אנו מודים Hyewon קופר לאיורים.

1. בתור יש תמיסת מלח מקק בשימוש בכל פרוטוקול זה את ההרכב הבא: תמיסת מלח מקק 36: (גרם ל100 מיליליטר) 210 מ&quot;מ NaCl (1.227 ז) 2.9 מ&quot;מ KCl (.0216 ז) 1.8 מ&quot;מ CaCl 2 (.0265 ז) 0.2 מ&quot;מ אא 2 PO 4 • 2H 2 O (g 0.0032) 1.8 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (g 0.0483) (PH 7.2. התאם ל-pH עם 1 M NaOH או 1 M HCl). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מקק גברי מהטנק מחזיק שיש cerci חזק (איור 1). הקטעים האחרונים של הזכר צרים בהשוואה לנשים, ומכילים לא השחלות ומסת ביצה, זכרים הם קלים יותר לנתח. הזכרים של פ יש לי אמריקנה זוג מחט קצרה בין cerci. מחט אלה לא נצפו בנקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הכנפיים, הרגליים וראש ולהצמיד את הגוף, צד עד הגחון, לdish מצופה סיליקון אלסטומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים להרים את צלחות הגחון וקטעו אותם עם מספריים בסדר, מתחילים בקצה האחורי ועובדים anteriorly. תמיד לשמור על האיברים הפנימיים לחים עם מי מלח בעת שניסה לשמור על יבש cerci. אפשר להשתמש בשעווה או חתיכות גומי כדי למקם את כלפי מעלה הבטן כדי למנוע מלוח מהרטבת cerci. אם הם נרטבים, לייבש אותם עם חתיכת נייר הטישו. לדחוף לצד האיברים הפנימיים וחומר הלבן (שומן בגוף). VNC היא במרכז השדה, מפעיל את האורך של הבטן וצריך להיות גלוי בין tracheae המבריק. חוט העצב הוא שקוף ועשוי בתחילה להיות קשה לראות עד התאורה מותאמת כראוי (איור 2). לא להתמודד עם VNC עם מלקחיים או סיכות חרקים; במקום לתפעל אותו באמצעות בדיקות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק מערכת tracheae של בעל החיים בצורה הטובה ביותר שאפשר מחוט העצב עם מלקחיים ועם זוג צורך זכוכית עדינהles, לפצל בזהירות רבה connectives VNC אורכים בין A6 וA5 או A5 וגרעיני A4 (איור 3). עריסת cerci ובטן כלפי מעלה אל מחוץ לאמבטיה מלוחה עם סיכות קיצרו חרקים ושעווה או טריז של אלסטומר סיליקון שניתן לחתוך כך שיתאימו להכנה (איורים 4 א &#39;וב&#39;). להיות זהיר במיוחד בקטע הבטן האחרון שלא לפגוע בעצבי cercal שמקרינים לגנגליון (2D ואיורים 5). </li></ol> 2. הקלטה תאית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון ההכנה, מיקרוסקופ, והקלטה גזור צריך להיות התקנה בתוך כלוב פאראדיי לחסום במיוחד AC, שדות חיצוניים, חשמליים, שיכול לעקוף אותות מתא העצב (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המיקרוסקופ כך שהוא משקיף על הבמה מיקרוסקופ. לאחר ההכנה מושם על הבמה, להתאים את המיקום של אלומת הפנס בעוצמה הגבוההלהדמיה הטובה ביותר שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את מגבר ההפרש AC / DC ליחידת הקלטת נתונים המשולב (פרטים על הגדרות חומרה ותוכנה הספציפיות כבר תאר 25 בעבר). שלב הראש מחזיק האלקטרודה יניקה צריך להיות מחובר למגבר. חוט כסף קרקע שכבר מצופה בCl - מוכנס לתוך תוצאות הבטן בהקלטות יציבה יותר. הסיבה לכך היא אם הפתרון בחלל הגוף הוא לא במגע עם נוזל הרחצה בצלחת, הנוזל הקשורים לאלקטרודה ההקלטה נשאר מקורקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תדירות ההקלטה עד 4 קילוהרץ. הגדר את קנה המידה המתח (ציר y) ל500 mV (זה יכול להיות מותאם כדי לייעל ויזואליזציה של העקבות). הפעל את תוכנת הקלטה במצב רציף או אוסצילוסקופ להקליט פעילות עצבית בתגובה לגירויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים אחד connectives VNC הקרוב לA5 ולמקם את הקצה החתוך מצורף A6 לתוך האלקטרודה יניקה. הקפד pמלוח ull לתוך האלקטרודה היניקה כדי לכסות את חוט הכסף בתוכו לפני שמוצץ בעצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אוויר מכת פיפטה יבש לשערות הממוקמים על כל cercus. לראות אם מגרה את השערות על ipsilateral cercus לחיבור נרשם נותן תגובה שונה מאשר נגדי אחת. שימו לב למשרעת של התגובות ומספר הקוצים במרווח זמן נתון במהלך הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את האלקטרודה היניקה לעצב cercal להקלטה. כדי לקבל כושר, מתג טוב יותר לקצה האלקטרודה