The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children&#8217;s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.

שיטה זו נדרשה שימוש נושאי בעלי חיים, אפשרו על ידי הוועדה לאוואל אוניברסיטת בעלי החיים אתיקה (פרוטוקול # 2,012-170). 1. התקנה והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות aCSF על פי המתכונים 7,17 הבאים. מתכונים אחרים עם וריאציות ריכוז זמינים בספרות. פתרונות מניות חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח: להוסיף 75.39 גרם של NaCl (129 מ&quot;מ סופי); 2.5 גרם של KCl (3.35 מ&quot;מ סופי); 0.81 גרם של NaH2PO4 (0.58 מ&quot;מ סופי); 2.33 גרם של MgCl2 (1.15 מ&quot;מ סופי); 1.85 גרם של CaCl2 (1.26 מ&quot;מ). ממיסים בכ -800 מיליליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן למלא לL 1 עם מים distillated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ביקרבונט: להוסיף 17.65 גרם של NaHCO 3 (21 מ&quot;מ סופי). ממיסים בכ -900 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא לL 1 עם מים מזוקקים. וריאציות של הריכוז ביקרבונט יגרמו וריאציות pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון גלוקוז: להוסיף 54.06גרם של גלוקוז (30 מ&quot;מ סופי). ממיסים בכ -400 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא 500 מיליליטר מים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aCSF על ידי דילול של תמיסת מלח 100 מיליליטר, של פתרון ביקרבונט 100 מיליליטר, 50 מ&quot;ל ושל פתרון גלוקוז ב1 ליטר של מים מזוקקים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודת זכוכית על ידי התחממות ומתיחת צינור זכוכית עד שזה נשבר. חול במורד הקצה לפני השימוש. האלקטרודה ניתן לעשות שימוש חוזר הרבה זמן כל עוד הוא נשאר נקי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ניסוי הערה: פרטי ההגדרה מוצגים באיור 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המגבר, נע Averager, נתוני מערכת רכישה, בקר טמפרטורה ומשאבה. בדוק את ההגברה האות (רווח = 10,000), סינון (סף נמוך, 10 הרץ; סף גבוה, 5 kHz), וקצב הדגימה של אנלוגי להמרה דיגיטלית של אות הגלם (2.5 kHz). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק עם aCSF ובועה זה עם carbogen (95% O 2 </sub&gt;, 5% CO 2). לגרום bubbled- וחמם aCSF זרימה בתא ההקלטה (נפח 5 מיליליטר) בשעה 4 מיליליטר / דקה. החזק את הטמפרטורה בחדר ההקלטה ב 26 (± 1) מעלות צלזיוס. pH צריך להיות 7.4 בתנאים סטנדרטיים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 50 מיליליטר של RT וaCSF-בועות carbogen במזרק 50 מיליליטר ליד חדר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב ולהפעיל את תוכנת ההקלטה. </li></ol></li></ol> 2. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול וחזותי לקבוע את מינו של בעל החיים (זכרים כבר ano-גניטלי מרחק, ואילו נקבות יש מרחק ano באיברי המין קצר; זכרי איברי מין הם בדרך כלל כהים ואילו איברי המין נקביים הם ורוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את מכרסמים שזה עתה נולד על ידי אחת מהאפשרויות הבאות: cryoanesthesia (לטבול לחלוטין בבעלי החיים בקרח 4 - 5 דקות 18), הזרקה (equitensine ב 4 מיליליטר / קילוגרם) 19 או שאיפה של חומרי הרדמה נדיפים (isoflurane או אתר 21 20). Confirm מטוס נאות של הרדמה על ידי היעדר רפלקס נסיגת כפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על הספסל, פני הגחון למטה. סעיף החלק מקורי של הראש coronally עם אזמל ברמת גבחת (גלויה דרך העור והגולגולת). לבצע שלב זה מייד לאחר החיה מורדמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הגוף coronally עם אזמל תחת החברים הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עור, שרירים, רקמות שומן וקיבה עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. מאז העצמות רכות בגיל הזה, להיות זהיר שלא לפגוע במערכת העצבים. לבצע שלב זה על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההכנה בתא לנתיחה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. מנקודה לסוף ההקלטה זו, השתמש במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פניו הגב של ההכנה, לחתוך את הגולגולת וחוליות מהמקוריות לחלק הזנב לאורך הציר הבינוני עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. פתח את הגולגולת לחתוךוחוליות במטרה לחשוף את רקמת העצבים. השתמש בaCSF strored במזרק לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצבת, להסיר את קרום נואיד, רקמה דקה המכסה את פני השטח של רקמת העצבים. שמור קרום רך וכלי דם נגד רקמת העצבים. