מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R15DA029863), מענק אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק מחקר לתואר ראשון (M30014) ואוניברסיטת רוס של מענק מחקר לרפואת הווטרינרית. ברצוננו להודות למכון הלאומי לשימוש בסמים (Rockville, MD) למתן (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA) עבור עבודה זו.

נהלי שימוש בבעלי חיים מתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת רוס לרפואת וטרינרית ואוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. למרות טכניקות וכפפות סטריליות נדרשות, הסביבה נטול RNase אין צורך בעת השימוש בפרוטוקול זה. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת רקמה וחתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת חולדות באופן אקראי לשלוש קבוצות: טרי / מלוח (SAL; 0.9% NaCl), ולפניה / SAL וקידומת / 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ראה פירוט בטבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל שלושה מינונים של 1 מיליליטר / קילוגרם SAL ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם MDMA intraperitoneally, בהתאמה, לקבוצות SAL וMDMA במרווח 2 שעות. הרשה בעלי חיים כדי לשרוד את הטיפול במשך 6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, לנהל 100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין בשילוב של 5 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine intraperitoneally לחולדות להרדמה עמוקה (כלומר, הפסד של מצמוץ בקרנית ות&quot;אil לצבוט רפלקסים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצה הטרי / SAL, לערוף מהירות חולדות ולהסיר את המוח לבדיקת המוח הטרי (ראה פירוט בהתייחסות 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצות / MDMA קידומת / SAL וקידומת, לעשות חתך לאורך עצם החזה על 10 -12 סנטימטרים ולאחר מכן לחשוף את הסוף של עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקצה של עצם החזה עם hemostat ולחתוך את הסרעפת רוחבית בשני הצדדים עם מספריים חדים ולאחר מכן לחתוך כלפי מעלה על פני הצלעות ומקבילות לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד אחת, מחזיק את קצה הגחון של הלב עם מלקחיים קטנים. ביד השנייה, פירס החדר השמאלי עם מחט מזרק G 18 (שים לב לצד המתאם של המחט מחוברת עם צינור סיליקון בצורת אות V למכולות SAL וparaformaldehyde קר כקרח ומשאבות peristaltic; ראה התייחסות 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת SAL ברמה בינונית של קצב הזרימה (~ 5 מיליליטר / דקה) ולנקב את אטריום ימין עם המלקחיים כדי לאפשר הבריחה של circ התמורהulation. לשמור זלוף SAL למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת paraformaldehyde ברמה בינונית ולאפשר paraformaldehyde 4% קרים כקרח לינקב את החיה במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכשיר זלוף ולערוף את החיה. הפוך posteroanterior לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, ואז לנפנף את הגולגולת כדי לחשוף את חלל גולגולת 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח עם מרית מחלל הגולגולת ולמקם את המוח בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 4% paraformaldehyde. שמור את המוח בתוך הצינור המכיל paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס מקרר למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את המוח לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 30% תמיסת סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. לבסוף, לאחסן המוח בתוך שקיות פלסטיק ב -80 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המוח על צ&#39;אק עם תקשורת הטבעה ולהקפיא את תקשורת ההטבעה מכילה מוח בcryostat בטמפרטורה של -26 מעלות צלזיוס. חותך את קפא הטרימוח n ל -20 מיקרומטר חלקים וparaformaldehyde-התחילית מוח לסעיפים 10 מיקרומטר. העבר את הסעיף לשקופית מיקרוסקופ RT על ידי נגיעה בשקופית לסעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש ב RT במשך 4 שעות. אחסן את שקופיות הסעיף בשקית אטומה הדוק ב -80 ° C עד שימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שקופיות מהמקפיא -80 ° C ולהקצות חלקים לאחת משלוש בדיקות: HT2A, ppiB (ביקורת חיובית) או dapB (שליטה שלילית); סימן וחתכים תווית עם עט כדורי (לא להשתמש בעיפרון). לצלול שקופיות באלכוהול 100% ב RT במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול מקדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μl של המגיב לפני הטיפול-1 (איון של phosphatase אלקליין) בסעיפים בשקופיות. מניחים את השקופיות על רכבת מתלה במגש לחות (שים לב שהמגש מכוסה במכסה כדי לשמור על לחות גבוהה למניעת אידוי מsolutio התגובהn). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את מגש הלחות על שייקר אופקי במהירות נמוכה במשך 10 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים כפולים (DDH 2 O) במשך 2 דקות. להטביע את השקופיות בכוס 200 מיליליטר המכילה 150 מיליליטר של המגיב לפני הטיפול-2 (שבירה של הקשרים בין-הנגרמים על ידי קיבוע paraformaldehyde). מרתיחים את השקופיות עבור הסכום כולל של 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס (שיקום מושרה חום של מבנה RNA 11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות. מניחים את השקופיות באלכוהול 100% במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף. השתמש בעט הידרופובי לצייר מעגל מסביב לאזור שנבחר בסעיף הרקמות (למשל, מבנים שאינן בקליפת המוח, כוללים התלמוס וההיפותלמוס כפי שמתוארים באיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של המגיב לפני הטיפול-3 (עלייה בחדירת בדיקה) לכל אזור שנבחר, ולכסות את מגש הלחות עם המכסה. מניחים את המגש בתנור ההכלאהמצויד בייקר האופקי ולהגדיר את טמפרטורת התנור ב -40 מעלות צלזיוס; נער בעדינות