עם פתח קטן יותר במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העצב הקרוב cercal לA6 ולאחר מכן למצוץ את העצבים מובילים אל cercus. לא צריך להיות ירי ספונטני של פוטנציאלי פעולה. עכשיו, לפוצץ באוויר על cercus ולציין את התגובות. </li></ol> 3. גירוי חשמלי לעצבים התחושתיים קבע גיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את תוכנת הצריבה לטאטא מצב כך שהוא מתעד את העקבות (MSE 100-500ג.) בכל פעם שגירוי מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה מגרה לתפוקה של ממריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כבל ממריץ עם מוביל מיני קרס שתיים או קליפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את יציאת הדק BNC מהממריץ לכניסת ההדק על יחידת ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרמטרים הגירוי הבאים צריכים לעורר תגובה: משך: 0.3 שניות; עיכוב: 10 אלפיות שנייה; תדר: 1 הרץ; מתח: להתאים לפי צורך כדי לקבל אות בהקלטות (רק מעל הסף ולהיות מסוגל לקבל תגובה מקסימלי). אין שום סיבה ללכת למתחים גבוהים בהרבה מסף מקסימאלי לגיוס כמתח גבוה יכול להזיק לעצבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עצב cercal כדיסטלי ככל האפשר, כך ששורש עצב ארוך יכול להיות מורם אל תוך האלקטרודה יניקת הגירוי (איור 7, ראש חץ). ניתן להשתמש בם החיבור בין A6 וA5 או קטע אחר קדמי יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האלקטרודה יניקת הקלטה, כך שאתה יכול pull את חיבור לחתוך לאלקטרודה. הקפד למשוך כמה מלוחה לאלקטרודות היניקה כדי לכסות את חוט הכסף בתוכו לפני שמוצץ בעצבים. ודא את האלקטרודה מגרה היא גם מעוגנת במלח האמבט (בבטן ליד A3 הוא אידיאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק סדרה של גירויים בודדים של מתח גובר, עד פוטנציאל פעולה מופיע על המסך. אחד צריך לעשות תקליט של מתח המגרה המינימלי ומשך לגייס תגובה. הגבר את העצמה עד שתגובה הסינפטית בconnectives הוא ציין. עלייה הגדולה (APS תאי) מאקסונים הענק מופיעה ראשונה, ולאחר מכן קטן יותר של AP אחר עשויים גם להיות שנצפה. </li></ol>

<ol>
	<li>Full, R. J., Tu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+rapid+running+insect:+two-,+four-+and+six-legged+locomotion.">Mechanics of a rapid running insect: two-, four- and six-legged locomotion.</a> J. Exp. Biol. 156, 215-231 (1991).</li><li>Ritzmann, R. E., Tobias, M. L., Fourtner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flight+activity+initiated+via+giant+interneurons+of+the+cockroach:+Evidence+for+bifunctional+trigger+interneurons.">Flight activity initiated via giant interneurons of the cockroach: Evidence for bifunctional trigger interneurons.</a> Science. 210, 443-445 (1980).</li><li>Libersat, F., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cercal+position+during+flight+in+the+cockroach:+a+mechanism+for+regulating+sensory+feedback.">Control of cercal position during flight in the cockroach: a mechanism for regulating sensory feedback.</a> J. Exp. Biol. 136, 483-488 (1988).</li><li>Ganihar, D., Libersat, F., Wendler, G., Cambi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wind-evoked+evasive+responses+in+flying+cockroaches.">Wind-evoked evasive responses in flying cockroaches.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 175, 49-65 (1994).</li><li>Pipa, R. a. D., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The American Cockroach. , 175-216 (1981).</li><li>Westin, J., Langberg, J. J., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+giant+interneurons+of+the+cockroach;+Periplaneta+americana+to+wind+puffs+of+different+directions+and+velocities.">Responses of giant interneurons of the cockroach; Periplaneta americana to wind puffs of different directions and velocities.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 121, 307-324 (1977).