. תוצאה נכשלה פס הבקרה מציינת כי איכות החומרים על הרצועה הוא עני. מבחן רצועה איור 4 מראה את להקות האות בשני קו בדיקת פס בקרה כאשר דגימות שריר cetacean משמשות. כאשר המדגם אינו יכול לבוא מן יונקים ימיים, שם היא להקה אחת בלבד על wi פקד הקוth בהעדר הלהקה ב פס הבדיקה. תוצאה מוצלחת ניתן לצפות ישירות 5-10 דקות לאחר שמאחד 0.03 גרם של שריר עם 10 מיליליטר PBS המכיל BSA 0.1% בעזרת מקל פלסטיק או במבוק השריית הרצועה לתוך התערובת. לאחר בדיקת 15 מיני cetacean ושמונה מינים שאינם cetacean בשלושה עותקים, הסגולי (אחוז דגימות הלא cetacean זיהה) ורגישות (אחוז דגימות cetacean זיהה) הם 100%. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig1.jpg" /> עיצוב באיור 1. הרצועה החיסונית. כל הרכיבים בשכבות על בקפידה לכרטיס הכיסוי הפלסטי, כך שהם חופפים. זה מאפשר ריאגנטים מדגם לזרום דרך הממברנה לרפד סופג. T: אזור הבדיקה. C: אזור שליטה. נתון זה שוחזר מן Lo, ג et al. רצועת זהב colloidal ראפיד החיסוניתעבור הרחקת בשר לווייתן כבד סחר לא חוקי וצריכים:. השלכות לשימור בריאות ציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig2.jpg" /> איור 2. כתם המערבי וניתוח כתם נקודה באמצעות supernatants hybridoma. (א) CGF5H9, (B) CSF1H13. שניהם supernatants hybridoma יכול לזהות יונקים ימיים כלהקה צבעונית אחת בכל משקל מולקולרי חזוי של 17 kDa למידע. MW: לווייתן מינקי, BND: דולפינן, DSW: ראשתן גמד, FP: פוקנה הודית, PKW: לויתן של רוצח פיגמי, N: PBS (שליטה שלילי). נתון זה שוחזר מן Lo, ג et al. רצועת זהב colloidal החיסונית ראפיד עבור גבשר etacean הרחקת סחר לא חוקי וצריך:. השלכות לשימור בריאות ציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig3.jpg" /> איור 3. ELISA העקיף של תמציות שרירות של מינים שונים באמצעות מבז מטוהר. (א) CGF5H9, (B) CSF1H13. יונקים ימיים בלבד יכולים לייצר אותות חיוביים חזקים בשני מהבז. נתון זה שוחזר מן Lo, ג ואח רצועת זהב colloidal ראפיד החיסונית למסחר וצריכה בלתי חוקית הרחקה בשר לווייתן כבד:.. ההשלכות לשימור בריאות הציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig4.jpg" /> איור 4. הספציפיות של רצועת זהב colloidal החיסונית T:. קו הבדיקה. C: קו שליט. רק כאשר דגימות שריר cetacean משמשות, תוצאות מוצלחות (להקות אות בשני קו בדיקת פס בקרה) ניתן לצפות. (א) ללא cetacean דגימות: 1: פרה. 2: עיזים. 3: חזיר. 4: כלב. 5: ארנב. 6: טונה. 7: עוף. 8: חותם הארבור (Phoca vitulina). (ב) דגימות cetacean: 1: לווייתן מינקי גראונד (acutorostrata Balaenoptera). 2: לוויתן של אומורה (omurai Balaenoptera). 3: דולפינן (aduncus Tursiops). 4: דולפינן (ט truncatus). 5: דולפין של פרייזר (Lagenodelphis hosei &lt;/ Em&gt;). 6: הודו פסיפיק דולפין גבן (chinensis סוזה). 7: (griseus Grampus) גרמפוס אפור. 8: Pantropical הבחין דולפין (attenuata Stenella). 9: סטנו תלום שן (bredanensis סטנו). 10: לויתן של רוצח פיגמי (Feresa attenuata). 11: גלובי שחור קצר סנפירים (Globicephala macrorhynchus). 12: לווייתן Melon ראשים (אלקטרה Peponocephala). 13: ראשתן הגמד (Kogia סימה). 14: ראשתן פיגמי (ק breviceps). 15: פוקנה הודית (Neophocaena phocaenoides). נתון זה שוחזר מן Lo, ג ואח רצועת זהב colloidal ראפיד החיסונית למסחר וצריכה בלתי חוקית הרחקה בשר לווייתן כבד:.. ההשלכות לשימור בריאות הציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו</a>. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מיני cetacean </td><td> מינים ללא cetacean </td></tr><tr><td> ראשתן פיגמי (Kogia breviceps) </td><td> הרבור חותם (Phoca vitulina) </td></tr><tr><td> ראשתן הגמד (Kogia סימה) </td><td> כלב (familiaris זאבת Canis) </td></tr><tr><td> קצר סנפירים גלובי שחור (Globicephala macrorhynchus) </td><td> ארנב (Oryctolagus cuniculus) </td></tr><tr><td> מלון ראשי הלווייתן (Peponocephala אלקטרה) </td><td> חזיר (Sus scrofa) </td></tr><tr><td> לויתן של רוצח פיגמי (Feresa attenuata) </td><td> עיזים (קפרה hircus) </td></tr><tr><td> Pantropical הבחין דולפין (Stenella attenuata) </td><td> בקר (שור Bos) </td></tr><tr><td> דולפינן (ט&quot;וrsiops truncatus) </td><td> עוף (גאלוס גאלוס) </td></tr><tr><td> דולפינן (Tursiops aduncus) </td><td> טונה צהובה (Thunnus דגים) </td></tr><tr><td> הדולפין של פרייזר (Lagenodelphis hosei) </td><td></td></tr><tr><td> Indo-Pacific דולפין גבן (chinensis סוזה) </td><td></td></tr><tr><td> סטנו תלום שן (bredanensis סטנו) </td><td></td></tr><tr><td> גרמפוס אפור (Grampus griseus) </td><td></td></tr><tr><td> פוקנה הודית (Neophocaena phocaenoides) </td><td></td></tr><tr><td> לווייתן מינקי גראונד (acutorostrata Balaenoptera) </td><td></td></tr><tr><td> לוויתן של אומורה (Balaenoptera אומורה i) </td><td></td></tr></tbody></table> טבלת 1. הזנים שמהם השריר היה Collected ונבדק במחקר זה. מינים כוללים טונה, עוף, חותם, 5 מינים של יונקים יבשתיים, ו -15 מינים של יונקים ימיים (4 משפחות). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מִין </td><td> ההצטרפות לא. </td></tr><tr><td> לווייתן מינקי גראונד (acutorostrata Balaenoptera) </td><td> P02179 </td></tr><tr><td> של לוויתן פיגמי Bryde (edeni Balaenoptera) </td><td> Q0KIY2 </td></tr><tr><td> לווייתן גדול סנפיר (Megaptera novaeangliae) </td><td> P02178 </td></tr><tr><td> לוויתן אפור (Eschrichtius robustus) </td><td> P02177 </td></tr><tr><td> זרע לווייתן (Physeter macrocephalus) </td><td> P02185 </td></tr><tr><td> ראשתן פיגמי (Kogia breviceps) </td><td> Q0KIY5 </td></tr><tr><td> ראשתן הגמד (Kogia סימה) </td><td> P02184 </td></tr><tr><td> קצר beakeדולפין ד המשותף (delphis דולפין) </td><td> P68276 </td></tr><tr><td> ארוך סנפירים גלובי שחור (Melas Globicephala) </td><td> P02174 </td></tr><tr><td> לויתן של רוצח (orca Orcinus) </td><td> P02173 </td></tr><tr><td> מלון ראשי הלווייתן (Peponocephala אלקטרה) </td><td> Q0KIY3 </td></tr><tr><td> Pantropical הבחין דולפין (Stenella attenuata) </td><td> Q0KIY6 </td></tr><tr><td> דולפינן (Tursiops truncatus) </td><td> P68279 </td></tr><tr><td> הרבור דולפין (Phocoena phocoena) </td><td> P68278 </td></tr><tr><td> דולפין נהר האמזונס (INIA geoffrensis) </td><td> P02181 </td></tr><tr><td> לווייתני מקור של לונגמן (Indopacetus פקיפיקוס) </td><td> Q0KIY9 </td></tr><tr><td> לווייתני מקור &#39;Hubbs (Mesoplodon carlhubbsi) </td><td> P02183 </td></tr><tr><td> לווייתני המקור של קיביה (דזהphius cavirostris) </td><td> P02182 </td></tr><tr><td> הרבור חותם (Phoca vitulina) </td><td> P68080 </td></tr><tr><td> בקר (שור Bos) </td><td> P02192 </td></tr><tr><td> עיזים (קפרה hircus) </td><td> B7U9B5.3 </td></tr><tr><td> סוס (Equus caballus) </td><td> P68082 </td></tr><tr><td> חזיר (Sus scrofa) </td><td> P02189 </td></tr><tr><td> כלב (familiaris זאבת Canis) </td><td> P63113 </td></tr><tr><td> עוף (גאלוס גאלוס) </td><td> P02197 </td></tr><tr><td> יען (Struthio camelus) </td><td> P85077 </td></tr><tr><td> טונה צהובה (Thunnus דגים) </td><td> P02205 </td></tr></tbody></table> רצפי מיוגלובין טבלת 2. השתמשו במחקר זה עם מספרי הצטרפות בהתאמה GenBank. מינים כוללים טונה,עוף, יען, יונקים מקומיים, חותם ו -18 מינים של יונקים ימיים (7 משפחות). טבלה זו שוחזרה מ Lo, ג ואח רצועת זהב colloidal חיסונית ראפיד למסחר וצריך בלתי חוקיים הרחקת בשר לווייתן כבד:. השלכות לשימור בריאות ציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin at JoVE.com

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

development-colloidal-gold-based-immunochromatographic-test-strip-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  National Chiayi University. This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals. 

Video: Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Ultrafiltration זרימה משיק: שיטה &quot;ירוקה&quot; לבחירת הגודל והריכוז של חלקיקי כסף Colloidal

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video