Name: implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms at JoVE.com

The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. הערכה במערכת העיכול 50 למגרש (ים) של ריבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומת צמיחה (ים) לשורות תאים של עניין על מנת להעריך את צפיפות הזריעה המתאימה. עלילה מספר התאים בנקודות זמן שונות הבאים זריעה (ימים 2, 4, 6 ו -8) ביחס ליום 0. זה יספק שיעור צמיחה יחסי של הקו הסלולרי של עניין ויש להשתמש כדי להעריך את צפיפות הזריעה הראשונית כך ש מפגש הוא לא הגיע ב96-גם צלחות תוך 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעקומות גדילה נקבעו, מספר המתאים של תאי זרע בלוחות שאינם שקופים, ברורים תחתון 96-גם בתקשורת של תא 100 μl להעריך GI 50. זרע מספר התאים המבוססים על קו התא המשמש ונקבע ב1.1. בדרך כלל, זרע 3x10 3 תאים לשורות תאים בצמיחה מהירות עם הכפלה זמן של ~ 24 שעות, למשל., HCT116. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת assay (יום 1). לצלחת assay, תאי זרע בצפיפות רצויה בתקשורת והתרבות שלי 100 μln בארות המוצלים בכחול (איור 1). ולס מודגש בלבן מכיל רק תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת שליטה (יום 1). לצלחת השליטה, זרע אותה הצפיפות של תאים כמו בשלב 1.2.1 בשל תקשורת בתרבות 100 μl בצלחת נפרדת 96-היטב. קריאה זו &quot;יום 0 &#39;תעזור בפרשנות הטבע ציטוטוקסיות / cytostatic של התרכובות שנתחה (איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (היום 0), לקרוא את צלחת השליטה. לאזן מגיב כדאיות תא זורח (מצע cellTiter-Glo מעורב עם חיץ לפי הוראות יצרן) לRT ומערבבים בעדינות על ידי היפוך תוכן כדי להשיג פתרון הומוגני. להוסיף 80 μl של מגיב לשל תא / תערובת תקשורת 100 μl ולנער תוכן למשך 30 דקות כדי לגרום תמוגה תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא הארה עם luminometer מוגדר חשיפה של .1-1.0 גל שניות וזיהוי של 560 ננומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרכובות מבחן (תרכובותשל ריבית) לassay צלחות (יום 0). הפוך דילול 1: 4 סדרתי של תרכובות בDMSO ב200x ריכוז סופי עבור הסכום כולל של 10 ריכוזים (9 דילולים המכילים תרכובת וDMSO אחד בלבד, צלחת מתחם). כנקודת התחלה ראשונית, לשאוף למינון הנמוך ביותר של 0.03 200x מיקרומטר ומנה עליונה של 2,000 מיקרומטר (μl נפח 200 סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרכובות בדילול סדרתי עד בינוני להפוך תערובת מתחם-בינוני ב10x ריכוז סופי (נפח 100 μl הסופי, צלחת ביניים). אחסן את צלחת המתחם ב -20 ° C לשימוש ביום 3 של assay. הוסף 10 μl של תערובת מתחם-בינוני לתאים בtriplicates כך שהמינון הגבוה ביותר הוא 10 מיקרומטר (למשל., שורות B, C ו- D, יום 0) (איור 1). דגירה צלחות assay במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. בטל צלחת ביניים (ים) לאחר שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להכין תערובת מתחם בינוני 1x 400 μl באמצעות צלחות המתחם ערוכים 1.4. הפוך צלחות assay כדי להסיר תקשורת וללטף יבשים ברכבמגבות נייר claved 2-3x כדי להסיר תקשורת שיורית. להוסיף מתחם / תקשורת (100 μl / טוב) לבארות מוצלות בכחול ולהוסיף מדיה 100 μl להיקף בארות כדי למנוע אידוי (איור 1). Re-דגירה צלחות assay על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6, להעריך מספר יחסי של תאי קיימא על ידי ביצוע קריאת הארה כמתואר בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקריאת יום 0 להעריך את טבע סטטי / הרעיל של תרכובות. סוכנים רעילים לגרום אפופטוזיס ואילו סוכני cytostatic לגרום עצירת מחזור התא. אם המתחם הוא רעיל (יום 6 קריאה מתחת יום 0 קריאה), לשקול בחירת GI 50, וGI 50 x 5 ריכוזים עבור מבחני עמידות. עם זאת, אם המתחם גורם קיפאון (שווה או גבוה מקריאת D0), לשקול GI 100 ועבור מבחני עמידות GI X5 100 (איור 2). </li></ol> 2. הגדרת מבחני עמידות לתרופות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שנינות עובדתחה סוכן cytostatic, תאי זרע במפגש של 30-40% ב150 מ&quot;מ 2 מנות בתרבית רקמה (נפח = 30 מיליליטר) עבור assay ההתנגדות. אם עובד עם סוכן רעיל, זרע במפגש 70-80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורות תאים שנמל מנגנון תיקון אי התאמה (MMR) ללא פגע, דגירה תאים מצעד 2.1 O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם סרטן N-אתיל-N-nitrosourea (ENU). פנק את התאים עם 30 μl של פתרון מניות של 50 מ&quot;ג / מיליליטר ENU (50 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) כדי לשפר את חוסר יציבות גנומית. לתא קווים שיש לי פגום MMR (לוחות 2 ו -3), הטיפול בENU או חומרים מסרטנים אחרים ייתכן שיהיה צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורות תאים אחרות, לקבוע MMR-מחסור בקריטריוני NCI באמצעות חוסר יציבות microsatellite 12, או המבוסס על האפיון שפורסם באמצעות מבחני חוסר יציבות microsatellite או פרופיל הגנומי / epigenomic של גני MMR 13-15. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פינוק עם מתחם המבחן (ים) שלריבית בריכוז שנקבעה בשלב 1.8. לתרכובות רעילות ביותר הגורמים למוות של תאים בכדאיות assay שלושה ימים טיפוסי 10, להתחיל עם טיפול במינון נמוך (כלומר, במערכת העיכול 50) ואופן הדרגתי להגדיל את הריכוז (כפולות של GI 50) של מתחם כל 2-3 שבועות עד חזק התנגדות הוא ציין. לחדש תקשורת ומתחם כל 3 ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהבחירה כבר יזמה, תקשורת / מתחם שינוי לערבב כל 3-4 ימים עד שיבוטים עמידים לצוץ. התנגדות על ידי הגדרה עולה כאשר תאים שטופלו להראות גדולה יותר צמיחה / כדאיות בטיפול תרופתי בהשוואה לטיפול אקוטי של תאי שליטה טופל DMSO. </li></ol> 3. בידוד שיבוטים תא בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחת תרבות באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד (הגדלה 40x) לאשכולות קיימא של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוטים משביע רצון מארק בתחתית הצלחת עם עט סימון. בחר שיבוטים שהם בגודל