</li><li>Camhi, J. M., Tom, W., Volman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+escape+behavior+of+the+cockroach+Periplaneta+americana.">The escape behavior of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 128, 203-212 (1978).</li><li>Nicklaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Erregung+einzelner+Fadenhaare+von+Periplaneta+americana+in+Abh&#228;ngigkeit+von+der+Gr&#246;sse+und+Richtung+der+Auslenkung.">Die Erregung einzelner Fadenhaare von Periplaneta americana in Abh&#228;ngigkeit von der Gr&#246;sse und Richtung der Auslenkung.</a> Z. Vgl. Physiol. 50, 331-362 (1965).</li><li>Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+wind+recorded+from+the+cercal+nerve+of+the+cockroach+Periplaneta+americana.">Responses to wind recorded from the cercal nerve of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 133, 97-102 (1979).</li><li>Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 93-131 (1984).</li><li>Ritzmann, R. E., Pollack, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thoracic+interneurons+that+mediate+giant+interneuron-to-motor+pathways+in+the+cockroach.">Identification of thoracic interneurons that mediate giant interneuron-to-motor pathways in the cockroach.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 159, 639-654 (1986).</li><li>Plummer, M. R., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+sensory+signals+from+noise+in+the+escape+system+of+the+cockroach+-+the+role+of+wind+acceleration.">Discrimination of sensory signals from noise in the escape system of the cockroach - the role of wind acceleration.</a> J. Comp. Physiol. 142, 347-357 (1981).</li><li>Bullock, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 1-14 (1984).</li><li>Pollack, A. J., Ritzmann, R. E., Watson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+for+tactile+sensory+information+to+thoracic+interneurons+in+the+cockroach.">Dual pathways for tactile sensory information to thoracic interneurons in the cockroach.</a> J. Neurobiol. 26, 33-46 (1995).</li><li>Atwood, H. L., Wiersma, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Command+interneurons+in+the+crayfish+central+nervous+system.">Command interneurons in the crayfish central nervous system.</a> J. Exp. Biol. 46, 249-261 (1967).</li><li>Olson, G. C., Krasne, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crayfish+lateral+giants+as+command+neurons+for+escape+behavior.">The crayfish lateral giants as command neurons for escape behavior.</a> Brain Res. 214, 89-100 (1981).</li><li>Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+cockroach+escape+behavior+with+lesions+of+individual+giant+interneurons.">Analyzing cockroach escape behavior with lesions of individual giant interneurons.</a> Brain Res. 335, 342-346 (1985).</li><li>Comer, C. M., Dowd, J. P., Stubblefield, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+responses+following+elimination+of+the+giant+interneuron+pathway+in+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Escape responses following elimination of the giant interneuron pathway in the cockroach, Periplaneta americana.</a> Brain Res. 445, 370-375 (1988).</li><li>Keegan, A. P., Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wind-elicited+escape+response+of+cockroaches+(Periplaneta+americana)+is+influenced+by+lesions+rostral+to+the+escape+circuit.">The wind-elicited escape response of cockroaches (Periplaneta americana) is influenced by lesions rostral to the escape circuit.</a> Brain Res. 620, 310-316 (1993).