1. לדוגמא הכנה הצעד הראשון במערב הוא סופג הכנת המדגם. כדי להכין דוגמאות להפעלת תאים ורקמות הג&#39;ל צריך להיות lysed לשחרר את החלבונים של עניין. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוח, מוכן לשימוש מגיב כי הוא תכליתי וקל לשימוש להפקת חלבון מסיס הוא CytoBuster או PhosphoSafe. מאגרים אלה מכילים דטרגנטים מיצוי אופטימיזציה עבור מיצוי יעיל של חלבונים מסיסים מתאי יונקים חרקים. עדין לא יוניים הרכב מגיב הפקת CytoBuster חלבון מאפשר בידוד של אנדוגני פעיל מבחינה תפקודית או חלבונים הביעו ללא צורך לטיפול משני כגון sonication או הקפאה / הפשרה. PhoshoSafe יש יתרון נוסף של ובה ארבע מעכבי phosphatase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (5 דקות למשל XG ב 2500), לרוקן את תא גלולה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חלבון מגיב CytoBuster הפקת באמצעות 150 μL לכל 10 6 תאים (כמות אופטימלית של הפקת מגיב CytoBuster חלבון עשויים להשתנות לפי גודל התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור מתאים ספין דקות 5 ב XG 16,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פינה supernatant (תמצית התא) לצינור טריים להמשיך בניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת חלבונים מתמחים, אנו ממליצים להשתמש ערכות באיכות גבוהה שלנו ProteoExtract. EMD יש יותר מתריסר ערכות עבור בידוד המיטוכונדריה, מיצוי proteome subcellular, חלבון ממוצא הטרנסממברני, ועוד רבים אחרים. בקר בדף הנחיתה המערבי שלנו כתם לקבלת פרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EMD גם מוכרת מגוון רחב של פרוטאז ו מעכב phosphatase קובע קוקטייל. ברגע תמוגה מתרחשת, proteolysis dephosphorylation ו denaturation להתחיל. אירועים אלה יכולים להיות האטה מאוד אם הדגימות נשמרות על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס בכל עת ומעכבי המתאימים טרי הוסיף למאגר תמוגה. בקר בדף הנחיתה המערבי שלנו כתם לקבלת פרטים נוספים. </li></ul> 2. SDS-PAGE הצעד השני במערב סופג הפרדה חלבון. חלבונים מופרדים על בסיס משקל מולקולרי. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יכול לעשות ג&#39;ל בדף שלך, עם זאת אנחנו נהיה באמצעות מסחרית מראש יצוק ג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת המדגם שלך, אתה מוכן לקבוע את ריכוז החלבון. EMD יש שתי ערכות עבור זה למדוד ריכוז, אחד להיות ללא התערבות Assay חלבון קיט השני להיות ערכת Assay BCA חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ריכוז חלבון נבחנת אנחנו מוכנים להכין המדגם שלנו לטעינת ג&#39;ל. בדרך כלל נוגדנים להכיר חלק קטן של החלבון של עניין (המכונה epitope) לבין תחום זה עשוי לשכון בתוך קונפורמציה 3D של החלבון. כדי לאפשר גישה של הנוגדן לחלק זה יש צורך לפרוס את החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפגל, להשתמש חיץ העמסה עם סולפט anionic denaturing נתרן dodecyl דטרגנט (SDS), ומרתיחים את התערובת על 95-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מאגר העמסה קלה ונוחה לשימוש היא הצפת לדוגמא 4X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הנתיב הראשון של דה מרקר היטב עם שביל לערבב חלבון. סמן זה יש שלוש להקות התייחסות אשר מאפשרים לך לפקח אלקטרופורזה. כאשר הג&#39;ל הוא מוכתם, 10 להקות נראים הנעים 10-225 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את יחידת אלקטרופורזה עם ריצה חיץ. עבור ג&#39;לים PAGE, זה בדרך כלל טריס-1X גליצין. עבור למאגר מתכונים מפורטים, בקר בדף סופג המערבי. EMD מציעה באיכות גבוהה ריאגנטים מאגרים עם הקו שלנו כימיים OmniPur. הרץ את הג&#39;ל על 220V במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלבונים נפרדו, הכתם ג&#39;ל עם Coomassie כחול כדי להבטיח החלבונים היגרו באופן שווה ואחיד. RAPIDstain הוא Ultra-רגיש כתם שהוא מוכן לשימוש. Destaining לא נדרש. </li></ul> 3. חלבון העברה בדיוק כמו חלבונים עם מטען חשמלי יכול להיגרם לעבור דרך ג&#39;ל בשדה חשמלי, ולכן ניתן החלבונים יועברו בשדה חשמלי של הג&#39;ל על גבי קרום, להיות או PVDF או nitrocellulose. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום נעשה טרנספר רטוב. ב העברת רטוב, ג&#39;ל לבין הממברנה הם דחוקה בין ספוג ונייר (ספוג / נייר / ג&#39;ל / קרום / נייר / ספוג) וכולם היו שלובות בכוח לאחר הבטחת אין בועות אוויר נוצרו בין הג&#39;ל לבין הממברנה. כריך הוא שקוע חיץ העברה אשר שדה חשמלי מוחל. החלבונים טעונים שלילית לנסוע לכיוון האלקטרודה חיובי טעון, אבל הממברנה עוצר אותם, נקשר אליהם, ומונע מהם להמשיך הלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגים של קרומים זמינים: nitrocellulose ו PVDF. שניהם עובדים היטב. היום אנחנו נהיה באמצעות PVDF. ממברנות PVDF דורשים טבילה methanoאני במשך כמה דקות, ואחריו חיץ קרים להעביר במשך 5 דקות. הג&#39;ל גם צריך לאזן לכמה דקות במאגר העברת קרים כקרח. לא שהדבר עלול לכווץ את הג&#39;ל במהלך ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ להעברת רטוב הוא 1X טריס-גליצין עם מתנול 20%. ההכנות חיץ מפורט זמינים באתר האינטרנט שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההעברה תסתיים, זה רעיון טוב כדי להמחיש חלבונים כדי להבטיח אפילו להעביר ללא כיסי אוויר. זה יכול להיעשות בקלות עם כתם המערבי RedAlert הכתם. כתם זה הוא מוכן לשימוש destaining ניתן לעשות זאת בקלות עם מים. </li></ul> 4. נוגדנים ריאגנטים אביזר <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הראשון עושה חיטוט נוגדנים לאנטיגן היא לחסום את הממברנה. חסימת קרום מונע הלא ספציפית מחייב רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או שאינם שומן חלב או BSA יכול לשמש כפתרון חוסם. עם זאת, בעת שימוש phospho נוגדנים ספציפיים, לא מומלץ להשתמש בחלב כמו זה יגרום רקע גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EMD כמה הצעות באיכות גבוהה ריאגנטים חוסם, ובכלל SeaBlock, שהוא סוכן שאינם יונקים חסימת QuickBlocker כתם, שהוא מוכן, מוכן לשימוש, חסימת סוכן. יש לנו גם באיכות גבוהה BSA (שבר V) זמין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השעה 1 הממברנה בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים TBST או PBST לאחר דגירה. דרך קלה ונוחה לעשות TBST או PBST היא להשתמש בטבליות שלנו (PBS טבליות tween / TBS טבליות tween) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קרום נחסם, אתה מוכן דגירה עם הנוגדן הראשוני. EMD כבר מציעה סל מוצרים מקיף של נוגדנים חריגים עם ערבות הנוגדנים הטובים ביותר בתעשייה במשך 30 שנים. זכור כי עם כל הנוגדנים EMD, אנו מציעים מלא 100% ללא סיכון ערובה. רכישה נוגדן ולהשתמש בו עבור הספציפיות לכל מין או יישום שאתה רוצה. אם הנוגדן לא עובד לשביעות רצונך, נספק אשראי מלא כדי לשמש על מוצר אחר. לפרטים נוספים, בקר בדף האינטרנט המערבי שלנו סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום נהיה דוגרים הנוגדן העיקרי שלנו באמצעות פתרון של SignalBoost 1. SignalBoost הוא מוצר נהדר המאפשר את האות להיות משופרת באופן משמעותי. פשוט דגירה הנוגדן העיקרי בפתרון 1 ו דגירה במשך שעה 1 או כרגיל. אין צורך להוסיף סוכני חסימה נוספת. לחלופין, ניתן להשתמש BSA או חלב דל שומן יבש כסוכן חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם TBST. אנחנו עושים TBST באמצעות מוכנים להמיס טבליה TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדן המשני שלך באמצעות פתרון של 2 SignalBoost. דגירה נוגדנים משני חסימת חיץ במשך שעה 1. לשטוף את הממברנה שוב מספר פעמים עם TBST. </li></ol></li></ul> 5. איתור עבור נוגדנים HRP משני conjugating, ECL משמש באופן מסורתי. מגיב ECL מעולה שאנו מציעים הוא RapidStep. היתרונות של RapidStep הן כי אין ערבוב של luminal או משפר נדרשת. כל שעליך לעשות הוא לרסס את הממברנה כמה פעמים לפתח באמצעות רנטגן הסרט. RapidStep מציעה רגישות pictogram נמוך כמו גם פולטות אור עד 2 שעות לאחר תוספת של המצע.