ממוצע (מושבות גדולות יותר עשוימקורן תאים מרובים) ומבודד היטב ממושבות אחרות. בחר שיבוטים באמצעות אחת משתי גישות שתוארו בשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישת 1: באמצעות pipettor (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת צמיחה ולשטוף עם PBS 1x כדי להסיר את כל תאים צפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בסימנים שחורים כמדריך לשיבוטים &quot;לקטוף&quot; עם קצה pipet (מצורף לpipettor, p200 רצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שיבוטים לתוך צלחות 48-היטב עם תקשורת טרי 200 μl (עם ריכוז מתחם המחצית לאפשר התאוששות אופטימלית של תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים להתאושש במשך 2-3 ימים לפני הוספת 200 μl תקשורת טרי / ריכוז מתחם אידיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך להשתנות תקשורת / מתחם כל 3-4 ימים וימשיך להרחיב את השיבוטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה 2: שימוש בשיבוט דיסקים (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן שיבוטים כמתואר בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 דיסקי מ&quot;מ שיבוט בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה לא 5 מיליליטר של 0.25%rypsin-EDTA למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מצלחת המכילה שיבוטים עמידים וכיסוי שיבוטים עם דיסקי שיבוט טריפסין ספוגים באמצעות מלקחיים חד פעמי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר במשך 1-2 דקות, תלוי כמה בקלות שיבוטים להרים את הצלחות, בחממה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים דיסקי שיבוט באמצעות מלקחיים סטרילי ולהעביר לתוך צלחות 48-היטב עם תקשורת 200 μl טרי וחצי ריכוז של מתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה בעדינות כדי לסלק את התאים מדיסקי שיבוט דגירה O / N ב 37 ° C (להשאיר שיבוט דיסקים בבארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את דיסקי שיבוט מצלחות 48-היטב ולחדש בארות עם 200 μl תקשורת / מתחם טרי (ריכוז מתחם מחצית אידיאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר מכן, לחדש תקשורת עם הריכוז האידיאלי של מתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לשנות את התקשורת / המתחם כל 3-4 ימים וימשיכו להרחיב את השיבוטים. </li></ol></li></ol> 4. הערכת התואר של Resistance של שיבוטים מבודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע 10-20 מושבות מורחבות, ליצור GI 50 עקומות כמתואר בשלב 1 כדי להעריך את מידת ההתנגדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד כולל אוכלוסיות שליטה טופלו בDMSO בתהליך הבחירה. סביר מאוד להניח שהספקטרום של התנגדות הולך להיות גדול (כמה מראים חלקי ואילו אחרים מראים התנגדות מלאה). לאסוף כמה שיבוטים מכל אחד מהשיעורים האלה כמנגנון של התנגדות עשויה להשתנות בין שתי הקבוצות. </li></ol> רצף 5. הדור הבא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה 2 מיליון תאים (שליטה ושיבוטים עמידים) (XG 500 במשך 5 דקות) בבקבוקוני 15 מיליליטר חרוטי עבור שני gDNA ואוסף RNA (ולכן 2 x 2 מ&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם 1x PBS ולהקפיא כדורים ב-80 ° C עד מוכן לבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת חילוץ מסחרית לבודד RNA או gDNA פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח דגימות עבור סידור הדור הבאתוך שימוש בפרוטוקול של הספק 10. </li></ol> 6. ביואינפורמטיקה ניתוח של דגימות (רצף כל-exome) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preprocess רצף נתונים לפי DNA-seq צינור תרגול הטוב ביותר 16. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפה כל קורא להתייחסות GRCh37 הגנום האנושי באמצעות BWA 17. המרת יישור SAM מעוצב דחוס לפורמט BAM הדחוס עם Samtools 18. יישור מיין לפי לתאם עם Samtools. להוסיף קבוצות קריאה באמצעות פיקארד. (לBWA הספציפי, Samtools ופיקארד פקודות, ראה טקסט משלים 1, קווי 1-4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את כל הכפילויות קורא באמצעות MarkDuplicates פקודה מכלי פיקארד להגדיר 19. מדד בקובץ זה עם Samtools. (טקסט משלים 1, קווי 5-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער את הבסיסים תואמים בכל קורא, ליישר מחדש קוראים באופן מקומי באזורי מחסה הוספות או מחיקות קטנות באמצעות realigner indel 20. (טקסט משלים 1, קווי 7-8) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את accurac נוסףy של קורא גרסה, ציוני איכות בסיס אמפירי לכייל מחדש באמצעות כלי כיול ציון איכות בסיס. כלי כיול איכות הבסיס צריך לא רק ציון איכות ראשונית נכון, אלא גם לקחת בחשבון השתנות המשותף של מספר תכונות, כוללים קבוצה לקרוא, מחזור מכונה, עמדת בסיס, והקשר dinucleotide (בסיסים הנוכחיים קודמים +). צור BAM recalibrated עם PrintReads פיקארד. (לפקודות ספציפיות לצעד זה, ראה טקסט משלים 1, קווי 9-10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים 6.1.1 באמצעות 6.1.4 (טקסט משלים 1, קווים 1-10) עבור כל דגימת רצף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות וריאציה אחת נוקלאוטיד (SNV) בכל שיבוט באמצעות גרסה לזווג קוראת tool19, 21-23. לכל שיבוט רצף, לרוץ גרסה לזווג קוראת באמצעות שיבוט ההורים כמתאים &quot;נורמלי&quot;. (טקסט משלים 1, קו 11) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן חוזרות, גרסאות באיכות גבוהה ולהתכונן לביאור עם כלי ביאור גרסה 24. Deprioritize variants לא משותף לכל השיבוטים העמידים. (ראה תסריט R בטקסט משלים 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסמן גרסאות עם כלי ביאור 25, 26. יש לי כלים ביאור גרסה רבים יישום אינטרנט נלווה המאפשר לנתונים יועלו ועובדו על שרת מרוחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי חיזוי השפעה תפקודית 27-29 לתעדף אלה גרסאות חזו שיש השפעה תפקודית גבוהה. כמו ביאור גרסה, מספר כלים זמינים לחיזוי השפעה תפקודי באמצעות ממשק אינטרנט. </li></ol>