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההכנה עם הגב עם פנים כלפי מטה, ובזהירות להפיל את גזע המוח וחוט השדרה על ידי חיתוך העצבים ורקמות חיבור עם המספריים תוך החזקת ההכנה במקום. גישת גב היא גם אפשרית. שמור את השורשים ועצבי זמן רב ככל האפשר. הסר את העצמות לבודד את גזע המוח וחוט השדרה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח הקטן ונותר מבנים מקורי על ידי חתכם עם האזמל. השתמש בaCSF מאוחסן במחט לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין בהתאם experimenעיצוב טל, להסיר את פונס עם האזמל על ידי קדמי סעיף העטרה לעורק המוח הקטן הנחות 22. שימו לב שהשמירה על כל פונס יהיה להאט את קצב בחולדות ומלאה לעכב אותו בעכברים. הכנות הכוללות את חלק הזנב רק של פונס להציג פעילות כמו נשימה-עם תדר יציב בשורש C4. </li></ol> 3. הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההכנה בחדר הקלטה, עם הפנים כלפי מעלה הגחון. תקן את ההכנה עם סיכות בחלק הנמוך ביותר של חוט השדרה והמקורי ביותר החלק מגזע המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק הצמוד לאלקטרודה על ידי מחטה, לגרום לדיכאון באלקטרודה (קוטר הקצה של כוס: 150-225 מיקרומטר) על ידי תלישת הבוכנה המזרק, כדי למלא באופן חלקי את האלקטרודה עם aCSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micromanipulator, למקם בזהירות את האלקטרודה קרובה לאחד משורשי הגחון הרביעי. שורשי הגחון אחרים יכולים גם להציג כמו נשימה-פעילות (ה.ז., עצב גולגולת XII, C1 שורש הגחון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לדיכאון במכל אלקטרודה באמצעות המזרק ידי משיכת הבוכנה כדי לשאוב שָׁרשׁוֹן העצב בעדינות. לאחר מכן לעבור בזהירות את האלקטרודה ליישם אותו נגד חוט השדרה. הערה: באופן אידיאלי בגודל של שָׁרשׁוֹן מתאים לגודל של פתיחת האלקטרודה ובכך יוצר חותם בין התאים הפנימיים וחיצוניים של האלקטרודה. מאז מגברי ההפרש משמשים בדרך כלל להקלטות כאמור, כל פתיחה בין החלק הפנימי של האלקטרודה ותא ההקלטה מפחיתה את איכות האות ומקשה על למנוע רעש רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את קצב מיוצר על ידי ההכנה בתנאי normoxic (כלומר, aCSF מבעבע עם carbogen: 95% CO 2 O ו 5% 2) לפחות 20 דקות כדי לקבוע את הפרמטרים הבסיסיים של ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זלוף מaCSF-בועות carbogen לaCSF גירוי (כלומר, מבעבע עם 95% N 2, 5% CO 2 לגירוי היפוקסיה) במשך 15 דקות. לשנות משך חשיפה בהתאם לפרוטוקול הניסוי. רשום את משך החשיפה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים. השתמש בצינורות נירוסטה בין בקבוק aCSF ותא בכל הזדמנות אפשרית, כדי למנוע דיפוזיה גז לחלק החיצוני של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זלוף בחזרה לaCSF-בועות carbogen הסטנדרטי לפחות 15 דקות להקלטת התאוששות. שיא זה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את ההקלטה. </li></ol> 4. ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהאות המשולבת, לחשב את התדירות כמו מספר ההתפרצויות לדקה (באה לידי ביטוי בהתפרצויות / min), משרעת כהפרש בין קו הבסיס והשיא של הפרץ (בא לידי ביטוי בmV), משך הפרץ כמשך מ המתחילה ועד סופו של הפרץ (באה לידי ביטוי בים), אזור הפרץ כאזור תחת נוכve של הפרץ באות המשולבת (באה לידי ביטוי בmV · ים) (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את התדירות, משרעת, משך פרץ ואזור פרץ תחת normoxic (בסיס), חוסר חמצן (גירוי) ותנאים שלאחר חוסר חמצן התאוששות (לאחר הגירוי) כממוצע של 5 דקות האחרונות של הקלטות לכל מצב. אל תנתח את החלק הראשון של כל מצב, כי יש עיכוב בין מיתוג הומוגניזציה זלוף וaCSF בתא ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה אז גירוי (כלומר, היפוקסיה) ופוסט-גירוי ערכי התאוששות (כלומר, לאחר חוסר חמצן) כאחוז מערכי הבסיס להקלטה המקבילה. הגעה התוצאות כאמצעי ± SD </li></ol>