</li><li>Casagrand, J. L., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+amines+modulate+synaptic+transmission+between+identified+giant+interneurons+and+thoracic+interneurons+in+the+escape+system+of+the+cockroach.">Biogenic amines modulate synaptic transmission between identified giant interneurons and thoracic interneurons in the escape system of the cockroach.</a> J. Neurobiol. 23, 644-655 (1992).</li><li>Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+ascending+giant+fiber+system+in+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Organization of the ascending giant fiber system in the cockroach, Periplaneta americana.</a> J. Exp. Zool. 108, 243-261 (1948).</li><li>Ramos, R. L., Moiseff, A., Brumberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+and+versatility+of+extracellular+recordings+from+the+cockroach+for+neurophysiological+instruction+and+demonstration.">Utility and versatility of extracellular recordings from the cockroach for neurophysiological instruction and demonstration.</a> J. Undergrad. Neurosci. Educ. 5, (2007).</li><li>Oakley, B., Schafer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+neurobiology.">Experimental neurobiology.</a> , (1978).</li><li>Welsh, J. H., Smith, R. I., Kammer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory exercises in invertebrate physiology. , (1968).</li><li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen:+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception.">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).</li><li>Bacon, J. P., Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+sensory+neurons+in+mutant+cockroaches+compete+with+normal+cells+for+central+targets.">Ectopic sensory neurons in mutant cockroaches compete with normal cells for central targets.</a> Development. 115, 773-784 (1992).</li><li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-factors+and+co-repressors+of+Engrailed:+expression+in+the+central+nervous+system+and+cerci+of+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Co-factors and co-repressors of Engrailed: expression in the central nervous system and cerci of the cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tiss. Res. 327, 177-187 (2007).</li><li>Blagburn, J. M., Gibbon, C. R., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+engrailed+in+an+array+of+identified+sensory+neurons:+comparison+with+position,+axonal+arborization,+and+synaptic+connectivity.">Expression of engrailed in an array of identified sensory neurons: comparison with position, axonal arborization, and synaptic connectivity.</a> J. Neurobiol. 28, 493-505 (1995).</li><li>Booth, D., Marie, B., Domenici, P., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+behavior:+engrailed+knock-out+changes+cockroach+escape+trajectories.">Transcriptional control of behavior: engrailed knock-out changes cockroach escape trajectories.</a> J. Neurosci. 29, 7181-7190 (2009).</li><li>Schrader, S., Horseman, G., Cokl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensitivity+of+wind-sensitive+giant+interneurons+in+the+cave+cricket+Troglophilus+neglectus.">Directional sensitivity of wind-sensitive giant interneurons in the cave cricket Troglophilus neglectus.</a> J. Exp. Zool. 292, 73-81 (2002).</li><li>Libersat, F., Goldstein, R. S., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsynaptic+regulation+of+sensory+activity+during+movement+in+cockroaches.">Nonsynaptic regulation of sensory activity during movement in cockroaches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 8150-8154 (1987).