<ol>
	<li>Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blueprint+for+advancing+genetics-based+cancer+therapy.">A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy.</a> Cell. 147 (1), 26-31 (2011).</li><li>Housman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+in+cancer:+an+overview.">Drug resistance in cancer: an overview.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).</li><li>Balbas, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+mutation-based+resistance+to+antiandrogens+with+rational+drug+design.">Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.</a> Elife. 2, e00499 (2013).</li><li>Joseph, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+androgen+receptor+mutation+confers+resistance+to+second-generation+antiandrogens+enzalutamide+and+ARN-509.">A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509.</a> Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).</li><li>Korpal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+F876L+mutation+in+androgen+receptor+confers+genetic+and+phenotypic+resistance+to+MDV3100+(enzalutamide).">An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide).</a> Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li><li>Whittaker, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNA+interference+screen+implicates+NF1+loss+in+resistance+to+RAF+inhibition.">A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition.</a> Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).</li><li>Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptome+sequencing+to+identify+mechanisms+of+drug+action+and+resistance.">Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance.</a> Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).</li><li>Adams, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+Is+the+Cellular+Target+of+STF-31-Like+Small-Molecule+Probes.">NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).</li><li>Bhang, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+clonal+dynamics+in+response+to+cancer+therapy+using+high-complexity+barcoding.">Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding.</a> Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).</li><li>Boland, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+National+Cancer+Institute+Workshop+on+Microsatellite+Instability+for+cancer+detection+and+familial+predisposition:+development+of+international+criteria+for+the+determination+of+microsatellite+instability+in+colorectal+cancer.">A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).</li><li>Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+instability+in+colorectal+adenocarcinoma+cell+lines+that+have+full-length+adenomatous+polyposis+coli+protein.">Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein.</a> Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).</li><li>Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+extent+of+microsatellite+instability+in+human+cell+lines+with+defects+in+different+mismatch+repair+genes.">Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes.</a> Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).</li><li>Ahmed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+and+genetic+features+of+24+colon+cancer+cell+lines.">Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines.</a> Oncogenesis. 2, e71 (2013).</li><li>. GATK Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/gatk/guide">https://www.broadinstitute.org/gatk/guide</a> (2015)</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).</li><li>Cibulskis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+somatic+point+mutations+in+impure+and+heterogeneous+cancer+samples.">Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).</li><li>Larson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SomaticSniper:+identification+of+somatic+point+mutations+in+whole+genome+sequencing+data.">SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VarScan+2:+somatic+mutation+and+copy+number+alteration+discovery+in+cancer+by+exome+sequencing.">VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing.</a> Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).</li><li>. Oncotator Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/oncotator">https://www.broadinstitute.org/oncotator</a> (2015)</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).</li><li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms,+SnpEff:+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118;+iso-2;+iso-3.">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly. 6 (2), 80-92 (2012).</li><li>Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+functional+impact+of+protein+mutations:+application+to+cancer+genomics.">Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li><li>Ng, P. C., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIFT:+Predicting+amino+acid+changes+that+affect+protein+function.">SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).</li><li>Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effect+of+human+missense+mutations+using+PolyPhen-2.">Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2.</a> Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Abaan, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exomes+of+the+NCI-60+panel:+a+genomic+resource+for+cancer+biology+and+systems+pharmacology.">The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology.</a> Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).</li><li>Forbes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmic+2005.">Cosmic 2005.</a> Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).</li><li>Shah, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+and+mutational+evolution+spectrum+of+primary+triple-negative+breast+cancers.">The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers.</a> Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+PTPRB+and+PLCG1+mutations+in+angiosarcoma.">Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).</li><li>de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DNA+mismatch+repair:+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance.">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li><li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells.">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li><li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase.">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li><li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

עמלות פרסום לכתבה זו משולמות על ידי H3 ביו-רפואה.