<ol>
	<li>Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+rhythm+of+breathing:+so+near,+yet+so+far.">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li><li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae.">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li><li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle.">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li><li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals.">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li><li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish.">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li><li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat.">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li><li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat.">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li><li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain.">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li><li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation:+an+approach+using+in+vitro+preparation.">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li><li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations.">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li><li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats.">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li><li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator:+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li><li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation.">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li><li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents.">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li><li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat.">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li><li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions:+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat.">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+five+agents/methods+for+anesthesia+of+neonatal+rats.">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li><li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats.">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li><li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups.">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li><li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane,+propofol,+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats.">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li><li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+on+extracellular+Ca2+/K++antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem.">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li><li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+acting+on+5-HT(1/2)+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression.">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats.">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li><li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice.">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li><li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation.">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li><li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat.">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li><li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity.">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li><li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command.">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li><li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice.">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li><li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro.">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla.">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li><li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizations+of+eupnea,+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation.">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests or conflicts of interests to disclose.

כימות מדויק של פעילות נשימה יכול להיות מאתגר. ואכן, נשימה היא פונקציה שיכולה להיות גם אוטומטי ורצון, וכי הוא מווסת בהתאם לסביבה, הצרכים של הגוף, המצב הרגשי וההתנהגות. היתרון של שיטה זו הוא הבידוד של האלמנטים העצביים האחראים לייצור את פקודת דרכי הנשימה. לפיכך, קלטות אלקטרו הכנות חוט השדרה וגזע מוח-plethysmography טכניקות משלימות ללמוד את כל הרשת עצבית בדרכי הנשימה במבחנת in vivo, בהתאמה. הקלטות תיקון מהדק בהכנת כבל גזע המוח-השדרה (למשל., מתקרבות ממשטח הגחון) הן גם מתקבלות על הדעת ולאפשר המחקר של נוירון מסוים ברשת נשימה השתמרה 24. פרוטוקול זה כולל כמה שלבים קריטיים, בעיקר בנתיחה. כדי למנוע נזק לרקמות עצבים,יש לבצע את כל השלבים לנתיחה במהירות ובדייקנות. רקמת העצבים לא צריכה להיפגע ותשומר בקפידה על ידי טבילה קבועה בaCSF. כפי שהוזכר קודם לכן, את איכות הקשר בין שָׁרשׁוֹן העצב ואלקטרודה היא שלב קריטי שני. שאיפה של שָׁרשׁוֹן יכולה להביא את האלקטרודה קרובה יותר להכנה. בעוד הקשר בין האלקטרודה וגזע המוח יכול לשפר את האיכות של החותם, יש להימנע מדיכאון או פגיעה בהכנה פיזית. האות המשולבת תמיד צריכה לשמש לניתוח, אבל אותות גלם יכולים להיות שימושיים כדי לבדל את הפרצים ראויים מרעשי רקע. יתר על כן, רמקול ניתן להוסיף להגדרה להקשיב לקצב ולקבוע את איכות אות ורעש רקע הווה על ידי אודישן. ואכן, כמה וריאציות בתחילת מחקר הרקע יכולות להיות נוכחת עקב הפרעה חשמלית וסיבה לבסיס יציב. interf כזהerences יש למנוע על ידי בדיקת חיבורי כבלים ושאיבת שורש על ידי אלקטרודה. יתר על כן, כי משרעת פרץ תלויה בשני רעשי הרקע ואת הקשר בין השורש ואת האלקטרודה, תדירות היא הרבה של פרמטר אמין. לפיכך, משרעת הפרץ תמיד צריך לבוא לידי ביטוי באחוזים מערכי בסיס כדי למנוע וריאציות בין-אישיות בשל התקנה. מגבלות של הטכניקה נקבעות על ידי הגיל של החיה שממנו ניתן תהיה לממש את ההכנה. זה מאפשר מחקר מדויק של הקמת כונן הנשימה המרכזי בלידה, שהוא מאוד מעניין ורלוונטי מבחינה קלינית, אך הוא מתמקד בגילים המוקדמים אלה ולא ניתן להרחיב את הגילים מאוחרים יותר. גילים מבוגרים יותר ניתן להשתמש בperfused arterially הכנות לב-גזע המוח עובדים 25, אבל עם שינויים משמעותיים בפרוטוקול (ראו להלן). הכנת כבל מבודדת גזע המוח-השדרה משרקנים בוגרים הייתה לפתחאד על ידי מורין-Surun et al. 26, שבגזע המוח הוא perfused דרך עורק basilar והקצב נרשם בעצב גולגולת XII. מגבלה נוספת היא משך הניסוי. ההכנה לא יכולה להיות כל הזמן ליותר מ -7 שעות בתנאים שתוארו קודם לכן 6. לכן, טכניקה זו אינה מתאימה לניסויים לטווח ארוך, גם אם הכנות מראשנים (ראה להלן) נשמרו 24 שעות במעבדה. ניתן ליישם שינויים שונים לטכניקה זו. כאן, אתגר חוסר חמצן שבוצע, אבל וריאציות גז אחרות הן גם מתקבלות על הדעת (לדוגמא., Hypercapnia 27 כמו גם וריאציות pH 28). באותו אופן, ההכנה ניתן perfused עם aCSF בי תרופות כבר נמס ומיושמות על גזע המוח כטיפול טרום 29 או במהלך 30 ההקלטה. במקרה זה, יכול להיות מואץ קצב 29 או האטת דאוn 30 על פי התרופה הניסיונית. יתר על כן, עם תא הקלטה מחולק, יכול להיות מיושם aCSF שונה על חלקים סלקטיבית של וריאציות ההכנה 6 וטמפרטורה 9 יכולים להיות מועסקות. מידור זה מאפשר לימוד המשמעות של חלקי גזע המוח שנבחרו בתופעות הנגרמות הגירוי. בעוד הטכניקה הציגה משתמשת חולדות שזה עתה נולדו, הוא גם ישים על מודלים בעלי חיים אחרים. שימוש בפרוטוקול דומה לזה שהגיש בקשה לחולדות, ניתן להשתמש בעכברים מיום הריונית 16 (E16) עד 12 P4. ההבדל העיקרי הוא הצורך לחמם וcarbogen בועות aCSF במהלך הניתוח. צבים, יכולים לשמש גם ראשנים וצפרדעים בוגרות; עם זאת, מינים אלה דורשים טכניקות שונות לנתיחה, וכן התאמות להרכב aCSF. טכניקה זו יכולה להיות גם בשילוב עם הקלטות תיקון מהדק על הפנים מקורי של ההכנה 31, המאפשרתהדמיה בו זמנית של אות פלט הרשת והפעילות של תא של רשת זו אחת מסוים. הדמיה צבע רגיש מתח יכולה להיות מיושמת גם בהכנות כבל גזע המוח-השדרה עכברוש היילוד למקם האזורים מופעלים על הפנים הגחון של גזע המוח 32. ניתוח C-FOS ההכנות גם יכול להתממש על מנת לזהות האוכלוסיות העצביות מעורבות בתגובות נשימה ספציפיות. לבסוף, ההכנה יכולה להיות שונה כדי לשמור על איברים אחרים, כגון לב 25, צלעות 6, או זלוף עורק פיסיולוגי עם מקצבים פיסיולוגיים אחרים 33. עם זאת, שינויים מאוד חשובים אלה ידרשו פרוטוקולי נתיחה אחרים.