</li><li>Stern, M., Ediger, V. L., Gibbon, C. R., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cercal+filiform+hair+sensory+neurons+in+the+first-instar+cockroach+restores+escape+behavior.">Regeneration of cercal filiform hair sensory neurons in the first-instar cockroach restores escape behavior.</a> J. Neurobiol. 33, 439-458 (1997).</li><li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+specificity+in+the+first+instar+cockroach:+patterns+of+monosynaptic+input+from+filiform+hair+afferents+to+giant+interneurons.">Synaptic specificity in the first instar cockroach: patterns of monosynaptic input from filiform hair afferents to giant interneurons.</a> J. Comp. Physiol A. 166, 133-142 (1989).</li><li>Watanabe, H., Ai, H., Yokohari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+activity+patterns+of+odor-induced+synchronized+potentials+revealed+by+voltage-sensitive+dye+imaging+and+intracellular+recording+in+the+antennal+lobe+of+the+cockroach.">Spatio-temporal activity patterns of odor-induced synchronized potentials revealed by voltage-sensitive dye imaging and intracellular recording in the antennal lobe of the cockroach.</a> Front. Sys. Neurosci. (6), 55 (2012).</li><li>Nishino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+and+olfactory+input+segregation+in+the+mushroom+body+calyces+in+a+basal+neopteran,+the+American+cockroach.">Visual and olfactory input segregation in the mushroom body calyces in a basal neopteran, the American cockroach.</a> Arthropod Struct. Dev. 41, 3-16 (2012).</li><li>Elia, A. J., Gardner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+DDT+on+the+behavior+and+central+nervous+system+activity+in+Periplaneta+americana.">Long-term effects of DDT on the behavior and central nervous system activity in Periplaneta americana.</a> Pestic. Biochem. Physiol. 21, 326-335 (1984).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

אחת הסיבות למציגים טכניקות להכנה הקלסית הזה הוא שמערכת cerci הייתה ועדיין הוא אזור פעיל של מחקר בהתמודדות עם שאלות של הפיתוח של מעגלים עצביים, כמו גם שאלות לגבי תיקון הסינפטי והתחדשות 26-31. כך או שיטה לעורר פעילות בחוט עצב הגחון המקק יכולה לשמש כדי לבחון את ההשפעות של סוכנים או חומרי הדברה תרופתיים על תפקוד מערכת עצבים. ניסויים אלו נעשים פשוט על ידי המסת כימיקלים neuroactive למלוחה. אחרי שהחלפתי את הפתרון הזה עם מדיום הרחצה הרגיל, שינויים בפעילות עוררת או ספונטנית אפשר לראות בעת ההקלטה מconnectives או עצב מוטורי לתת קריאת נתונים של ההשפעה של החומר הכימי על תפקוד מערכת העצבים המרכזית עולים בקנה אחד. כמו בכל הניסויים נוירופיזיולוגיות בעיה נפוצה היא רעש חשמלי. הגורם כנראה הגדול ביותר באיכות אות להכנות אלה iשל חותם האלקטרודה היניקה על רקמת העצב. חותם חזק שלא לצייר לגמרי בעצב או חיבור cercal הוא אידיאלי. הקלטות גם יכולות להתבצע באמצעות אלקטרודות וו כפולה ממוקמת מתחת לחוט העצב ובידוד VNC בתערובת של שמן מינרלים ווזלין. התערובת יכולה להיות טעונה לתוך מזרק וגורשה סביב חוט העצב 32. גם נתיחה זהירה היא קריטית כאן כמו בכל הכנה של מערכת העצבים המרכזית. חלקם עשוי למצוא את זה קל יותר לגשת למערכת העצבים המרכזית על ידי לנתח הציפורן הגבי. אמנם זה מקטין את האפשרות של פגיעה בעצב בחוט הגחון זה יכול להיות קשה יותר להסיר את כל הקרביים שימוש בגישה זו. זה לא תואר כאן, אבל הכנה זו ניתנת להקלטה תאית בinterneurons הענק 32,33. חוט העצב כולו ניתן גם להסיר כדי להתאים כמה אלקטרודות הקלטה ומגרה בו זמנית. בחקר עובדה של אונה, בו פטריות מחושיםdy, ומבנים במערכת העצבים המרכזית קדמי אחרים הוא עדיין בעיצומה 34-35. אמנם תיקן מערכת העצבים המרכזית ממשיך לשפוך אור על מחקר הנוירוביולוגי מודרני ההכנה הספציפית הזה היא פשוטה מספיק כדי לשמש במעבדות אקדמיות לתואר ראשון.