<html> בחירה של קו תא (ים): אפיון של מדינה גנטית וחוסר יציבות גנומית אין ספק, הגורם היחיד הקריטי ביותר בחשיפה בהצלחה קלינית מנגנוני התנגדות רלוונטיים היא בחירת קו התא הראשונית. שני גורמים צריכים להיחשב. ראשית, מטרה לבחור קו תא (ים) של אותו השושלת / תת סוג חסת התכונות גנטיות ההגדרה של המחלה (למשל., BRAF V600E מלנומה). חקירה של נתונים transcriptomic ומוטציה זמינים בפומבי לשתי שורות תאי 30-32 וגידולים ראשוניים / גרורות למגוון אינדיקציות 33,34 תקל על תהליך הבחירה. למרות זיהוי של שורות תאים עם שינויים גנטיים רלוונטיים מבחינה קלינית הוא אידיאלי, במקרים מסוימים זה עשוי להיות לא אפשרי בגלל חוסר שורות תאים זמינים או אפשרי בשל גורמים כמו קושי ואורכו של תהליך המיון. &gt; בנוגע לנקודה האמורה, גורם שני הוא לשקול לאחר מכן במהלך בחירת שורת תאים הוא הקלות או הכדאיות של התנגדות הקרנה באמצעות הקו הרצוי. לדוגמא, גורמים כגון הפצה ושיעורי מוטציה פנימיות יכולים להשפיע במידה רבה על המהירות של גילוי. לשם כך, יכולות להיות מנוצלת שורות תאים עם קינטיקה מהירה צמיחה וחסרה מנגנוני DNA MMR בתקווה שהופעתה של התנגדות ספונטנית יכולה להיות מואצת 35. בהתבסס על המאגר קוסמי, כמה שורות תאי מועמד קיימות עם מחסור באחד משני הגנים שעברו מוטציה לעתים קרובות MMR, MSH2 או MLH1 (לוחות 2 ו -3). לחלופין, אם שורות תאים של עניין לא קיימות פגמים נושאים בMMR, טיפול אקוטי עם מוטציות כימיות פיזיות או DNA תגובתי כגון סוכן אלקילציה -nitrosourea N -ethyl- N (ENU) יכול לשמש כדי לשפר חוסר יציבות גנומית. למרות ששני הגישות רשאית זה באופן משמעותיHorten הזמן להשיג שיבוטים עמידים ומעקב רצף, בדיקות פונקציונליות מחמירות צריכה להתבצע על גני מועמדים כמספר גדול יותר של אי-פונקציונלי, מוטציות נוסעים צפויות לצאת. SNVs יכול להיות דרגת הורה למקסם את הסיכויים לזיהוי מוטציות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראשית, בחירה אלה מוטציות שחוזרות על עצמם בשיבוטים עצמאיים תגדיל את סבירות מוטציות אלה הן נהגים של התנגדות. במקרה מוטציות חוזרות ונשנות אינן מזוהות, תוך התמקדות בSNVs שמתאים את מנגנון פעולה של התרופה (לדוגמא, יעד הסמים או מפעיל במורד הזרם ידוע של יעד התרופה) עשוי להיות משמעותי. סופו של דבר, את תקן הזהב הוא תמיד הערכה ניסיונית של פעילות התנגדות-הענקת SNVs המועמד על ידי ביטוי cDNA חוץ רחמי בתאי הורים תרופה רגישה. ה- DNA לעומת רצף RNA שיבוטים פעם עמידים כבר נוצרו, DNA ו / או RNAיכול להיות רצף בהתאם לצורך. רצפי DNA, או exome או רצף הגנום, יאפשר זיהוי של גרסאות germline וגופניים, כגון SNPs, indels ולהעתיק מספר הגרסאות. בעוד רצף exome עלות ידידותית יותר מתמקד ביצירת קוראת מאזורי קידוד ידועים, רצף הגנום יפיק נתונים רצף לכל הגנום אשר עשוי להקל על זיהוי של מוטציות באלמנטי קידוד שאינו כגון משפרי או miRNAs 36. עם זאת, מאז נתונים ביטוי גנים לא תעיד ברצפי DNA, שקשה לחזות שמוטציה (ים) עשוי להיות נהג פונקציונלי. בהקשר זה, הרצף של RNA, אם כי יקר יותר, מציע את היתרון הזה. העובדה שייעוד המוטציה מתבצע רק על מיני RNA מתבטאים משפרת את הסיכוי שהמוטציה של עניין עשויה להיות נהג פונקציונלי. בנוסף מאפשר סקר ממוקד יותר של מוטציות לבדיקה פונקציונלית מעקב, רצף RNA גםמציע יתרון הנוסף של להיות מסוגל לזהות שינויים גנטיים ביטוי, שחבור חלופי ומיני RNA chimeric רומן, כולל שילובי גן שעשוי לשמש גם נהגים חזקים כמו של התנגדות. צינור