נשימה היא פעילות מורכבת וחיונית הנשלטת על ידי המוח, המאפשרת dioxygen (O 2) ספיגה ופחמן דו חמצני (CO 2) חיסול. כונן הנשימה המרכזי מופק על ידי רשת מורכבת ממוקמת בגזע המוח בשני היונקים 1, דו-חיים 2, זוחלים 3, 4 ציפורים ודגים 5. גם אם המחקר של נשימה יכול להיות מעובד בvivo, חקירות מכניסטית מדויקות דורשות גישה ישירה לרשת שליטה בדרכי הנשימה. לשם כך, אדריאן וBuytendijk פיתחו הכנת דג זהב מופחתת, שבו אלקטרודות המונחת על משטח שיא גזע המוח קצב שנוצר קשור לאוורור זימים 5. גישה זו הותאמה לאחר מכן על ידי Suzue בשנת 1984 6 לשימוש במכרסמים שזה עתה נולד. כניסתו של תכשיר זה הובילה להתקדמות משמעותית בנוירוביולוגיה בדרכי הנשימה. מאז הוא פשוט יחסית, הטכניקה הציגה hבטרם ניתנים למגוון רחב של חקירות בסיסיות של התנהגויות מוטוריות קצביות ומקורותיהם במכרסמים שזה עתה נולד. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקליט את התשתית העצבית של פעילות שאיפה, קצב כמו-נשימה נקרא נשימה פיקטיבית, המיוצרת על ידי הרשת בדרכי הנשימה. שיטה זו יכולה להיות מועסק במגוון רחב של מטרות מחקר, מיקוד תגובות שאיפה לשינויים או פרמקולוגיה נשימה בסוג 7 ומהונדסים 8 שני חיות בר. בהתחשב בכך שהניסויים מבוצעים בטמפרטורה נמוכה, ללא afferents חושית, ובתנאים שבי הריכוזים של גלוקוז וO 2 בתוך aCSF גבוהים, שאלות הועלו לגבי הרלוונטיות הפיזיולוגיות של האות נרשמה. אמנם יש הבדלים ברורים בין in vivo ובתנאי מבחנה (למשל., התדירות של התפרצויות שאיפה) העובדה היא שהנוכחות שלמרכיבי הליבה של רשת הנשימה 6 לעשות את זה אפשרי ללמוד מקצב חזק הקשורים לתפקוד homeostatic חיוני 9,10. הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו הוא להקל על גישה ישירה לאלמנטי גזע המוח של הרשת בדרכי הנשימה, שהם כמעט ולא נגישים in vivo, במיוחד בתינוקות. גזע המוח ממוקם בתנאים מבוקרים בקפדנות: קצב שנרשם לא מווסת על ידי תשומות מביא היקפיים מהריאות או גופי התרדמה, המאפשר המחקר להתמקד בכונן הנשימה המרכזי עצמו 11. לפיכך, גישה זו מנוצלת ליישם גירויים ולהקליט את אות הפלט. בניגוד לplethysmography הקלטות, קצב הנשימה הוא מווסת על ידי כל מרכיביו בכל הגוף (לדוגמא., התנפחות ריאות, chemosensors ההיקפי), ולכן קשה ליישם גירויים מדויקים. בעכברוש ewborn, הפרוטוקול מורכב מהקלטת האות הרביעית הגחון שורש בגזע מוח מבודד וחוט השדרה קטוע, נשמר בנוזל מלאכותי Cerebro-השדרה (aCSF). קצב שנוצר על ידי הכנות כבל גזע המוח-השדרה מורכב מהתפרצויות איטיות בודדות שצמודות לאות השאיפה 9. הכנות כבל גזע המוח-השדרה מבודדות בקלות לצריבה בחולדות מיום שלאחר הלידה 0-4 (P0 - P4) 7. גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את תגובת חוסר חמצן של רשת דרכי הנשימה, וגם התגובה לhypercapnia, חמצת או סמים. פרוטוקול היפוקסיה חריף מוצג כאן. גירוי זה מתקבל על ידי נסיגה של O 2 בaCSF; גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את הסובלנות והיענות לעלבונות חוסר חמצן. הפרוטוקול גורם דיכאון קצב מהרגע הראשון ועד לסוף חשיפת היפוקסיה (איור 1) 12. דיכאון זה מתהפךבמהלך 12 התאוששות לאחר חוסר חמצן. בנוגע לעיצוב ניסיוני, חשוב לשים לב שפונס, הממוקם בחלקו מקורי של גזע המוח, יש פעולה מעכבת על הגנרטור קצב 8. כך, הכנות של גזע המוח וחוט השדרה מלאים מקורי להציג קצב נמוך יותר. הכללה של פונס במדגם המבודד להקלטה נקבעה בהתאם למטרת הניסוי 13; המחקר של השפעת פונטיני ברשת הלשד המוארכת ידרוש הקלטות עם ובלי פונס להשוות את התוצאות 14. יתר על כן, אחד היתרונות של שיטה זו היא האפשרות להארכת החלק מקורי של ההכנה לכולל mesencephalic ו / או אזורי diencephalic 15,16, כך שניתן להעריך את ההשפעה של אזורים אלה ברשת הנשימה פונטו-לשדי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td>Use under hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPM306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLU501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>343-02-0006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 573000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential AC amplifier</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moving averager</td>
			<td>CWE, Ardmore, PA, USA</td>
			<td>model MA-821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition system</td>
			<td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td>
			<td>model DI-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart software</td>
			<td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism sofware</td>
			<td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection chamber</td>
			<td>Plastic box (e.g. petri box) will do</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>MINIPULS 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