יש יותר מ -4,000 מיני מקק אלא רק על 30 הם ביתיים מזיקים. אולי המוכר ביותר הוא אמריקנה Periplaneta התיקן האמריקאי misnamed שמקורו באפריקה, וכעת הוא נמצא כמעט בכל מקום על פני כדור הארץ. בנוסף למהירות שלו המהירה הריצה 1 והתנהגות מתחמקת, באזורים הטרופיים פ אמריקנה מסוגלת 2,3 טיסה. המאפיינים העיקריים של מערכת מקק העצבים המרכזית (CNS) הם הטבע שלה מפולח וביזור שליטת תהליכי 4,5. המוח, בית החזה, וגרעיני בטן הם חברו יחד על ידי connectives interganglionic לזווג כדי ליצור את חוט עצב הגחון (VNC). הגרעינים בכל פלח הם שילוב מרכזים. הם מורכבים מאזור חיצוני, קליפת המוח מכיל תאים אחראים על מחסום חדירות דם למוח ממש מתחתיהם, וsomata של origi נוירוניםnating בגנגליון ש. somata אלה עשויים להשתייך לinterneurons, הנוירונים ויסות, או נוירונים מוטוריים. הם מספקים אקסונים הנשארים בתוך הגנגליון ממוצא (interneuron המקומי), או אקסונים שפרויקט בין הגרעינים של מערכת העצבים המרכזית (interneurons interganglionic) או שתסתיימו בתאי שריר היקפי (הנוירונים מוטוריים). רוב somata ממוקם ventrally או ventrolaterally בקליפת ganglionic 5. Connectives לזווג, interganglionic מכיל רק אקסונים ולא גופי תא עצביים. Neuropil של הגנגליון מכילה תאי גליה (neuroglia), קטעי האקסון, צרורות של אקסונים ודנדריטים (neurites) של נוירונים. Neuropil נטולת גופי תא עצביים. זהו האזור בתוך הגנגליון שבו תקשורת הסינפטי ישירה בין תאי עצב ואינטגרציה של תשומות להתרחש. יכולתו של התיקן האמריקאי פ אמריקנה לזהות ופתאום להגיב לטורף מתקרב (רגל, האןד, וכו &#39;.) יוחס למעגל רפלקס שמורכב מcerci ו6,7 מערכת סיבים הענק. Cerci הוא זוג, מבני רוח רגישה כמו קרן ממוקמים בקצה של הבטן (איור 1). בפ אמריקנה פני השטח הגחון של כל cercus מכיל כ 200 filiform (חוט) שערות המסודרים ב14 עמודות. תשעה עמודים אלה יכולים להיות מזוהים באופן עקבי בבעלי חיים שונים על פי מאפייני התגובה של תא קולטן הקשורות ואקסון. כל שערה היא בשקע המאפשר לה להתכופף בקלות ביותר במישור אחד שהוא ספציפי עמודה. תנועה של השיער בכיוון אחד לאורך המטוס שלה גורמת לשלילת קוטביות בתא קולטן ופרץ של פוטנציאל פעולה (APS) בתא העצב התחושתי. תנועה בכיוון ההפוך מעכבת כל נקודתי גישה ספונטניות שוטפת 8. המטוס המועדף של סטיה והכיווניות של התגובה הוא שונה בכל טור. לפיכך, filiforמתחמים מ &#39;שיער קולטן אחראים לא רק לאיתור התנועה של אוויר, אלא גם עבור&#39; קידוד &#39;, בצורה של נקודתי גישה, הכיוון שממנו זרם האוויר שמקורו. עיבוד מידע זה על ידי מערכת העצבים המרכזית גורם לתגובה מתאימה &quot;בריחה 6,7. ייחוד זה פונקציונלי, עמודים של השערות חושיות נשמר מבעלי החיים לבעלי חיים. תא קולטן של כל שיער filiform אחראי לtransducing הסטייה מכאנית של השיער לאירוע עצבי (וכתוצאה מכך פרץ או עיכוב של נקודתי גישה בהאקסון של תא קולטן 9. נקודתי הגישה לנסוע לגנגליון בטן המסוף (A6) באמצעות cercal XI עצב, שם הם סינפסה עם אקסונים ענק של חוט עצב הגחון (VNC). הם האמינו אקסונים