את המגש למשך 30 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות. </li></ol></li></ol> 2. הכלאה והגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של htr2a, ריאגנטים בדיקה ppiB וdapB, בהתאמה, באזורים הנבחרים. מכסה את מגש הלחות עם המכסה כדי למנוע אידוי של המגיב. נער בעדינות על שייקר האופקי להגדיר במהירות נמוכה. דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס בתנור למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-1 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-2 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים wה- i כביסה חיץ במשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-3 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-4 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-5 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-6 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT במשך 15 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. </li></ol> 3. גילוי אותות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של המגיב האדום לכל אזור שנבחר (שים לב שמגיב היא תערובת של אדום-B ואדום-ביחס 1:60 ויש להשתמש ביmmediately). מניחים את השקף במגש הלחות על שייקר האופקי ב RT וללחוץ בעדינות במהירות נמוכה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם (DDH 2 O) במשך 10 דקות. ייבש את השקופיות על 60 מעלות צלזיוס בתנור במשך 15 דקות. מניחים את השקופיות בקסילן מתחת למכסת מנוע קטר במשך 5 דקות. פיפטה 20 μl של תקשורת הרכבה מבוססת קסילן בכל אזור שנבחר ולכסות עם coverslip. </li></ol> לכידת 4. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח microphotographs הדיגיטלי של האזורים הנבחרים (לדוגמא, ההיפותלמוס, איורים 1 ו 3) עם הגדלה של 4 × 20 × ועדשות אובייקטיביות. שמור את קובץ התמונה. </li></ol> ניתוח חלקיקים 5. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרור ושחרר את קובץ התמונה בחלון ImageJ העיקרי. עבור לשורת תפריטים ובחרו &#39;תמונה&#39;, הבא לבחור &quot;סוג&quot; מהתפריט הנפתח, ובחר &#39;8 סיביות &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;התאם&#39;, ולאחר מכן בחר &#39;Threshold &#39;כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. התאם את ערך הסרגל התחתון בתיבת הדו שיח כדי שהרקע לא רצוי יוסר. עבור לשורת תפריטים ובחרו &#39;לנתח&#39;, ולאחר מכן בחר &#39;לנתח חלקיקים&#39; כדי לפתוח תיבה דו-שיח שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל חלקיקים בגיל 10, הבא בחר &#39;הצג מתווה&#39; ובחר &#39;צג תוצאות &quot;ו&#39;קופסות&#39; לסכם. לבסוף, לחץ על &#39;אישור&#39; כדי להציג נתונים חלקיקים בתיבות דו-שיח. </li></ol> חישוב 6. גיליון אלקטרוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הנתונים לגיליון Excel וממוצע המספרים של חלקיקים בקבוצת SAL כבסיס. לחשב את האחוז של כל קטע ולעשות גרף בהתאם (איור 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine.">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li><li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome,+severe+rhabdomyolysis,+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA.">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li><li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users.">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234 (2013).</li><li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users.">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li><li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+&#945;2+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain.">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect &#945;2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li><li>Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethylmaleimide+(NEM)+can+significantly+improve+in+situ+hybridization+results+using+35S-labeled+oligodeoxynucleotide+or+complementary+RNA+probes.">N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes.</a> J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> J Vis E. , (2014).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis E. , (2012).</li><li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pericytes+and+capillary+diameter+in+brain+slices+and+isolated+retinae.">Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae.</a> Nat Proto. 9, 323-336 (2014).</li><li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).</li><li>Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+in+rat+dentate+granule+cells:+comparison+between+fresh+and+fixed+tissue.">Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue.</a> J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).</li><li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription.">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li><li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens,+olfactory+tubercle,+and+caudate+putamen+of+the+rat.">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice.">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li><li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine.">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li><li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action.">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li><li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+('Ecstasy')+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human.">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