ביואינפורמטיקה פקודות דוגמא מסופקות להמחשה, אבל תיעוד והדרכות מפורטים יותר זמינים מהרחב מכון 16 ויש לקרוא ביסודיות לפני תחילת ניתוח NGS. הפקודות הבאות מיועדות לסביבת UNIX פגז במערכת שבה כל הכלים ומידע התייחסות הותקנו מראש. פקודות אלה גם להניח קבצי FASTQ רצף לזווג-הסוף המכיל קורא משתי דגימות, בשם &quot;הורים&quot; ו- &quot;עמיד&quot;, כבר קיבל מהספק והניח בספרייה &quot;נתונים&quot;. ברוב המקרים צריכים להיות מותאמות בפקודות אלה או מותאמים ליישום ספציפי באמצעות arg נוסף של שורת הפקודהuments (למשל, הוספה &quot;-t 8&quot; לפקודת BWA מאפשרת פעולה מרובה על פני 8 ליבות מעבד). קבוצות קראו (שלהקצות מערכים לדגימות ביולוגיות), חייבות לעתים קרובות ניתן להוסיף לקבצי BAM גם אם יש דגימה אחת בלבד לכל קובץ BAM, על מנת לעמוד בדרישות פורמט קובץ לכלים מסוימים. קראו פרמטרים קבוצת RGID, RGSM, RGPL, RGPU, וRGLB יכול להיות מחרוזות שרירותיות המתארות את שם המדגם, פלטפורמת רצף, ואסטרטגיה ספרייה. במבחנה לעומת מבחני in vivo למרות שכמה מנגנוני התנגדות זוהו על ידי בחירה במבחנה אומתו להיות רלוונטי מבחינה קלינית, קיים אפשרות שהמנגנונים לא יכולים לשמש מנגנונים רלוונטיים או דומיננטיים כמו של התנגדות קלינית. אחת סיבות לכך עשויות לכלול תפקיד חיוני למייקרו-הסביבה בנהיגת התנגדות לטיפול, רכיב שהוא נטול בניסוי הפרוטוקול / ההתקנה דiscussed עד כה. ואכן, מספר מחקרים הראו כי חומרים אנטי-סרטניים שמסוגלים להרוג תאי גידול כבלתי יעילים כאשר התאים הסרטניים בתרבית בנוכחות של תאי סטרומה רומזים מנגנונים מולדים של התנגדות שמעניק סטרומה 37,38. לזהות מנגנונים מושרה סטרומה כגון רכשו התנגדות, ניתן לשקול ביצוע שיתוף תרבות במבחנה או במבחני עמידות גידול vivo. מאז assay לשעבר הוא די מורכב, רבים נקטו יצירת xenografts גידול עמידה לתרופות לטיפול בתפקיד הפוטנציאלי של סטרומה בנהיגת התנגדות. מחקרים כאלה חשפו 5 וייחודיים 39 שני מנגנונים הזהים של התנגדות ביחס לבחירה במבחנה, רומזים כי סטרומה אכן עשויה לשחק תפקיד באחרון. עם זאת, יש להיות מודע לאורכו של זמן זה עלול לקחת כדי ליצור גידולים עמידים כגון ואת המורכבות של הניתוח-complexitie הגנומי המעקבים בשל ההטרוגניות המולקולרית ותאית תוך ממאירות. זיהוי יעד בנוסף לחשיפת מנגנוני עמידות לתרופה, גישת פרופיל הגנומי מבוסס NGS זה יכול להיות מיושמת גם כדי לזהות מטרות סלולריות של בדיקות כימיות. מבחינה הסטורית, שיטות משוחדת מרובות כבר משמשות לזיהוי המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של כימיקלים במשקל מולקולריים נמוכים עם פעילות ביולוגית, כוללים טיהור זיקה בשילוב עם פרוטאומיקה כמותית, שיטות הגנומי שמרים, הקרנת RNAi, ומסקנה חישובית גישות 40. כהרחבה להבהרת מנגנוני סמים התנגדות באמצעות פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS של אוכלוסיות תאי phenotypically עמידות, זיהוי של וריאציות ייחודיות חוזרות אחת נוקלאוטיד (SNVs) או שינויי ביטוי המאפשרים התנגדות יכולה להציע תובנות יעדים סלולריים פונקציונליים של תרכובות. Tשלו מבוסס על הרעיון שקבוצת משנה של מנגנוני התנגדות נצפו עשויה להיות כרוך מוטציות חוזרות ונשנות בגנים המקודדים את חלבון היעדים הישירים של המולקולה הקטנה. לאחרונה, כמה דיווחי תוקף השירות של הגישה, במיוחד על ידי שילוב עם גישות אחרות, כוללים פרופיל רגישות שורת תאי הסרטן בקנה מידה גדולה, לחשיפת היעדים הסלולריים של מולקולה קטנה בוחן 9,10.