הענק שיהיו אחראי על העברת והעירור הבא של הנוירונים מוטוריים שגורם לבריחת התנהגות 6,10,11. O חביון התנהגותייםf תגובת הבריחה של פ אמריקנה היא אחת הקצר ביותר של כל בעל חיים 7. חביון התנהגות הוא הזמן שבין הגעתו של גירוי בmechanoreceptor והייזום של תגובת בריחה. בניסויים באמצעות צילום במהירות גבוהה כדי להקליט את ניסיון הבריחה מקרפדה לתקוף, המקק נצפה להתחיל התור שלה הרחק מהקרפדה בכ -40 אלפיות שניים (זמן מתחילת הארכת לשון למקק תנועת 7,12. שימוש פחזנית רוח מבוקרת ניסויים אחרים, חביון התנהגותיים יכול להיות מופחת ל11 אלפית שניים. גילו כי מהירות משב רוח מינימאלית של מ&quot;מ 12 / אלפיות שניים (עם האצת 600 מ&quot;מ / msec 2) יכולה לעורר תגובת בריחה, ואילו מהירויות נמוכות עוד יותר (3 מ&quot;מ / שניות) הנגרם על הליכה איטית מקקים להפסיק לנוע 12. המתאם החזק שקיים בדרך כלל בין מערכות סיבים ענקית ובריחת התנהגות תועד היטב 13,14. בinstances בי תא מסוים הוא הכרחי ומספיק כדי לעורר התנהגות מסוימת של התאים המכונה נוירון פקודה 15,16. interneurons הענק (GIS) במעגל בריחת רוח של פ אמריקנה נחוצות לא לרפלקס. בעלי חיים שהניסוי ablated חיילים אמריקאים עדיין מפגינים התנהגות הבריחה ולכן חיילים אלה לא נחשבים נוירונים פקודת 17,18. ניתוק connectives צוואר הרחם, כי הם מקורי למעגל הסנסורית גם משפיע על ההתנהגות, מצביע על כך שיש יורד קלט ממוח השפעה על כיוון הבריחה 19. היבטים אלה של שליטה ויתירות קנס הם בעל חשיבות עליונה להישרדותו של האורגניזם ומשלימים אפנון neurochemical באמצעות אמינים יוגניים 20. פ הכנת חוט עצב אמריקנה כבר מערכת מודל אלגנטית לneuroethologists במשך עשרות שנים רבות בעבר החל בעבודתם החלוצית של רדר &lt;sup&gt; 21. זה מאפשר לתלמידים להקליט, להציג ולנתח את פעילות העיקרית חושית ותגובות שנוצרה על ידי interneurons הענק ל22,23,24 הקלט שלהם. בנוסף להעברת הרעיון שמעגלים עצביים הניתנים לזיהוי בבסיס תגובות התנהגותיות לסביבה, התרגילים האלה צריכים להנחיל הערכה לתרומתם הביולוגית שנעשתה על ידי מזיקים ביתיים נפוצים זה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

הכנת כבל עצב הגחון המקק היא מערכת צייתנית לניסויי neuroethology, דוגמנות רשת עצבית, ובדיקת ההשפעות הפיזיולוגיות של חומרי הדברה. מאמר זה מתאר את היקף מערכות חוש מקק שיכול לשמש לassay איך מערכת עצבים של חרקים מגיבה להפרעות סביבתיות. דגש כאן הוא על הבריחה בתיווכו של cerci להעברת סיבים ענק באמריקנה Periplaneta ההתנהגות. זה בהכנת אתר דורש רק מיומנות לנתח מתונה ומומחיות אלקטרו ליצור הקלטות לשחזור של פעילות עצבית. אז יכולים להיות מיושמים פפטידים או כימיקלים אחרים באופן ישיר למערכת העצבים בתמיסה עם תמיסת מלח הפיזיולוגי. חרקים יכולים גם להינתן לפני לנתיחה ומעגל הבריחה יכול לשמש כמדד למצבו הנרגש של מערכת העצבים המרכזית. בהקשר זה מבחני שתוארו במסמך זה יהיו שימושי גם לימיןesearchers המעוניין בהתחדשות איבר ואת האבולוציה של התפתחות מערכת עצבים שלפ אמריקנה היא אורגניזם מודל שנקבע.