One of the major concerns of in situ hybridization test is to choose appropriate techniques used for RNA preservation because of RNase enzymes. It is well known that these enzymes are widely present in the cells and environment which can affect the results. However, enzyme activity can be quickly distinguished by placing the tissue in the dry ice/alcohol solution5,12. Although quick preservation is critical for hybridization using a riboprobe13, little is known about experimental conditions for oligonucleotide probes. In this study using oligonucleotide probes, we found that there was no difference between the paraformaldehyde-prefixed and fresh brains quickly preserved in the ice/alcohol solution. This suggests that brain RNA prefixed by paraformaldehyde had no significant effect on the quality of hybridization using the oligonucleotide probe. Since the prefixed brain is easily sectioned compared to the fresh brain, this protocol provides an alternative tissue preparation for the hybridization test. 
We believe that keeping the brain tissue sections inside the sealed moisture tray with constant shaking on the horizontal shaker is essential for successful hybridization. Failure to follow those steps may result in uneven hybridization or high background. To eliminate possibilities of false-negative or false-positive results, tests should include necessary control slides. We found that the dapB probe did not show a visible signal. This is not surprising since dapB is a bacterial gene that is unlikely found in mammalian cells. In contrast, the area hybridized with the ppiB probe showed signals homogenously distributed throughout the region examined. This is predictable since the housekeeping gene should be present in any kind of mammalian cells. It has been suggested that 5-HT2A mRNA is distributed heterogeneously in the brain nuclei, including the hypothalamus14,15. As expected, htr2a signals are present in certain nuclei in the region of the hypothalamus although the probe has been applied to all of the selected areas. It should be kept in mind that the use of alcohol should be avoided after the Red reagent (step 3.1) since red signals can be easily decolored by alcohol. We found that, after cellular RNA stained with the Red reagent, cells cannot be counterstained with hematoxylin or crystal violet although the exact cause of counterstaining failure is unknown. In summary, a characteristic distribution of htr2a mRNA supports the idea that these oligonucleotide probes are gene-specific despite the shorter sequence relative to other probes16,17. 
Background signals are another major concern, which likely affects the quality and faithfulness of data analysis. Unlike the high background produced by riboprobes13, oligonucleotide probes normally show a very low background. Thus, image can be easily and reasonably quantified using publicly-available NIH ImageJ software. In this study, we showed an example of this technique by examining changes in htr2a expression in response to systemic MDMA at 10 mg/kg. We demonstrated that MDMA caused a 20% reduction in htr2a expression, supporting previous reports18. 
In addition to the three genes outlined above, this protocol has been validated with two other gene probes (trh, thyrotropin-release hormone gene, and trhr, thyrotropin-releasing hormone receptor gene; data not shown), demonstrating a high sensitivity and accuracy in detecting mRNA levels. Since most reactions require only 10 &#181;l of reagents, the cost of an assay is also significantly reduced, compared to radioactive riboprobes. Furthermore, it is important to note that this protocol does not require the RNase-free environment. In conclusion, this protocol improves the speed of in situ hybridization assay, and increases reproducibility with relatively low cost.

Serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome is an acute neurologic disorder caused by 5-HT-promoting drugs such as antidepressants1, while also occurring in situations of MDMA use for recreational purposes2. Molecular mechanisms responsible for mood swings, learning and memory deficits that occur in association with the acute syndrome are not well understood3,4. In situ hybridization is a powerful research tool allowing the detection and quantification of specific mRNAs expressed potentially at a single-cell level. The conventional way to perform in situ hybridization is to utilize a radioactive-labeled riboprobe that specifically hybridizes the gene of interest. However, a major drawback is that the method requires complicated and time-consuming probe preparation and hybridization steps, as well as access to fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment5,6. 
Oligonucleotide probes have been recently developed to hybridize shorter RNA fragments than those required for riboprobes7. Furthermore, the probes produce a low background signal without sacrificing specificity8. This newly-developed probe technology can be used in situ hybridization on paraformaldehyde-prefixed brain tissues commonly available in immunocytochemical laboratories.
Here, we describe a protocol for in situ hybridization using oligonucleotide probes on paraformaldehyde-prefixed rat brain and compare findings with those noted in a fresh frozen brain5,6. This protocol is used to test the hypothesis that MDMA substance abuse causes changes in 5-HT2A receptor gene htr2a mRNA in the brain. We began the procedure with MDMA treatment followed by paraformaldehyde tissue perfusion of the animal, in situ hybridization of the thr2a probe, and data analysis. Note that dapB (the bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase) is used as a negative control, and ppiB (housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B) as a positive control.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="873">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNAscope Negative Control Probe-DapB</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>310098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Pretreat 4</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>320046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>310036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe - Rn-Ppib</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>313921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Htr2a</td>
			<td>Advanced cell diagnostic, INC</td>
			<td>300031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>88032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>222000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in situ hybridization using oligonucleotide probes on paraformaldehyde-prefixed brain of rats with serotonin syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