אפיון מולקולרי מפורט של הגנום גידול על ידי טכנולוגיות רצף חזקות וכלים אנליטיים נתונים משופרים הוביל לגילוי של שינויים גנטיים מרכזיים בסוגי הסרטן ספציפיים 1,2. פיתוח של טיפולים ממוקדים במטרה הנגעים הגנטיים הללו, כגון HER2, BCR-ABL, EGFR וALK, השתפר באופן משמעותי באיכות חיים של חולי 1,2. עם זאת, למרות ייחודה של גישה זו, התגובה הקלינית לטיפולים בודדים ביותר הייתה תת-אופטימלית כהתנגדות סופו של דבר מתגלה. לאחרונה, התקדמות משמעותית נעשתה בהבנת היסודות המולקולריים של התנגדות לתרופות ממוקדות. מעניין לציין, שזה הופך להיות ברור כי מנגנון בולט של התנגדות כרוכה פעילות היעד / מסלול מתמשך. כדוגמה לכך, קולטן האנדרוגן (AR) -directed טיפול enzalutamide של סרטן הערמונית גורם להעשרת הפעלת מוטציות בAR עצמו, שמירה על outp איתות-ARut בנוכחות המעכב 3-5. ידע זה הוביל לקמפיין אגרסיווי ל1) לפתח יריבים דור שלישיים שיכול להמשיך לדכא שני WT ותפקוד המוטציה-AR בenzalutamide עמיד PCA 3 ו -2) לזהות צמתים במורד הזרם פוטנציאליים של איתות AR שעשוי להיות ממוקד להתערבות טיפולית . באופן דומה, התנגדות לסוגים אחרים של מעכבים כגון אלה מיקוד EGFR, BRAF וABL לעתים קרובות להוביל למוטציות שמחדש את מסלול קינאז ממכר המקורי 1. בידיעה שההתנגדות עולה באופן בלתי נמנע ברוב החולים, פיתוח גישות להביא זריזות מנגנונים אלה לאור יאפשר פיתוח של טיפולי מעקב יעילים. גישה אחת שנמצא בשימוש נרחב היא לנתח את הגנומיקה של גידולים עקשן קליניים ביחס לגידולי טיפול-נאיבי או -sensitive לזהות מוספים / depletions בנגעים גנטיים שעשויה להיות נוח לדגילוי שטיח. למרות הבטחתה, יש שתי התחייבויות עיקריות של גישה זו שתפגענה בגילוי מהיר. ראשית, לקבל גישה לחומר בזמן גידול לחקירה הגנומי עשויה לשמש כמכשול משמעותי במעבר מטיפול כדי לרפא. שנית, deconvolution של מספר עצום של נגעים גנטיים בהגדרה עמידה עשוי להיות מאתגר מאז גידולים יכולים להציג ההטרוגניות התוך ממאירות משמעותית 6,7. לאור אתגרים אלה, יש כבר עלה הסתמכות על גילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות. גישה זו עשויה לאפשר זיהוי של מנגנוני התנגדות בולטים לפני הניסויים הקליניים שעשויות להנחות 1 אסטרטגיות חלופיות לניהול קליני בחולים שנושאים מנגנונים אלה גם לפני טיפול או בעקבות תחילתה של התנגדות. כלי אחד כזה פרה-קליני גילוי שנמצא בשימוש נרחב הוא להחיל מסכי RNAi פונקציונליים משוחד. לבחינהple, ויטאקר ועמיתים מיושמים מסך RNAi הגנום בקנה מידה לזהות כי אובדן NF1 מתווך התנגדות למעכבי RAF וMEK באמצעות הפעלת מסלול MAPK ספג 8. ממצאים אלה נמצאו להיות רלוונטיים מבחינה קלינית כמוטציות פסד של הפונקציה בNF1 נצפו בתאי גידול -mutant BRAF שמהותו עמידים לעיכוב חיל האוויר המלכותי ובגידולים מלנומה עמידים לvemurafenib הפעלה 8. עם זאת, למרות הצלחתה של גישה זו, מטרות רלוונטיות מבחינה קלינית רבות לעתים קרובות אינה מזוהות, ככל הנראה בשל ההטיה הפסד של פונקציה של גישה זו. לעומת זאת, כלי פחות מוטה לגילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות כרוך הדור של שורות תאים עמידות בחשיפה ממושכת למתחם של עניין בשילוב עם פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS. גישה זו יושמה בהצלחה על ידי מספר קבוצות לזהות ספונטנישינויים חוזרים ונשנים אחת גרסאות נוקלאוטיד או ביטוי שיאפשר התנגדות 5,9,10. לדוגמא, מוטציה F876L חוזרת בAR התגלתה לאחרונה בשיבוטים עמידים במבחנה 3-5 ובגידולי xenograft in vivo 5 לפני זיהוי מוטציה זו במרפאת 4. ממש לאחרונה, באנג ועמיתיו (2015) 11 משמשים ClonTracer בשני דגמים רלוונטיים קליני להראות כי רוב השיבוטים עמידים המתעוררים במהלך חשיפה לסמים ממושכת היו חלק מתת-אוכלוסייה מראש קיימים מצביעה על כך שרוב רלוונטי תפקודי מוטציות הם כנראה כבר קיים מראש שהופך נבחר לבמהלך בחירה 11. בניגוד לפרופיל הגנטי של גידולים שנאמרו קודם לכן, יתרונות גישה זו מפחות ההטרוגניות כשיבוטים &quot;הומוגנית&quot; עמידים המשמשים לניתוח להקל נתיחה גנטית מדויקת יותר של פוטנציאל נהגים. Furthermבצר, מרגש, בנוסף לפוטנציאל לחשיפת מנגנונים של התנגדות, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לזהות את המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של מולקולות קטנות ביו שמידע זה הוא 10 לא ידוע. בהתחשב ביתרונות ברורים ושימושים רבים של גישה זו, כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט את היישום מוצלח של מסך כזה פרה-קליני למקסם את הפוטנציאל לתגליות משמעותיות קליני.