<ol>
	<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li><li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis.">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li><li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells.">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , (2010).</li><li>O'Malley, D. e. r. v. i. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome:+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors.">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li></ol>

המחברים אנה אסלאמי וג&#39;סי Lujan מועסקים על ידי EMD כימיקלים Inc המייצרת ריאגנטים ומכשירים השתמשו בסעיף זה.

במצגת וידאו זה, יש לנו הדגיש את השלבים העיקריים במערב סופג אשר הכנת המדגם, SDS-PAGE, קרום חסימת / חיטוט עם נוגדנים, זיהוי. עבור כל שלב של התהליך, פרוטוקולים נאותה ריאגנטים המתאימים יש להשתמש כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CytoBuster&trade; Protein Extraction Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71009</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/cytobuster">www.emdbiosciences.com/cytobuster</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/cytobuster">www.merck4biosciences.com/cytobuster</a></td>
</tr>
<tr>
<td>PhosphoSafe&trade; Extraction Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71296</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe">www.emdbiosciences.com/phosphosafe</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe">www.merck4biosciences.com/phosphosafe</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Non-Interfering Protein Assay&trade; Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>488250</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/noninterfering">www.emdbiosciences.com/noninterfering</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/noninterfering">www.merck4biosciences.com/noninterfering</a></td>
</tr>
<tr>
<td>BCA Protein Assay Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71285</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/BCA">www.emdbiosciences.com/BCA</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/BCA">www.merck4biosciences.com/BCA</a></td>
</tr>
<tr>
<td>4X SDS Sample Buffer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>70607</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/4XSDS">www.emdbiosciences.com/4XSDS</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/4XSDS">www.merck4biosciences.com/4XSDS</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Trail Mix&trade; Protein Markers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>70980</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/trailmix">www.emdbiosciences.com/trailmix</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/trailmix">www.merck4biosciences.com/trailmix</a></td>
</tr>
<tr>
<td>ProteoExtract&trade; Protein Extraction Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/proteoextract">www.emdbiosciences.com/proteoextract</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/proteoextract">www.merck4biosciences.com/proteoextract</a></td>
</tr>
<tr>
<td>OmniPur&reg; Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/omnipur">www.emdbiosciences.com/omnipur</a></td>
</tr>
<tr>
<td>RAPIDstain&trade; Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>553215</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/rapidstain">www.emdbiosciences.com/rapidstain</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/rapidstain">www.merck4biosciences.com/rapidstain</a></td>
</tr>
<tr>
<td>RedAlert&trade; 10X Western Blot Stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71078</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/redalert">www.emdbiosciences.com/redalert</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/redalert">www.merck4biosciences.com/redalert</a></td>
</tr>
<tr>
<td>SeaBlock&trade; Reagent, Salmon Plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>558300</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/seablock">www.emdbiosciences.com/seablock</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/seablock">www.merck4biosciences.com/seablock</a></td>
</tr>
<tr>
<td>BLOT-QuickBlocker Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>WB57</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/quickblocker">www.emdbiosciences.com/quickblocker</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/quickblocker">www.merck4biosciences.com/quickblocker</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Albumin, Bovine Serum, Fraction V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>12660</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/bovineserum">www.emdbiosciences.com/bovineserum</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/bovineserum">www.merck4biosciences.com/bovineserum</a></td>
</tr>
<tr>
<td>PBS-TWEEN&reg; Tablets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>524653</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/PBST">www.emdbiosciences.com/PBST</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/PBST">www.merck4biosciences.com/PBST</a></td>
</tr>
<tr>
<td>TBS-TWEEN&reg; Tablets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>524753</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/TBST">www.emdbiosciences.com/TBST</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/TBST">www.merck4biosciences.com/TBST</a></td>
</tr>
<tr>
<td>SignalBoost&trade; Immunoreaction Enhancer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>407207</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/signalboost">www.emdbiosciences.com/signalboost</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/signalboost">www.merck4biosciences.com/signalboost</a></td>
</tr>
<tr>
<td>RapidStep&trade; ECL Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>345818</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/rapidstep">www.emdbiosciences.com/rapidstep</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/rapidstep">www.merck4biosciences.com/rapidstep</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

western blotting: sample preparation to detection

המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ. היא משתמשת אלקטרופורזה בג&#39;ל להפריד חלבונים יליד מפוגל או לפי אורך של פוליפפטיד (תנאים denaturing) או על ידי מבנה 3-D של חלבון (יליד / לא denaturing תנאים). חלבונים מועברים לאחר מכן קרום (בדרך כלל nitrocellulose או PVDF), שם הם בחנו (זוהה) באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון היעד.

Watch this Scientific Journal Video about Western Blotting: Sample Preparation to Detection at JoVE.com

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

western-blotting-sample-preparation-to-detection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

139.7K Views.  EMD Chemicals Inc.. המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.

Video: Western Blotting: Sample Preparation to Detection

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...