שימוש בבדיקות RNA oligonucleotide (&lt;25 NT), הכלאה יכולה להתגלות כנקודות אדומות בתאי ההיפותלמוס הוכנו מהמוח הקפוא-התחילית paraformaldehyde וטרי. מולקולות mRNA htr2a נמצאות בכמה תאים (המסומנים בחצים מוצקים), אך לא לאחרים (חיצים פתוחים). הבחנו כי אין הבדל בין-התחילית paraformaldehyde והרקמות קפואים (איור 1). הכלאה מוצלחת ניתן להעריך ראשון בעין בלתי מזוינת (איור 2). מצאנו שהאזור שנבחר (מסומן בעיגולים) הכלאה עם הבדיקה dapB לא הראה אות גלויה לעין בלתי מזוינת (2 א-B דמויות). לעומת זאת, באזור הכלאה עם הבדיקה ppiB הראה אותות המופצים homogenously בכל האזור שנבדק (איורים 2C-D). בעוד שבבדיקת htr2a, אותות נמצאים בגרעינים מסוימים (המסומנים בחצים; <strong&gt; 2E-F דמויות), למרות שכל האזור המוקף בעיגול כבר הכלאה עם הבדיקה htr2a. מעניין לציין, כי האותות בשקופיות MDMA היו חלשים יחסית בהשוואה לשקופיות SAL. פרטים מהותיים של אותות הכלאה ניתן להעריך במכשיר מיקרוסקופי. אין נקודה אדומה (איור 3 א-B) בתאי הכלאה עם הבדיקה dapB ואילו אותות ניתן לראות בכל רחבי השדה המיקרוסקופי הכלאה עם הבדיקה ppiB (איור 3 ג-ד). אותות htr2a ממוקמים בעיקר בגרעינים מסוימים של ההיפותלמוס (איור 3E-F). צפינו ירידה באותות htr2a ברקמות המוח שטופלו בעבר עם MDMA המערכתי ב 10 מ&quot;ג / קילוגרם, אשר יכול להיות כמותית נקבעה באמצעות ניתוח ImageJ. כפי שניתן לראות באיור 4, מצאנו ירידה של 20% בביטוי htr2a. לסיכום, התוצאות שלנו הראו כי שימוש באוליגובדיקות נוקלאוטיד היא ספציפית, ומתאים לרקמת המוח ולפניה. יתר על כן, נהלי פרוטוקול, כולל הכלאה באתר, ניתוח נתונים וזיהוי אותות יכולים להסתיים בתוך יומיים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53165/53165fig1.jpg" /> נהלי איור 1. השוואה של הרקמות קפואים וקידומת. משמשים למוח קפואים תוארו במקום אחר 5. שים לב כי החלקים קפואים נחתכו ב 20 מיקרומטר בעובי תוך קבוע סעיפים קפוא ב -10 מיקרומטר. הבדיקה oligonucleotide הייתה htr2a שhybridizes mRNA קולט 2A 5-HT בהיפותלמוס. חצים מוצקים מצביעים על תאים המכילים מולקולות mRNA htr2a בקפואים () ורקמות התחילית (B). חיצים פתוחים, אין מולקולות mRNA htr2a זוהו. בר: 20 מיקרומטר. באמצעות NIHניתוח ImageJ, htr2a נספר. מספרים של ספירת htr2a אינם שונים בין הרקמות טריות ו- התחילית paraformaldehyde הקפואות (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53165/53165fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53165/53165fig2.jpg" /> איור 2. מבט בעין בלתי מזוינת של אותות הכלאה. רקמות התחילית paraformaldehyde בחולדות מורדמות עמוק שטופלו בעבר עם מי מלח (SAL) ו3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA). קווים מקווקווים הלבנים-מצביעים אזור הכלאה עם בדיקות oligonucleotide. הצבע האדום מציין אותות mRNA לעין בלתי מזוינת. אין אות אדומה נצפתה בעת השימוש בבדיקת dapB הכלאה סעיפים של SAL-pretreated () או חולדות-pretreated MDMA (B </stRong&gt;). לעומת זאת, אותות אדומים מופצים ברחבי הומוגנית אזורי ההיפותלמוס תוך שימוש בבדיקת ppiB (CD). מעניין לציין, אותות אדומים המיוצרים על ידי הבדיקה htr2a הם רק באזורים מסוימים (EF; חצים מצביעים על אזור ההיפותלמוס). Stereotaxic קואורדינטות: -3.50 ~ -3.80 ביחס לגבחת. 3V, החדר השלישי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53165/53165fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53165/53165fig3.jpg" /> איור 3. מבט מיקרוסקופי אור של אותות הכלאה. רקמות התחילית paraformaldehyde בחולדות מורדמות עמוק שטופלו בעבר עם מי מלח (SAL) ו3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA). בדיקות oligonucleotide הן dapB (AB), מדד המחירים ליצרןB (CD) וhtr2a (EF). אותות הכלאה מזוהים כנקודות אדומות באמצעות כוחות אובייקטיביים הגדלה נעים בין 4 × (ברים: 200 מיקרומטר). 20 × (microphotographs הבלעה) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53165/53165fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53165/53165fig4.jpg" /> איור 4. השפעה על ביטוי htr2a ההיפותלמוס בחולדות שטופלה בעבר עם MDMA. דוגמאות היו assayed בכפילויות וחזרו שלוש פעמים. הנתונים מבוטאים באחוזים ממוצעים ± SEM של קבוצת SAL (בסך הכל 8 חולדות ששמשו במחקר זה). * P &lt;0.05 לעומת. קבוצת SAL באמצעות מבחן t של הסטודנט. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><t<html> ד&gt; </td><td> טרי </td><td></td><td colspan="2"> התחילית-paraformaldehyde </td></tr><tr><td></td><td> SAL ב </td><td></td><td> SAL ב </td><td> MDMA ג </td></tr><tr><td> בדיקה יעד (htr2a) </td><td> √ </td><td></td><td> √ </td><td> √ </td></tr><tr><td> בדיקה חיובית (ppiB) </td><td> - </td><td></td><td> √ </td><td> √ </td></tr><tr><td> בדיקה שלילית (dapB) </td><td> - </td><td></td><td> √ </td><td> √ </td></tr></tbody></table> √, מציין את הקבוצה בחנה עם הבדיקה oligonucleotide במחקר זה. -, לא נבדק; , כל קבוצה מכילה 4 חיות שונות; ב, הקבוצה pretreated intraperitoneally עם מי מלח פיזי (SAL; 0.9% NaCl); ג, pretreated intraperitoneally עם 10 מ&quot;ג / קילוגרם MDMA. 1. עיצוב ניסיוני jove_content &quot;&gt; לוח

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome at JoVE.com

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

rapid-situ-hybridization-using-oligonucleotide-probes-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

8.8K Views.  Ross University School of Veterinary Medicine. This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Video: Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: שימוש בפרוטוקול תטא-Burst לחקור Mechasnism של פלסטיות של אנשים עם תסמונת X שביר אוטיזם ו

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

קביעה מהירה של סף nociceptive תרמי בעכברים סוכרתיים

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

הקלטה EEG בחופשיות העברת חולדות neonatal בשיטת רומן

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

אינדוקציה של פגיעה מוחית Axonal בחולדות מבוסס על האצת הסיבוב

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...