<table><tbody><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86&amp;nbsp;</td><td>Expanding clones</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-588</td><td>Generating GI&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; curves</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Viability testing</td></tr><tr><td>Cloning discs (3 mm)</td><td>Sigma</td><td>Z374431</td><td>Picking clones</td></tr><tr><td>Sterile forceps</td><td>Unomedical</td><td>DF8088S</td><td>Picking clones</td></tr><tr><td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Isolating RNA</td></tr><tr><td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td>Isolating gDNA</td></tr><tr><td>GATK</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Indel realigner</td></tr><tr><td>MuTect</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Paired variant calling tool</td></tr><tr><td>Oncotator</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Variant annotation tool</td></tr><tr><td>MutationAccessor</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Functional impact prediction tool</td></tr></tbody></table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

למקסם את הפוטנציאל לגילוי נהגים פונקציונליים מפתח של התנגדות, בחר שיבוטים תא בודדים להרחבה, בדיקה פנוטיפי ורצף. כפי שמודגם באיור 4 א, ​​תאי HCT116 טופלו במשך תקופה ממושכת עם המתחם ציטוטוקסיות # 1 הוביל להופעה הספונטנית של שיבוטים עמידים שהמשיכה לגדול במהלך הטיפול (עיגולים שחורים מקווקוים). שיבוטים אלה נאספו באמצעות # גישת 1 מודגש באיור 3 ולאחר מכן התרחב לניתוח פנוטיפי. כפי שניתן לראות באיור 4, שיבוטים עמידים 1-3 כל הראו התנגדות משמעותית למתחם המס &#39;1 ו# מתחם אנלוגי קרוב 2 (הכדאיות / צמיחה גדולה יותר) שלה, ואילו כל השיבוטים הראו רגישות להוולקייד מתחם ציטוטוקסיות שאינו קשור. בעקבות אישור של התנגדות פנוטיפי, gDNA היה מבודד והוגש לניתוח רצפים כל-exome. הכלים ביואינפורמטיקה יושמו כדי לצמצם בגרסות המבניות אלה שהם) חוזרים 1 ו -2) יש פוטנציאל להשפעה תפקודית (איור 5 א). גרסאות מבניות שפגשו שני קריטריונים אלה אושרו על ידי כלי רצף עצמאי. כפי שמודגם באיור 5, מוטציה missense הטרוזיגוטיים שזוהתה באמצעות רצף כל-exome אושר בשיטת סנגר הרצף (פנל עליון, רצף WT; פנל תחתון, רצף מוטציה). בעקבות אישור רצף, קו תא ההורים שימש במקור עבור assay ההתנגדות היה מהונדס גנטי לבטא cDNA המוטציה כדי לאשר את התפקיד של המוטציה תפקודית. כפי שמודגם באיור 6, ואילו ביטוי יתר של cDNA WT לא הצליח להקנות עמידות, נאלץ ביטוי של התנגדות פנוטיפי העניק באופן משמעותי את cDNA המוטציה למתחם מס &#39;1, המאשר את התפקיד הפונקציונלי של וריאציה מבנית זו כנהג של התנגדות. כל חומרים כימיים המשמשים לצורך הניסוי הזה מפורטים בטבלה 1 </s<html> טרונג&gt;. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> איור 1. פריסה של צלחות assay ושליטה. צל כחול, בארות טיפול מתחם. צל לבן, בינוני בלבד. תרכובות בדילול סדרתי 1: 4 ומנוהלות בtriplicates (BD או EG). 2 תרכובות יכולות להיות מיושמות לכל צלחת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> איור 2. עקומות כדאיות נציג. קו מקווקו אדום מייצג את היום 0 קריאה. ציר X מציין הגדלת מינון של מתחם לימין וציר y מייצג כדאיות היחסית לבארות שליטת DMSO. GI 100 = מינון שניתן להשגה 100% עיכוב צמיחה; GI 50 = מנה משמשת להפחתת כדאיות 50% משליטת DMSO. <html> _upload / 52,879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. שתי גישות לקטיף שיבוטים עמידים להרחבה. גישת pipettor 1 השימוש להרים ולהעביר שיבוטים מוגדרים היטב לצלחות 48-היטב. 2 שימוש בגישה טריפסין ספוג דיסקי שיבוט להרים שיבוטים ולהעביר לצלחות 48-היטב. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> אישור איור 4. ההתנגדות השיגה עבור שיבוטים HCT116 למתחם המס &#39;1 במבחנה. # מתחם () השיבוטים HCT116 1 עמיד יצאו בעקבות בחירתה של שלושת שבועות רצופים. הכדאיות (B) של שיבוטים שליטה ועמידים נבדקה לאחר טיפול 72 שעות בתרכובות שונות. מתחם המס &#39;2 הוא אנלוגי קרובה של מתחם מס&#39; 1. הוולקייד שימש כסוכן ציטוטוקסיות שליטה. הנתונים מוצגים כסטיית תקן הממוצע של שלושה + משכפל ביולוגי. EP-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig5.jpg" /> זיהוי איור 5. של מוטציה ייחודית, חוזרת ונשנית (גרסאות נוקלאוטיד הבודד, SNVs) בגן בשיבוטי HCT116 1 עמידים # מתחם. זרימת עבודה () לזהות SNVs נוכח בכל השיבוטים העמידים וצפויה להיות השפעה תפקודית גבוהה על ידי MutationAssessor. אישור (ב) למוטציה בגן על ידי סנגר רצף. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> איור 6. מחדש ביטוי של התנגדות מוטציה העניקה גן למתחם מס &#39;1 במבחנה. הכדאיות של שורות תאים המהונדסים HCT116 נבדקה לאחר טיפול 72 שעות במתחם המס&#39; 1. HCT116-WT או שורות תאי מוטציה ביציבות להביע WT או cDNAs מוטציה של גן, בהתאמה. הנתונים מוצגים כo סטייה ממוצעת + סטנדרטיתו שלושה משכפל ביולוגי. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם לדוגמא </td><td> חומצת אמינו </td><td colspan="2"> רקמות עיקריות </td><td> זיגוסיות </td></tr><tr><td> C-33- </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> צוואר רחם </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> C-33- </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> צוואר רחם </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> עוֹר </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> חָזֶה </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> בלוטת הערמונית </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> נשירה-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SKUT-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> רירית הרחם </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SKUT-1B </td><td> PL787fs * 11 </td><td colspan="2"> רירית הרחם </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr></tbody></table> שורות תאי -mutated הטבלה 1. MSH2. שורת תאים (שם דוגמא), החלפת חומצת אמינו, שושלת היוחסין של מוצא וזיגוסיות מצוינות. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם לדוגמא </td><td> חומצת אמינו </td><td colspan="2"> רקמות עיקריות </td><td> זיגוסיות </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> עמ &#39;.? </td&gt; <td colspan="2"> בלוטת הערמונית </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> בֶּטֶן </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> PR-מל </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> עוֹר </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> ר&#39; </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SNU-1,544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SNU-1,746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> לַבלָב </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> לַבלָב </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> לַבלָב </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr></tbody></table> שורות תאי -mutated הטבלה 2. MLH1. שורת תאים (שם דוגמא), החלפת חומצת אמינו, שושלת היוחסין של מוצא וזיגוסיות מצוינות.