כפי שצוין במבוא, אחד היתרונות החשובים ביותר של טכניקה זו היא הגישה הישירה לגזע המוח ליישם גירויים שונים. כדוגמא, היפוקסיה יושמה כאן. איור 1. א.ב. מציג הקלטת פרוטוקול מלאה, עם שני תנאי normoxic וחוסר חמצן. איור 1.CE מציגה את קצב שנרשם בתנאי normoxic (כלומר, aCSF מבעבע עם 95% O 2 ו -5% CO 2 ב 26 מעלות צלזיוס). כפי שהודגם בעבר בהכנה מדויקת זה 11, התדירות היא כ -8 פרצים / דקה, ומשרעת הוא על 0.800 mV. שים לב שהמשרעת היא רק מעידה בגלל הווריאציות בין-ההכנה החשובה שלה. העקבות העליונות מייצגת את האות המשולבת בעוד העקבות הנמוכות מייצגת את אות הגלם. איור 1.DF מציג את קצב שנרשם בתנאי חוסר חמצן (כלומר., ACSF מבעבע עם 95% N 2 ו -5% CO &lt;תת&gt; 2 ב 26 מעלות צלזיוס). כמאופיין 23 בעבר, התדירות ירדה באופן דרמטי במהלך היפוקסיה. איור 1.GH מציגה פרץ אחד מראה דפוסים טיפוסיים בתנאי normoxic וחוסר חמצן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53071/53071fig1.jpg" /> 1. דוגמאות איור של הקלטות שהושגו מהכנות טבורי גזע המוח-השדרה. תפוקת נשימה שנרשמה משורש הגחון C4 מהיערכות מחולדות P4 תחת normoxic, חוסר חמצן ותנאי התאוששות לאחר חוסר חמצן ((אות משולבת) ו- (ב) אות גלם) . עבור כל מצב, הקלטות מוגדלות ((C) משולבות אות normoxic; (ד) אות חוסר חמצן משולבת; (אות normoxic גלם E); (אות חוסר חמצן גלם F)) ופרץ יחיד (() פרץ normoxic Gופרץ חוסר חמצן (H)) מוצג. כפי שהוזכר בטקסט, שים לב משרעת שיש לפרש בזהירות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53071/53071fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53071/53071fig2.jpg" /> איור 2. מסכם סכימה של ההתקנה. ACSF מבעבע מחומם ונשלח על ידי משאבה בתא ההקלטה. עודף aCSF בתא ההקלטה להישאף על ידי משאבה ולהיפטר ממנו. תא ההקלטה צמוד לקרקע ובקר הטמפרטורה. פלט אלקטרודה מועבר ישירות למגבר, אז למערכת רכישת נתונים Averager נע ו, ולבסוף המחשב. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53071/53071fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן t</a>o לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53071/53071fig3.jpg" /> פרמטרי פרץ איור 3. מנותחות. התדירות מחושבת כמספר ההתפרצויות לדקה (באה לידי ביטוי בהתפרצויות / min), משרעת כהפרש בין קו הבסיס והשיא של הפרץ (בא לידי ביטוי בmV), משך הפרץ כ המשך מההתחלה ועד סוף הפרץ (בא לידי ביטוי בים), אזור הפרץ כשטח מתחת לעקומה של הפרץ באות משולבת (בא לידי ביטוי בmV · ים). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53071/53071fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דְמוּת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording at JoVE.com

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

אלקטרופיזיולוגיה בהכנות כבל מבודדות גזע המוח-השדרה מיילוד מכרסמים מאפשרת הקלטת תפוקת רשת הנשימה עצבית

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Views.  Laval University. The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Video: Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress has been made in our understanding of differences in response properties of neurons in different cortical layers5-8, yet there is still a great deal left to learn about whether and how neuronal populations encode information in a laminar-specific manner.
Existing multi-electrode array techniques, although informative for measuring responses across many millimeters of cortical space along the cortical surface, are unsuitable to approach the issue of laminar cortical circuits. Here, we present our method for setting up and recording individual neurons and local field potentials (LFPs) across cortical layers of primary visual cortex (V1) utilizing multi-contact laminar electrodes (Figure 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc).
The methods included are recording device construction, identification of cortical layers, and identification of receptive fields of individual neurons. To identify cortical layers, we measure the evoked response potentials (ERPs) of the LFP time-series using full-field flashed stimuli. We then perform current-source density (CSD) analysis to identify the polarity inversion accompanied by the sink-source configuration at the base of layer 4 (the sink is inside layer 4, subsequently referred to as granular layer9-12). Current-source density is useful because it provides an index of the location, direction, and density of transmembrane current flow, allowing us to accurately position electrodes to record from all layers in a single penetration6, 11, 12.

A fundamental issue in our understanding of cortical circuitry is how networks in different cortical layers encode sensory information. Here we describe electrophysiological techniques utilizing multi-contact laminar electrodes to record single-units and local field potentials and present analyses to identify cortical layers.

בחינת עיבוד הרשת המקומית באמצעות מגע Multi-אלקטרודה למינרית הקלטה

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

בקנה מידה גדול הקלטה של ​​הנוירונים על ידי בדיקות מטלטלין סיליקון מתנהג מכרסמים

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

עצבית במעגל הקלטה ממערכת עצבים מקק שלמה

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...