גירוי של שערות על cerci ידי משב אוויר גורם לפריקות של עצב סנסורי עיקרי שניתן להקליט באמצעות אלקטרודות יניקה תאית מצורפים או לconnectives בין גרעיני בטן או עצב cercal עצמו (איור 8). אמפליטודות ספייק נרשמה משני האזורים הן בסדר הגודל של כמה מיקרו וולטים למיליוולט. בגלל אינטגרציה חושית בגנגליון מספר הקוצים שנצפו בפוטנציאל הפעולה המורכב או כקוצים בודדים שנרשמו מעצב cercal להפליא יותר מאשר נצפה בהקלטות מconnectives. עם זאת גם לציין כי יש באופן משמעותי פחות רעש בהקלטה בחיבור בשל החותם הדוק יותר בין האלקטרודה ורקמת העצבים. על ידי מתנשף אוויר בקוצים הגדולים cerci ניתן לצפות בconnectives (איור 8 א). שימוש בשיטה זו מגרה, קלטות בין A3 ו-A4 טיפוסי<html> ly להראות אופייני ספייק גדול של interneuron הענק (ים). הקלטה מעצב cercal תוך שפשוף cerci עם מלקחיים פיזי הופקה חזה חזק של פעילות (איור 8 ב 1). בהקלטה אחרת, 2 נשיפות של אוויר בכל המיוצרים על תגובת קורע מהירה בעצב cercal (איור 8 ב 2). כאשר גירוי חשמלי עצבי cercal עם האלקטרודה יניקה והקלטה בחיבור בין A3 ו-A4, אפשר להתבונן בסף הגירוי לעורר תגובות (איור 8C 1). הגירוי החשמלי של עצב cercal בבירור מעורר תגובה בconnectives שניתן לכמת ללימודים מניפולטיביים עם סוכנים תרופתיים או הסביבתי המקומי מקיף, כגון טמפרטורה (איור 8C 2). <html> fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. אמריקנה Periplaneta עם cerci ללא פגע. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> איור 2. תצוגת הגחון של חוט עצב מקק כפי שראו עם ציפורן הגחון הוסרה (). תצוגה מוגדלת של המגזר שהותווה על ידי חיצים נראית ב( ב &#39;). ב (ג) connectives נשפך בין A4 ו-A3 עם בדיקה זכוכית. הגנגליון בטן 6 ה מוצג ב( ד &#39;) עם שני עצבי cercal עוזבים בסוף הזנב. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> איור 3. תצוגת הגחון סכמטי של חוט עצב מקק. י&quot;ש &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> איור 4. Cerci מוצב כלפי מעלה אל מחוץ לאמבטיה מלוחה. יכולה להיות מוצפת הבטן פתחה עם מי מלח (א &#39;) עם קצה הזנב של המקק שמוגבה עם תקוע פיסה בצורה קטנה של אלסטומר סיליקון על מנת לשמור cerci החוצה באמבטיה (ב &#39;). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> איור 5. הגנגליון הבטן ה -6 עם עצב cercal (שתואר על ידי חיצים). <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> איור 6. הציוד להגדיר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה lar</a>דמות ger. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> איור 7. להגדיר מגרה והאלקטרודה הקלטה. <img alt="איור 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> איור 8. הקלטות עצביות של connectives ועצב cercal עם נהלי גירוי שונים. הקלטה עם האלקטרודה יניקה מconnectives בין A3 ו-A4 בעוד מתנשפים אוויר בcerci (א &#39;). הקלטה מהנוירונים cercal העיקריים עם האלקטרודה יניקה תוך שפשוף או פיזי (ב 1) או מתן נשיפות אוויר (ב 2) תוצאות בפרצים מהירים של פעילות בעצב cercal. גירוי חשמלי עצבי cercal מייצר תגובות בconnectives ( <strong&gt; C 1). שים לב העלייה ההדרגתית בעוצמת הגירוי (חיצים מצביעים על המשרעת של חפץ המגרה) ואת עוצמת עוררו התגובות הבאות. הגירוי החשמלי של עצב cercal מספק אמצעים יחסית יותר מבוקרים של גירוי העצבי cercal לעקביות בגירוי לכימות התגובות (C 2).

Watch this Scientific Journal Video about Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System at JoVE.com

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

מאמר זה מתאר את נתיחת מקק הגחון עצב בחוט והקלטות תאית מן העצב וconnectives cercal. עוררו תגובות מופקות על ידי גירוי חשמלי של עצב cercal או הגירוי מכאני ישיר של cerci.

עצבית במעגל הקלטה ממערכת עצבים מקק שלמה

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.2K Views.  University of Kentucky.  מאמר זה מתאר את נתיחת מקק הגחון עצב בחוט והקלטות תאית מן העצב וconnectives cercal. עוררו תגובות מופקות על ידי גירוי חשמלי של עצב cercal או הגירוי מכאני ישיר של cerci. 

Video: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

חשיפת טופוגרפיה מעגלים עצביים Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...