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms at JoVE.com

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

implementation-vitro-drug-resistance-assays-maximizing-potential-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.5K Views.  H3 Biomedicine.  עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גיל...

Video: Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to overcome this challenge. Here, a 2-step dose-escalation method for establishing dual-resistance to an epidermal growth factor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI), gefitinib, and a MET-TKI, PHA665752, is described. This method is based on simple stepwise dose-escalation of inhibitors for inducing acquired resistance in cell lines. The alternate method for generating resistant sublines involves exposing the cells to high concentrations of the inhibitor in one step. The stepwise dose-escalation method has a higher possibility of successfully inducing acquired resistance than this method. Activating EGFR mutations are biomarkers of a response to treatment with EGFR-TKI, which is an applied first-line treatment for non-small cell lung cancers (NSCLC) that harbor these mutations. However, despite reports of effective responses, the use of EGFR-TKI is limited because tumors inevitably acquire resistance. The major mechanisms behind EGFR-TKI resistance include a secondary mutation at the gatekeeper site, T790M in exon 20 of EGFR, and a bypass signal of MET. Thus, a potential solution for this issue would be a combination of EGFR-TKI and MET-TKI. This combined treatment has been shown to be effective in an in vitro study model. Acquired gefitinib-resistance was established through MET-amplification by stepwise dose-escalation of gefitinib for 12 months, and a cell line named PC-9MET1000 was generated in a previous study. To further investigate the mechanisms of acquired MET-TKI and EGFR-TKI resistance, a MET-TKI, PHA665752, was administered to these cells with stepwise dose-escalation in the presence of gefitinib for 12 months. This protocol has also been successfully applied for a number of combination therapies to establish acquired resistance to other inhibitor molecules.

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

An in vitro method for establishing dual resistance to an EGFR-TKI and a MET-TKI in cancer cells is described. This method is useful for developing treatments for patients with EGFR-mutations, who exhibit disease progression despite EGFR-TKI treatment with MET-amplification. It can also be modified for inhibitors targeting other molecules.

יצירת עמידות כפול EGFR-TKI ו- TKI פגש ריאות אדנוקרצינומה תאי במבחנה עם הליך דו-שלבי המינון

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

פרוטוקולים לקוטל עשבים חזקים התנגדות בדיקה במיני עשבים שונים

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

Environment

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Genetics

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable preclinical models that can accurately predict patient responses. One of the disadvantages of existing preclinical models is the inability to contextually preserve the human tumor microenvironment (TME) and accurately represent intratumoral heterogeneity, thus limiting the clinical translation of data. By contrast, by representing the culture of live fragments of human tumors, the patient-derived explant (PDE) platform allows drug responses to be examined in a three-dimensional (3D) context that mirrors the pathological and architectural features of the original tumors as closely as possible. Previous reports with PDEs have documented the ability of the platform to distinguish chemosensitive from chemoresistant tumors, and it has been shown that this segregation is predictive of patient responses to the same chemotherapies. Simultaneously, PDEs allow the opportunity to interrogate molecular, genetic, and histological features of tumors that predict drug responses, thereby identifying biomarkers for patient stratification as well as novel interventional approaches to sensitize resistant tumors. This paper reports PDE methodology in detail, from collection of patient samples through to endpoint analysis. It provides a detailed description of explant derivation and culture methods, highlighting bespoke conditions for particular tumors, where appropriate. For endpoint analysis, there is a focus on multiplexed immunofluorescence and multispectral imaging for the spatial profiling of key biomarkers within both tumoral and stromal regions. By combining these methods, it is possible to generate quantitative and qualitative drug response data that can be related to various clinicopathological parameters and thus potentially be used for biomarker identification.

This paper describes methods for the generation, drug treatment, and analysis of patient-derived explants for assessing tumor drug responses in a live, patient-relevant, preclinical model system.

גידול שמקורו במטופל explants כפלטפורמה פרה-אקלינית "חיה" לחיזוי עמידות לתרופות בחולים

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve survival in patients with acute myeloid leukemia (AML). A small fraction of leukemic cells that survive chemotherapy have a poised epigenetic state to tolerate chemotherapeutic insult. Further exposure to chemotherapy allows these drug persister cells to attain a fixed epigenetic state, which leads to altered gene expression, resulting in the proliferation of these drug-resistant populations and eventually relapse or refractory disease. Therefore, identifying epigenetic modulations that necessitate the survival of drug-resistant leukemic cells is critical. We detail a protocol to identify epigenetic modulators that mediate resistance to the nucleoside analog cytarabine (AraC) using pooled shRNA library screening in an acquired cytarabine-resistant AML cell line. The library consists of 5,485 shRNA constructs targeting 407 human epigenetic factors, which allows high-throughput epigenetic factor screening.

High-throughput RNA interference (RNAi) screening using a pool of lentiviral shRNAs can be a tool to detect therapeutically relevant synthetic lethal targets in malignancies. We provide a pooled shRNA screening approach to investigate the epigenetic effectors in acute myeloid leukemia (AML).

הקרנה משולבת של ספריית shRNA לזיהוי גורמים המווסתים פנוטיפ עמידות לתרופות

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

הטמעה של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב